高應瑞 ， 康福忠 ， 孟鐵健 ， 劉珂飛 ， 王調(diào)調(diào) ， 陳金艷 ， 孫彤

1.天津生機集團股份有限公司，天津 300384；2.天津市農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測與農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，天津 300193

丁酸梭菌（Clostridium butyricum），又名酪酸菌、酪酸梭菌和丁酸梭狀芽孢桿菌［1］，在自然界中主要存在于動物和人類消化道、糞便以及環(huán)境土壤中［2］。丁酸梭菌是人體及動物腸道的重要益生菌，能夠調(diào)節(jié)腸道微生物菌群，提高機體免疫力等，從而改善畜禽健康［3］。隨著丁酸梭菌潛在應用價值的發(fā)現(xiàn)及逐漸增長的需求，對丁酸梭菌菌株相關(guān)制品的安全性進行評估已迫在眉睫，也亟需建立益生性丁酸梭菌的鑒定標準。

近年來，菌種的安全性日益受到相關(guān)行業(yè)人員和研究者的關(guān)注，而其對抗生素的耐藥性、及產(chǎn)毒能力和致病因子的存在成為其安全性判斷的重要依據(jù)。隨著基因測序技術(shù)的不斷發(fā)展，人們對微生物菌株安全性的認識也在不斷深入?！兑嫔目茖W共識（2019年版）》中曾提出，對于新發(fā)現(xiàn)的菌株，應該通過全基因組測序?qū)ζ渖镄畔⑦M行分析與闡述，以此評估其耐藥性、致病性等特征［4］。因此，本研究從分子生物學、基因組學對丁酸梭菌的安全性進行綜合評價研究，基于基因測序技術(shù)的生物信息學分析以篩查菌種中與抗生素耐藥、毒力和致病性基因，以期探究菌種潛在的安全性風險機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種及培養(yǎng)基 本研究所用的丁酸梭菌分離自健康雞腸道，并由生機集團實驗室保存。所用的培養(yǎng)基為硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。

1.1.2 儀器與設備 AW200SG厭氧培養(yǎng)箱購自ELECTROTEK依萊泰科公司；GI80TW立式自動壓力蒸汽滅菌器購自致微（廈門）儀器有限公司；Qubit熒光定量儀購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Covaris超聲破碎儀購自蘇州貝斯派生物科技有限公司；Agilent 2100 Bioanalyzer生物分析儀購自安捷倫公司；Qubit dsDNA HS Assay Kit 500 assays試劑盒購自Thermo Fisher公司，Agencourt AMPure XP-Medium kit試劑盒購自Bechman Coulter公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基配制 蛋白胨15.0 g，酵母浸出粉5.0 g，葡萄糖5.0 g，硫乙醇酸鈉0.5 g，L-胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，氯化鈉2.5 g，加入去離子水溶解、定容至1000 mL，并調(diào)整pH為7.4（固體培養(yǎng)基另需加入瓊脂20 g），121 ℃下高壓蒸汽滅菌培養(yǎng)基20 min。L-胱氨酸鹽酸鹽用無菌0.22 μm膜過濾后，無菌加入到滅菌后的培養(yǎng)基中。

1.2.2 菌株活化與培養(yǎng) 將實驗室保存的丁酸梭菌甘油管用接種針穿刺于固體試管培養(yǎng)基上，37 ℃下培養(yǎng)18～20 h。待長出明顯菌落后接種于試管液體培養(yǎng)液中，裝液量10 mL，然后于37 ℃靜止厭氧培養(yǎng)18 h。

1.2.3 菌株DNA提取 取少量待檢菌體于無菌研磨器中，研磨成粉末狀，后將其快速刮至10 mL離心管中，加入3.5 mL裂解液緩沖液1和100 μL蛋白酶K，并加入30 μL RNaseA，反復混勻數(shù)次，37 °C水浴30 min后，再加入1.2 mL裂解緩沖液2，反復混勻，55 °C水浴反應120 min。

1.2.4 基因組DNA過柱純化 平衡Genomic-tip柱子，加入4 mL緩沖液QBT，待完全流出使用。將組織裂解好的樣本管，室溫離心10 min。將裂解后的上清液轉(zhuǎn)移至無菌5 mL離心管中，室溫離心5 min。將得到的上清溶液過Genomic-tip柱，使DNA被吸附在Genomic-tip柱吸附膜上，自然load流出柱子。加入QC wash buffer洗脫2次。用5 mL QF緩沖液洗脫吸附于膜上的DNA。用異丙醇沉淀洗脫下來的液體，反復混勻，-20 °C冰箱沉淀2 h以上。將用于沉淀的管從-20 °C拿出，離心10 min。用750 μL 75%酒精洗滌沉淀后轉(zhuǎn)移至2.0 mL離心管。繼續(xù)離心10 min，棄上清，室溫速甩30 s，晾干備用。根據(jù)DNA沉淀的大小加入適量的EB溶液于樣品管中，37 °C孵育30～60 min，直至樣品完全溶解，后放入4 °C冰箱進入核酸質(zhì)檢環(huán)節(jié)。

1.2.5 DNA測序、質(zhì)控與組裝 基于PromethION測序儀全基因組DNA文庫構(gòu)建的基本操作。取一定量基因組DNA樣品，用Pippin HT進行片段分選，篩選目的范圍內(nèi)的片段。配制反應體系，適溫反應進行DNA末端修復和缺口（nick）修復。配制接頭連接反應體系，適溫反應使DNA與接頭連接，然后對文庫進行質(zhì)檢。激活處理芯片，選擇合適孔數(shù)芯片進行上機測序。去除質(zhì)量值不合格以及含N堿基數(shù)目總和超過10%的reads；去除adapter和duplication污染，得到Clean reads。測序得到原始數(shù)據(jù)為Polymerase reads，過濾掉測序接頭及低質(zhì)量等數(shù)據(jù)最終得到可用Subreads，并以.bam格式保存（proovread）。后對Subread進行自糾正或混合糾正，得到Corrected reads?；贑orrected reads采用多種軟件分別組裝，最后選擇出最優(yōu)組裝結(jié)果。采用第二代小片段數(shù)據(jù)對其進行單堿基糾正，以得到最優(yōu)序列。對組裝結(jié)果進行序列成環(huán)判斷、基因組序列及質(zhì)粒序列區(qū)分［5-10］。

1.2.6 基因預測與注釋 采用Glimmer軟件進行組裝結(jié)果的基因預測［10-12］。將預測得到基因的氨基酸序列與相關(guān)數(shù)據(jù)庫：Gene Ontology（GO）［13-14］、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）［15］、Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）［16］、Virulence Factor Database（VFDB）進行比對，以獲取相關(guān)功能注釋數(shù)據(jù)。所有的注釋均使用Diamond軟件以及各數(shù)據(jù)庫協(xié)調(diào)判定完成。

1.2.7 耐藥基因注釋 通過與CARD和ARDB數(shù)據(jù)庫相比較，發(fā)現(xiàn)了可能導致菌株耐藥的基因。參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評價指南》要求，在序列比對時，設置序列相似性≥80%，序列覆蓋度≥70%。

1.2.8 細菌致病菌毒力因子注釋 通過與VFDB數(shù)據(jù)庫比對分析，對菌株基因組中可能存在的毒力基因進行檢測。參照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的《直接飼喂微生物和發(fā)酵制品生產(chǎn)菌株鑒定及其安全性評價指南》要求，在序列比對時，設置序列相似性≥80%，序列覆蓋度≥70%。

1.2.9 比較基因組學 對測序菌株基因組序列、參考菌株基因組序列和基因集序列數(shù)據(jù)進行對比分析，得出測序菌株與參考菌株之間的結(jié)構(gòu)差異、突變和菌株間親緣進化關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 丁酸梭菌全基因組概況

如圖1所示，獲得來自測序平臺的有效數(shù)據(jù)CleanData后進行組裝，得到最佳組裝結(jié)果，然后通過單堿基糾正、序列環(huán)狀、質(zhì)粒庫比對分析，結(jié)果顯示丁酸梭菌基因組DNA總長度4709 567 bp，其中包含1條環(huán)狀染色體DNA、1條環(huán)狀質(zhì)粒和2條線性質(zhì)粒。環(huán)狀染色體DNA大小3873 131 bp，G+C摩爾百分含量為28.86%，環(huán)狀質(zhì)粒DNA大小769297 bp，G+C含量為28.33%，線性質(zhì)粒1 DNA大小49922 bp，G+C含量為28.26%，線性質(zhì)粒2 DNA大小17217 bp，G+C含量為27.89%。基因組中預測到4285個基因、87個tRNA基因、44個rRNA基因和3個sRNA基因。

圖1 丁酸梭菌的基因組完成圖與預測基因COG功能分類圖Fig. 1 Genome completion map and predicted gene COG functional classification map of Clostridium butyricum

通過COG對丁酸梭菌基因進行注釋與功能分類，共得到2894個（67.54%）注釋基因，分23個不同功能組（圖1C），預測分組最多的為一般功能基因。丁酸梭菌基因組中注釋基因數(shù)相對較多的為氨基酸代謝與轉(zhuǎn)運、核糖體的生物合成、輔酶轉(zhuǎn)運、脂代謝與轉(zhuǎn)運、能量傳遞等。它們包含合成、運輸和分解次級代謝產(chǎn)物的能力，且碳水化合物代謝相關(guān)基因占比最大。

2.2 耐藥性分析

通過注釋得到有關(guān)耐藥基因的名稱及其所耐受不同抗生素的種類信息。Antibiotic Resistance Genes Database數(shù)據(jù)庫包含13293個基因，共377種類型、257種抗生素，124個門，3369個物種。The Comprehensive Antibiotic Resistance Database數(shù)據(jù)庫包含細菌耐藥性分子基礎數(shù)據(jù)，包括基因、蛋白質(zhì)以及突變。通過將丁酸梭菌基因組序列與數(shù)據(jù)庫比對，均未檢測到耐藥基因存在。丁酸梭菌為益生菌類菌株，常運用于動物飼養(yǎng)以及調(diào)節(jié)人類胃腸道功能，但無已知耐藥基因存在，這為今后在動物飼料添加劑的耐藥性安全開發(fā)方面有重要的指導價值。

2.3 毒力基因分析

VFDB數(shù)據(jù)庫主要對致病菌、衣原體和支原體致病因子進行注釋分析。通過將丁酸梭菌的基因組序列與VFDB數(shù)據(jù)庫進行比對，結(jié)果未檢測到有毒力相關(guān)基因的存在，說明該株丁酸梭菌不含已知毒力基因，有助于今后在動物用飼料添加劑的毒力安全性評價方面提供指導。

2.4 比較基因組學分析

2.4.1 ANI分析 基于全基因組的相似性指標，例如平均核苷酸同一性（average nucleotide identity，ANI），有助于解決有關(guān)遺傳不連續(xù)性或明確物種邊界的問題。有文獻分析的80億個基因組對中有99.8%符合＞95%的種內(nèi)ANI值和＜83%的種間ANI值。

ANI能夠反映出不同的兩個基因組之間共享的所有直系同源基因的平均核苷酸同一性，并且能夠分辨出相同或進化關(guān)系密切的物種菌株。由于直系同源基因在比較基因組對之間可能有很大差異，雖然ANI并不嚴格地衡量核心基因組的進化相關(guān)性，但它能夠密切反映在傳統(tǒng)微生物學概念中用于定義物種的DNA-DNA雜交相關(guān)性，同時它考慮了細菌基因庫的流動性或者細菌之間功能的共享。對菌株進行ANI分析，分析方案結(jié)果如圖2所示，被測丁酸梭菌株與來源為健康雞腸道中的丁酸梭菌株種間進化關(guān)系最為密切，ANI值為99.995361%，這一結(jié)果為今后丁酸梭菌應用于禽類飼料添加劑的開發(fā)奠定了基礎。

圖2 ANI熱圖Fig. 2 ANI heat map

2.4.2 物種進化 通過表型或基因型相似性和差異性繪制不同物種或菌株之間的分支圖，同時可以顯示不同物種之間的進化關(guān)系。樹中的節(jié)點表示其分支最近的共同祖先，節(jié)點與節(jié)點之間線段的長度對應于進化的時間。使用TreeBeST構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，從圖3中可見，C. butyricum菌株與C. butyricum1菌株種間進化關(guān)系較近，這對后續(xù)禽類靶動物飼料開發(fā)具有重要的指導價值。

圖3 系統(tǒng)進化樹Fig. 3 System evolution tree

3 討論

目前，國際上對益生菌的評價暫無統(tǒng)一標準，各國的安全性評價仍處于不斷研究與規(guī)范中。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的迅速發(fā)展，基因組測序技術(shù)已成為微生物鑒定分類、追溯和功能預測的常用方法，因此，從遺傳水平上評價菌株的安全性和危險因素成為可能。ARDB、CARD耐藥基因數(shù)據(jù)庫以及VFDB毒力因子數(shù)據(jù)庫等為菌株從全基因組測序中篩查耐藥、毒力與致病性等基因提供了重要的數(shù)據(jù)保障。本研究對丁酸梭菌的全基因組進行測序組裝，通過與耐藥性數(shù)據(jù)庫ARDB和CARD進行數(shù)據(jù)注釋，全面地掌握了菌株的耐藥情況，檢測比對結(jié)果中未檢出有任何耐藥基因的存在，同時，通過測序結(jié)果與毒力因子數(shù)據(jù)庫VFDB比對，未檢測到相關(guān)毒力因子基因的存在，以目前已經(jīng)收錄的數(shù)據(jù)庫為基礎，在基因組水平上證實了該菌株的安全性。對丁酸梭菌的耐藥性、毒力和致病性方面的安全性研究，為該菌株在畜牧業(yè)中的實際應用奠定了良好的基礎。

隨著畜牧業(yè)減抗、禁抗時代的來臨，丁酸梭菌的問世填補了我國“后抗生素時代”的空白，對于今后在動物醫(yī)學臨床上治療多種動物腸道疾病、增加生產(chǎn)者收益、改善飼養(yǎng)環(huán)境、提高禽畜動物的產(chǎn)品安全品質(zhì)，具有極其重要的意義。因此，菌株的安全性評價也受到越來越多的重視，這不僅要求在菌株分子水平上尋求突破口，今后在產(chǎn)品開發(fā)及應用中，還應增加臨床耐藥性及臨床致病性等安全性評價內(nèi)容，從而綜合評價并指導其應用于產(chǎn)品開發(fā)。