王志剛, 苑進(jìn)革, 徐朋, 張輝, 劉盼盼, 王曉茹, 陳永學(xué), 王秋筠

(1.邯鄲市中心醫(yī)院麻醉科, 邯鄲 056008; 2.河北醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院日間手術(shù)部; 石家莊 050051)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction,POCD)是一種常見(jiàn)的術(shù)后并發(fā)癥,嚴(yán)重威脅著患者尤其是老年人的生活質(zhì)量。有報(bào)道稱,術(shù)后認(rèn)知功能障礙對(duì)老年患者有著長(zhǎng)期的影響,長(zhǎng)期的術(shù)后認(rèn)知功能障礙可發(fā)展為不可逆的癡呆[1]。有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示老年患者接受外科手術(shù)后,33.6% 的患者持續(xù)1年以上的長(zhǎng)期的認(rèn)知功能障礙[2]。目前,術(shù)后認(rèn)知功能障礙的發(fā)生機(jī)制尚未清楚,但神經(jīng)炎癥起著關(guān)鍵作用已被證實(shí)[1]。小膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)主要常駐免疫細(xì)胞,無(wú)菌損傷引起海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步被激活,釋放促炎因子,加劇神經(jīng)炎癥并最終導(dǎo)致認(rèn)知功能的下降[3]。小膠質(zhì)細(xì)胞-神經(jīng)炎癥-認(rèn)知功能障礙通路成為研究的熱點(diǎn)。

有研究報(bào)道,電針(electroacupuncture)可以減輕偏頭痛模型中大鼠的面部異常疼痛,其機(jī)制可能與抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化有關(guān)[4]。電針可以減輕神經(jīng)炎癥,改善老齡大鼠術(shù)后認(rèn)知功能障礙[5]。目前關(guān)于電針改善術(shù)后認(rèn)知功能障礙的相關(guān)機(jī)制仍不明確,并且相關(guān)基礎(chǔ)研究大多在對(duì)術(shù)后早期認(rèn)知功能障礙的觀察,對(duì)于術(shù)后長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙的研究還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此,選擇電針預(yù)處理作為干預(yù)手段,以脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)作為手術(shù)方式,建立大鼠的長(zhǎng)期POCD模型,探討電針預(yù)處理、神經(jīng)炎癥、長(zhǎng)期術(shù)后認(rèn)知功能障礙的關(guān)系以及其可能機(jī)制,并為臨床麻醉實(shí)施提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

20月齡的SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠(SPF級(jí)),質(zhì)量 400～500 g,共60只,購(gòu)于河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)中心。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均按照中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范進(jìn)行操作。維持飼養(yǎng)環(huán)境干凈衛(wèi)生,溫度保持在約22 ℃,相對(duì)濕度50%,保持每日 12 h 光照,晝夜循環(huán)(光照時(shí)間每日6:00—18:00),提供充足的食物和水。保持飼養(yǎng)環(huán)境干凈衛(wèi)生,墊料干燥。為避免環(huán)境影響,適應(yīng)一周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分為以下5組(n=12):假手術(shù)組(S組)、模型組(M組)、電針組(EA組)、銀環(huán)蛇毒+電針組(Y+EA組)、銀環(huán)蛇毒+模型組(Y+M組)。

1.2 主要試劑與儀器

尼氏染色液(碧云天,上海),山羊抗Iba1抗體(Abcam公司,英國(guó)),兔抗鼠GAPDH 抗(北京索萊寶科技,北京),小鼠抗IL-6抗體 (碧云天,上海),兔抗鼠 IL-1β抗體( 北京索萊寶科技,北京),ECL發(fā)光試劑盒 (吉賽生物科技,廣州),兔抗NF-κB抗體( Affinity Bioscience公司,美國(guó))。G6805電針儀(華宜醫(yī)用儀器,上海),熒光顯微鏡( 明美光電技術(shù)公司,廣州),光顯微鏡(奧林巴斯 Olympus,日本),電泳儀及電泳槽(伯樂(lè)biorad,美國(guó)),轉(zhuǎn)膜儀(北京六一儀器,北京),Image Pro Plus 6.0 圖像 分析系統(tǒng)(美國(guó) Media Cybernetics 公司)。

1.3 模型建立

(1)模型組(M組)。參照文獻(xiàn)[6]建立POCD模型。大鼠進(jìn)行稱重后,放入麻醉誘導(dǎo)箱中,打開(kāi)氧氣至2 L/min,同時(shí)打開(kāi)七氟烷揮發(fā)罐至7%刻度,向麻醉箱中輸入七氟烷和氧氣。待大鼠翻正反射消失,取出麻醉箱中的大鼠,并置于帶有加熱板的手術(shù)臺(tái)上,保持仰臥體位,麻醉機(jī)螺紋管連接大鼠麻醉面罩,將麻醉面罩扣住大鼠鼻部并固定,維持4%七氟烷保持大鼠自主呼吸,觀察大鼠呼吸頻率、鼻唇顏色。選取左側(cè)后肢,于前外側(cè)脛骨骨干中上1/3交界處去毛備皮,碘伏消毒后鋪單,在前外側(cè)脛骨骨干中上1/3交界處注射1%利多卡因后,切開(kāi)皮膚1.5～2 cm,暴露脛骨骨干,從脛骨平臺(tái)前緣插入5 mL注射器針頭并旋轉(zhuǎn)打入脛骨骨干,使用手術(shù)刀在脛骨骨干中1/3交界處截?cái)嗝劰窃斐晒钦?碘伏沖洗消毒,縫合皮膚。手術(shù)結(jié)束關(guān)閉七氟烷,放回籠中觀察,至完全清醒并能活動(dòng)。手術(shù)操作由同一人完成,整個(gè)手術(shù)過(guò)程耗時(shí)約30 min。

(2)假手術(shù)組(S組)。麻醉過(guò)程同模型組完全一致,對(duì)照組僅在局麻下切開(kāi)皮膚后縫合,不進(jìn)行脛骨骨折內(nèi)固定的手術(shù)操作,待麻醉達(dá)到30 min后,關(guān)閉七氟烷,放回籠中觀察,至完全清醒并能活動(dòng)。

(3)電針組(EA組)。7%七氟醚麻醉誘導(dǎo)后,選取大鼠右側(cè)足三里(ST36)、合谷(LI4)、內(nèi)關(guān)(PC6)進(jìn)行電針預(yù)處理。參照文獻(xiàn)[7]實(shí)施電針預(yù)處理,選用30號(hào)毫針(直徑約0.3 mm),疏密波,頻率 2 Hz/15 Hz,強(qiáng)度 1 mA,持續(xù) 30 min,1次/d,連續(xù)5 d。有效標(biāo)志為以周圍肌肉輕微收縮為有效。合谷(LI4)位于第1掌骨和第2掌骨之間,直刺1 mm;內(nèi)關(guān)(PC6)位于前肢內(nèi)側(cè)、左右的尺橈骨間、距腕關(guān)節(jié)約3 mm,直刺1 mm;足三里(ST36)位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè),脛、腓骨間,距離腓骨小頭約5 mm,垂直刺入5 mm。 第6天進(jìn)行手術(shù)處理。余同M組。

(4)銀環(huán)蛇毒+電針組(Y+EA組)。實(shí)施方法同EA組,但在每次電針預(yù)處理刺激前30 min通過(guò)腹腔注射α7-nAChR拮抗劑α銀環(huán)蛇毒素(α-BGT)(1 μg/kg溶于1 mL的生理鹽水中)。

(5)銀環(huán)蛇毒+模型組(Y+M組)。在手術(shù)前5 d,每次麻醉后僅腹腔給予1 μg/kg α-BGT,余同模型組。

1.4 取材和指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[8]進(jìn)行新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)。適應(yīng)階段:在開(kāi)始訓(xùn)練之前3 d,每天對(duì)將要實(shí)驗(yàn)的大鼠撫摸1 min,避免刺激大鼠,使其對(duì)測(cè)試者的陌生恐懼感降低,然后放到空測(cè)試箱中適應(yīng)環(huán)境。熟悉階段:在術(shù)后第30天進(jìn)行, 將A、B兩個(gè)物體置于箱體一側(cè)的左右兩側(cè),背朝兩物體,使大鼠鼻尖距離兩物的距離一致。放下大鼠后,開(kāi)啟錄像迅速撤離房間,觀察10 min。記錄老鼠接觸兩個(gè)物體的次數(shù)(用鼻子或嘴接觸物體的次數(shù))和在距離物體2～3 cm范圍內(nèi)探索物體的時(shí)間(前爪貼在物體上、用鼻子聞物體、舔物體等)。記錄探索A和B物體時(shí)間。位置偏好指數(shù)=探索A物體時(shí)間/(探索A+B物體時(shí)間)

1.4.2 測(cè)試階段

大鼠在測(cè)試房休息1 h后開(kāi)始試驗(yàn),物體B被物體C取代,將大鼠放入場(chǎng)地,放入方式同熟悉階段一樣,開(kāi)啟錄像設(shè)備并立即離開(kāi),觀察10 min。記錄新物體探索時(shí)間、熟悉物體探索時(shí)間、大鼠活動(dòng)總路程和大鼠的活動(dòng)平均速度。識(shí)別系數(shù)=新物體探索時(shí)間/(新物體探索時(shí)間+熟悉物體探索時(shí)間)。

1.4.3 尼氏染色法檢測(cè)海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)及數(shù)目

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,隨機(jī)抽取6只大鼠,對(duì)大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉后,使用剪刀剪開(kāi)胸腔,暴露心臟,插入灌注針。從左心室快速灌注4 ℃的0.9%生理鹽水,待右心耳處流出的液體變?yōu)闊o(wú)色后,繼以4 ℃的4%多聚甲醛灌注,灌注完成后,用剪刀快速斷頭取出大腦,模具將腦組織前后切開(kāi),浸泡在4%多聚甲醛中4 ℃冰箱中過(guò)夜,然后石蠟包埋切片(厚度為 5 μm)。然后進(jìn)行尼氏染色,室溫下保持干燥一周,在光學(xué)顯微鏡(BX51,Olympus) ×400下觀察海馬區(qū)神經(jīng)元尼氏體形態(tài)并計(jì)數(shù)。

1.4.4 免疫熒光法觀察小膠質(zhì)細(xì)胞激活情況

取出制備好的腦切片組織,脫蠟、抗原修復(fù)、一抗孵育,二抗孵育,染核和封片。熒光顯微鏡(MF31;Mshot,廣州)用于觀察切片的病理,采用Image-Pro Plus 6.0 (NIH, Bethesda,MD)分析Iba1-陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量。Sholl analysis用于對(duì)MG的Iba1陽(yáng)性細(xì)胞分支長(zhǎng)度進(jìn)行分析。

1.4.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)p-NF-κB、IL-6、和IL-1β及受體的蛋白表達(dá)情況

大鼠新物體識(shí)別試驗(yàn)測(cè)試后,剩余6只大鼠使用10%水合氯醛,進(jìn)行腹腔注射,麻醉起效后,迅速斷頭開(kāi)顱取出腦組織,將取出的腦組織放在冰塊上,迅速分離海馬組織,過(guò)液氮冷凍后放入標(biāo)本袋,標(biāo)記后保存至-80 ℃冰箱存放。從冰箱中取出海馬組織,放置在冰塊上融化。使用顯微手術(shù)剪剪取組織100 mg,放置玻璃勻漿器,加入裂解液。手充分勻漿后移至離心管,冰上30 min裂解。離心,小心抽取上清液到EP管, 二辛可酸(BCA)蛋白濃度測(cè)定實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白濃度, 電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、加入一抗: phospho-NF-κB(1∶1 000 稀釋液),t-NF-κB (1∶1 000 稀釋液)、IL-6 (1∶1 000 稀釋液)、IL-1β (1∶500 稀釋液)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)(1∶1 000稀釋液)孵育,4 ℃冰箱中過(guò)夜。加入二抗:羊抗兔(1∶1 000)和羊抗鼠(1∶1 000)室溫下孵育 1 h。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)ECL顯色/顯影:將ECL試劑A和B以1∶1混合后均勻涂在聚偏二氟乙烯膜(PVDF)PVDF膜,避光2 min,置入自動(dòng)顯影儀進(jìn)行蛋白顯影。數(shù)據(jù)分析,底片掃描后Image-Pro Plus 6.0軟件定量PVDF膜上的蛋白條帶。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)

在熟悉階段,五組大鼠位置偏好指數(shù)無(wú)顯著差異(P>0.05)。在測(cè)試階段,與S組相比較,M組大鼠、EA組、Y+EA組和Y +M組的認(rèn)知指數(shù)(RI)均明顯降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明脛骨骨折手術(shù)導(dǎo)致了大鼠的記憶能力的下降;與EA組比較,M組大鼠的認(rèn)知指數(shù)(RI)同樣明顯降低,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明電針預(yù)處理降低了手術(shù)導(dǎo)致的認(rèn)知記憶能力的下降,保護(hù)了大鼠的記憶功能;但是Y+EA組與EA組比較,認(rèn)知指數(shù)(RI)明顯降低(P<0.05),表明α-BGT逆轉(zhuǎn)了電針保護(hù)大鼠記憶功能的作用。M組、Y+EA組、Y+M組三組間的認(rèn)知指數(shù)(RI)并沒(méi)有明顯差異(P>0.05)。此外,上述5組大鼠的在測(cè)試階段總距離和平均速度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明大鼠的運(yùn)動(dòng)能力并未受到脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)的影響,如圖1所示。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與電針組比較,12只鼠/組圖1 各組大鼠新物體識(shí)別認(rèn)知指數(shù)比較Fig.1 Comparison of cognition index of new object recognition in each group

2.2 Nissl染色檢測(cè)海馬神經(jīng)元數(shù)量

尼氏小體染色形態(tài)學(xué)比較:在海馬齒狀回,S組神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)正常,排列整齊規(guī)則。M組細(xì)胞排列紊亂,部分胞體形狀改變,細(xì)胞連續(xù)性中斷,出現(xiàn)明顯間隙。EA組形態(tài)較M組正常,排列較規(guī)則,連續(xù)性較好。Y+EA、Y+M組形態(tài)和排列與M組相似,細(xì)胞排列紊亂,部分胞體形狀改變,細(xì)胞出現(xiàn)明顯間隙,如圖2所示。

圖2 各組大鼠海馬齒狀回尼氏染色尼氏染色的代表性顯微照片F(xiàn)ig.2 Representative photomicrograph of the dentate gyrus of hippocampi in each group

尼氏小體染色數(shù)目比較:與S組比較,其他4組(M組、EA組、Y+EA組、Y+M組)的尼氏體染色數(shù)目均明顯減少(P<0.05),表明脛骨骨折手術(shù)后導(dǎo)致神經(jīng)元損傷。與EA組比較,M組尼氏染色數(shù)目顯著減少(P<0.05),表明電針預(yù)處理降低了脛骨骨折手術(shù)對(duì)大鼠神經(jīng)元的損傷。但是受α-BGT干預(yù)的Y+EA組的染色數(shù)目也明顯較電針組減少(P<0.05),表明α-BGT部分逆轉(zhuǎn)了電針對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。同時(shí),M組、Y+EA組、Y +M組三組大鼠的尼氏小體染色數(shù)目無(wú)明顯差異(P>0.05),如圖3所示。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與電針組比較,6只鼠/組圖3 各組大鼠尼氏小體數(shù)目比較Fig.3 Comparison of the number of Nissl bodies in each group

2.3 海馬齒狀回激活小膠質(zhì)細(xì)胞比較

激活的小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增大、突起變短反映小膠質(zhì)細(xì)胞的活化狀態(tài)。通過(guò)免疫熒光染色,觀察海馬齒狀回中激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的狀態(tài),以Iba1抗體著色(紅色)為陽(yáng)性指標(biāo),如圖4所示。

圖4 各組大鼠齒狀回Iba1染色的代表性顯微照片。Fig.4 Representative micrograph of Iba1 staining in dentate gyrus of rats in each group

使用ImageJ軟件對(duì)Iba1陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行分析。Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量比較:與S組相比較,其余4組(M組、EA組、Y+EA組、Y+M組)數(shù)目均增多(P<0.05)。與EA組比較,M組、Y+EA組、Y +M組數(shù)目較多(P<0.05)。M組、Y+EA組、Y +M組3組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯差異(P>0.05),如圖5所示。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與電針組比較,只鼠/組圖5 各組免疫熒光法定量Iba1陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量比較Fig.5 Comparison of the number of Iba1-positive cells in each group by immunofluorescence assay

利用Sholl Analysis分析Iba1陽(yáng)性細(xì)胞的最長(zhǎng)分支長(zhǎng)度。Iba1陽(yáng)性細(xì)胞分支長(zhǎng)度比較:與S組比較,M組、Y+EA組、Y+M組分支長(zhǎng)度均明顯縮短(P<0.05), EA組分支長(zhǎng)度與S組無(wú)明顯差異;與EA組比較,M組、Y+EA組、Y +M組分支長(zhǎng)度均明顯縮短(P<0.05);M組、Y+EA組、Y+M組3組分支長(zhǎng)度無(wú)明顯差異(P>0.05),如圖6所示。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與電針組比較,只鼠/組圖6 各組免疫熒光法定量測(cè)定Iba1陽(yáng)性細(xì)胞中分支的長(zhǎng)度Fig.6 Comparison of branch length of Iba1-positive cells in each group by quantitative immunofluorescence assay

2.4 大鼠海馬區(qū)phosphor-NF-κB,IL-6,和IL-1β蛋白表達(dá)情況

phosphor-NF-κB以標(biāo)準(zhǔn)化(phosphor-NF-κB/total NF-κB比值)做比較,IL-6、IL-1β以標(biāo)準(zhǔn)化(IL-6/GAPDH、IL-1β/GADPH比值)做比較。與S組相比較,M組、Y+EA組、Y+M組phosphor-NF-κB、IL-6和 IL-1β蛋白在海馬組織的表達(dá)均升高(P<0.05),EA組無(wú)顯著差異(P>0.05);與EA組比較,M組、Y+EA組、Y+M組phosphor-NF-κB、IL-6和 IL-1β在海馬組織的表達(dá)均升高(P<0.05);M組、Y+EA組、Y+M組phosphor-NF-κB, IL-6, 和 IL-1β在海馬組織的表達(dá)均無(wú)顯著差異(P>0.05)。phosphor-NF-κB以總NF-κB為內(nèi)參,IL-6和 IL-1β以GAPDH為內(nèi)參,如圖7、圖8所示。

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與電針組比較,6只鼠/組圖7 各組大鼠海馬組織phosphor-NF-κB蛋白表達(dá)比較Fig.7 Comparison of phosphor-NF-κB protein expression in hippocampal of rats in each group

與假手術(shù)組比較,*P<0.05;與電針組比較,6只鼠/組圖8 各組大鼠海馬組織IL-6和IL-1β蛋白表達(dá)比較Fig.8 Comparison of IL-6 and IL-1β expression in hippocampal of rats in each group

3 討論

研究表明,大鼠的脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)可以啟動(dòng)POCD的進(jìn)程,并對(duì)認(rèn)知功能障礙產(chǎn)生顯著的長(zhǎng)期影響[9]。同時(shí)脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)造模相對(duì)簡(jiǎn)單,創(chuàng)傷較小,術(shù)后并發(fā)癥較少,存活率較高,已是經(jīng)典的用于誘發(fā)術(shù)后認(rèn)知功能障礙的模型[10]。手術(shù)后30 d進(jìn)行的新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)過(guò)脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)的老齡大鼠探索新物體的行為明顯減少,表明手術(shù)成功誘導(dǎo)了認(rèn)知功能障礙。研究發(fā)現(xiàn),脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)后小鼠的活動(dòng)能力隨時(shí)間逐漸增強(qiáng),約在術(shù)后15 d小鼠的活動(dòng)能力達(dá)到術(shù)前水平,而骨痂完全骨化形成在術(shù)后28 d[11]。術(shù)后認(rèn)知功能障礙影響是一個(gè)長(zhǎng)期的過(guò)程,有研究以術(shù)后7 d(作為短期)和30 d(作為長(zhǎng)期)的認(rèn)知功能障礙的研究[12]。因此,選擇手術(shù)后30 d實(shí)施新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察老齡大鼠的認(rèn)知功能,從而排除脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)對(duì)大鼠活動(dòng)能力的影響。研究結(jié)果表明,術(shù)后30 d大鼠仍存在認(rèn)知功能減退,表明脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能的影響是長(zhǎng)期的。結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)電針預(yù)處理的大鼠盡管與對(duì)照組相比,認(rèn)知指數(shù)仍然發(fā)生了下降,但相較M組,認(rèn)知指數(shù)仍得到了提高,表明電針預(yù)處理部分改善了手術(shù)誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙。

基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí),手術(shù)能導(dǎo)致術(shù)后中樞的神經(jīng)炎癥,并且其與術(shù)后認(rèn)知功能障礙有密切的關(guān)系[13]。先前研究表明接受手術(shù)的老齡小鼠海馬中IL-1β表達(dá)增加與認(rèn)知功能下降有關(guān),認(rèn)知功能下降的老年小鼠海馬IL-6表達(dá)明顯升高[12]。接受脛骨骨折手術(shù)的M組大鼠海馬組織中炎癥因子phosphor-NF-κB,IL-β、IL-6蛋白表達(dá)明顯升高,表明外周手術(shù)導(dǎo)致了大鼠海馬炎癥的發(fā)生,而手術(shù)前經(jīng)過(guò)電針預(yù)處理的大鼠海馬組織中炎癥因子IL-β、IL-6、和phosphor-NF-κB的表達(dá)均明顯降低,表明電針預(yù)處理降低了手術(shù)導(dǎo)致的海馬的神經(jīng)炎癥,這也同之前研究結(jié)果一致[7]。

小膠質(zhì)細(xì)胞功能的衰老被認(rèn)為在神經(jīng)退行性疾病中起著基礎(chǔ)作用[14]。大腦中參與固有免疫的主要是小膠質(zhì)細(xì)胞,也是中樞分泌促炎因子的主要來(lái)源[15]。小膠質(zhì)細(xì)胞在非病理?xiàng)l件下表現(xiàn)為靜止監(jiān)視表型,一旦檢測(cè)到病原體或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào),小膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)發(fā)生快速的形態(tài)和功能改變,從而引發(fā)炎癥反應(yīng)[16]。老齡大鼠在遭遇外周免疫刺激后的長(zhǎng)期神經(jīng)炎癥反應(yīng)主要是由海馬小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的[17]。在感知促炎因子和異常蛋白的變化時(shí),小膠質(zhì)細(xì)胞表型從靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)狀態(tài),在激活過(guò)程中,小膠質(zhì)細(xì)胞在形態(tài)和功能上都發(fā)生了典型的構(gòu)象變化[18]。結(jié)果表明,術(shù)后大鼠海馬齒狀回Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多,且小膠質(zhì)細(xì)胞突起的最長(zhǎng)分支長(zhǎng)度顯著縮短,體積變的矮胖。然而,術(shù)前經(jīng)過(guò)電針預(yù)處理后的大鼠海馬齒狀回激活的Iba1陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目顯著降低,并且小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)未發(fā)生顯著改變,表明電針預(yù)處理抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞的激活。研究表明,由小膠質(zhì)細(xì)胞激活引起的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞核微環(huán)境發(fā)生顯著改變,從而導(dǎo)致神經(jīng)元變性和數(shù)量減少[19]。尼氏染色結(jié)果也顯示脛骨骨折內(nèi)固定手術(shù)后大鼠海馬神經(jīng)元數(shù)量減少,而電針預(yù)處理恢復(fù)了手術(shù)創(chuàng)傷導(dǎo)致的神經(jīng)元數(shù)量的減少。

用特異性α7nAChR阻滯劑α銀環(huán)蛇毒素(α-BGT)阻斷α7nAChR 或?qū)⑿∈?α7nAChR 亞基基因敲除,結(jié)果顯示小鼠對(duì)炎癥均表現(xiàn)出高度敏感,同時(shí)外周血促炎因子水平均顯著升高,表明 α7nAChR 是介導(dǎo)膽堿能抗炎通路上的核心分子[20]。使用α7nAChR激動(dòng)劑后顯示免疫細(xì)胞產(chǎn)生的 TNF-α、IL-1、HMGB1 等促炎因子明顯抑制,這可能是α7nAChR 介導(dǎo)抗炎作用的機(jī)制之一。已有研究證實(shí)電針可能激活大鼠膽堿能抗炎通路,抑制炎癥反應(yīng)[21]。為了觀察電針是否通過(guò)膽堿能抗炎通路抑制脛骨骨折術(shù)后的神經(jīng)炎癥和認(rèn)知功能,使用了α7nAChR的拮抗劑α銀環(huán)蛇毒素(α-BGT),行為學(xué)測(cè)試和病理學(xué)觀察都證實(shí)使用α-BGT逆轉(zhuǎn)了電針預(yù)處理的保護(hù)作用。表明電針預(yù)處理可能是通過(guò)激活α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能抗炎通路而降低老齡大鼠脛骨骨折術(shù)后神經(jīng)炎癥反應(yīng)。在單純給予α-BGT的Y+M組,其并沒(méi)有表現(xiàn)出比M組更壞的結(jié)果,這可能是術(shù)前應(yīng)用α7nAChR阻滯劑并沒(méi)有影響手術(shù)導(dǎo)致的膽堿能抗炎系統(tǒng)抑制。

足三里、合谷、內(nèi)關(guān)穴都與腦有著密切關(guān)系。電針內(nèi)關(guān)穴、足三里可通過(guò)抑制腦缺血再灌注大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的炎癥和壞死,改善腦缺血再灌注大鼠的神經(jīng)損傷[22]。有研究利用fMRI成像顯示,針刺合谷穴可改變輕度認(rèn)知障礙或阿爾茨海默病患者顳葉和額葉的活動(dòng),而這些區(qū)域與記憶和認(rèn)知有關(guān)[23]。圍術(shù)期穴位電刺激合谷、內(nèi)關(guān)顯著緩解了老年腔隙性梗死患者手術(shù)后譫妄發(fā)生率[24]。針灸足三里改善阿爾茨海默病小鼠的神經(jīng)元軸突結(jié)構(gòu)并改善空間學(xué)習(xí)記憶能力[25]。研究證實(shí)刺激足三里能激活迷走神經(jīng)-腎上腺通路,使身體釋放抗炎物質(zhì)[26]。選擇這3個(gè)穴位進(jìn)行電針預(yù)處理,結(jié)果表明,其能改善脛骨骨折內(nèi)固定術(shù)后大鼠的認(rèn)知功能。

4 結(jié)論

(1)大鼠脛骨骨折手術(shù)模型可以導(dǎo)致術(shù)后海馬神經(jīng)炎癥,并造成老齡大鼠長(zhǎng)期術(shù)后認(rèn)知功能障礙。

(2)電針預(yù)處理能夠減弱脛骨骨折術(shù)后大鼠腦內(nèi)神經(jīng)炎癥反應(yīng)并改善長(zhǎng)期術(shù)后認(rèn)知功能障礙。

(3)電針改善大鼠脛骨骨折手術(shù)后長(zhǎng)期認(rèn)知功能障礙的機(jī)制可能是通過(guò)激活α7nAChR介導(dǎo)的膽堿能 抗炎通路。