李巧蓮，肖舒元，蔣笑妍，王巖松*

分析檢測(cè)

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大豆中噻呋酰胺殘留量

李巧蓮1，肖舒元1，蔣笑妍2，王巖松1*

（1. 沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110136； 2. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110866）

基于多壁碳納米管優(yōu)化的 QuEChERS凈化方法，建立了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定大豆中噻呋酰胺殘留量。利用乙腈對(duì)樣品進(jìn)行提取，優(yōu)化QuEChERS凈化，在負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下分析，C18色譜柱分離，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明：在0.1～2.5 μg·L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，噻呋酰胺線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（）為0.993 93，方法檢出限為0.4 μg·kg-1，定量限為2.0μg·kg-1。三水平加標(biāo)試驗(yàn)的平均回收率為83.4%～92.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%～6.2%（=6）。該方法操作快捷，凈化效果好，靈敏度高，適用于大豆中噻呋酰胺的定性定量分析。

多壁碳納米管；QuEChERS；液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；大豆；噻呋酰胺

噻呋酰胺又稱(chēng)為噻氟菌胺，結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。噻呋酰胺是一種酰胺類(lèi)廣譜殺菌劑，由美國(guó)孟山都公司研發(fā)[1]，是一種通過(guò)抑制病原菌三羧酸循環(huán)阻斷病原菌呼吸鏈而導(dǎo)致其死亡[2-5]的殺菌劑。近年來(lái)有關(guān)噻呋酰胺分析檢測(cè)方法的報(bào)道中有邊海濤[6]等利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定果蔬中噻呋酰胺，宋天瑋[7]等利用氣相色譜檢測(cè)小麥中噻呋酰胺，趙小云[8]等利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)香蕉中的噻呋酰胺。而《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中未見(jiàn)大豆的噻呋酰胺限量，氣相色譜-質(zhì)譜法GB 23200.9—2016中制定糧谷中噻呋酰胺的定量限為0.2 mg·kg-1。因此有必要開(kāi)展相關(guān)方法研究，以期實(shí)現(xiàn)大豆中噻呋酰胺殘留痕量分析的目的。

圖1 噻呋酰胺分子結(jié)構(gòu)式

分散固相萃取方法（QuEChERS）)因其速度快、操作方便、消耗有機(jī)溶劑較少等優(yōu)點(diǎn)，在農(nóng)藥殘留和獸藥殘留的檢測(cè)中常被使用[9-13]。QuEChERS方法主要利用無(wú)水硫酸鎂等鹽類(lèi)對(duì)樣品進(jìn)行除水，氧化鋁、石墨化碳黑、十八烷基硅烷鍵合硅膠、N-丙基乙二胺等填料進(jìn)行混合搭配，清除樣品中的雜質(zhì)。為改善其凈化能力，金屬有機(jī)骨架[14]、共價(jià)有機(jī)骨架[15]、多壁碳納米管[16]等一些新型吸附材料被用來(lái)替換傳統(tǒng)的吸附劑。對(duì)比其他新型吸附材料，多壁碳納米管的優(yōu)勢(shì)是比表面積大、化學(xué)穩(wěn)定性和吸附性良好，還具有制備容易、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)，已在農(nóng)獸藥殘留檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用[17-19]。本研究采用多壁碳納米管優(yōu)化QuEChERS凈化技術(shù)與液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）結(jié)合, 建立了大豆中噻呋酰胺殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀，QTRAP 4500，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；電子天平，PTY-B620，華志科技有限公司；電子天平，BS244S-CW，德國(guó)賽多利斯儀器有限公司；多功能粉碎機(jī)，BJ-1000A，德清拜杰電器有限公司；多管渦旋混勻儀，MS200，杭州瑞誠(chéng)有限公司；離心機(jī)，H1750R，長(zhǎng)沙湘儀有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)噻呋酰胺（純度≥99.8%）、無(wú)水硫酸鎂（MgSO4）、石墨化碳黑（GCB）、N-丙基乙二胺吸附劑（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（HC-C18）、多壁碳納米管（MWCNTs），上海安譜有限公司；甲醇、乙腈，色譜純，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；甲酸，分析純, 國(guó)藥集團(tuán)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱(chēng)取均質(zhì)的大豆樣品5.00 g于50 mL離心管中，加入10 mL 乙腈，渦旋提取5 min，用離心機(jī)在1 000 r·min-1條件下離心3 min，取上清液。重復(fù)上述過(guò)程一次，合并兩次提取到的上清溶液并混勻待用。在15 mL離心管中分別加入無(wú)水MgSO4800 mg 、PSA 200 mg、HC-C18100 mg 、 MWCNTs 25 mg，再加入4 mL上清液，振蕩凈化5 min，靜置取其上清液過(guò)0.22 μm有機(jī)相濾膜后供分析。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

100 ng·mL-1標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：準(zhǔn)確稱(chēng)取噻呋酰胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.010 0 g，用甲醇溶解并定容至100 mL，冷凍避光保存。

1.2.3 液相色譜條件

C18色譜柱，2.1 mm× 150mm, 3.5 μm。柱溫為40 ℃，進(jìn)樣體積為10 μL，流速為0.4 mL·min-1。流動(dòng)相：水相（A）為0.1%的甲酸水，有機(jī)相（B）為甲醇。洗脫梯度：0～1 min，10%B；1～3 min，10%B～75%B；3～9 min，75%～95%B；9～10 min，95%B；10～11 min，95%～10%B；11～12 min，10%B。

1.2.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；多級(jí)反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式下，負(fù)離子掃描；離子源溫度為650 ℃，電噴霧電壓為-4 500 V；霧化氣的壓力為448 kPa，氣簾氣的壓力為207 kPa，輔助氣的壓力為448 kPa。質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 噻呋酰胺的質(zhì)譜參數(shù)

注: *為定量離子。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

本研究嘗試正負(fù)離子掃描方式確定化合物的分子離子峰，噻呋酰胺在負(fù)離子全掃描時(shí)出現(xiàn)了明顯的[M-H]-分子離子峰。再調(diào)節(jié)碰撞氣能量打碎母離子，得到子離子碎片，再通過(guò)子離子掃描確定子離子碎片信息。選用0.1%甲酸水為水相，對(duì)乙腈和甲醇為有機(jī)相進(jìn)行考察，以甲醇為有機(jī)相時(shí)，可得到無(wú)干擾峰的色譜峰，色譜峰峰形對(duì)稱(chēng)尖銳，且質(zhì)譜響應(yīng)較高。

綜上，選用負(fù)離子掃描方式，水相（A）為0.1%的甲酸水，有機(jī)相（B）為甲醇，并采用梯度洗脫程序，按照上述儀器條件對(duì)大豆中噻呋酰胺進(jìn)行檢測(cè)分析，得到MRM色譜圖如圖2所示。

圖2 噻呋酰胺MRM色譜圖（0.5 μg·kg-1）

2.2 QuEChERS條件的優(yōu)化

QuEChERS方法通常利用無(wú)水MgSO4、PSA、HC-C18、GCB對(duì)試樣進(jìn)行凈化，分別能吸附試樣中的水分、有機(jī)酸、脂類(lèi)、色素等物質(zhì)。本研究?jī)?yōu)化QuEChERS，采用新型吸附材料MWCNTs去除色素和其他具有剛性平面結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)。用交叉優(yōu)化法選用對(duì)噻呋酰胺回收率較高的凈化劑用量。

稱(chēng)取空白大豆基質(zhì)5.00 g，添加一定量的噻呋酰胺中間液（1.2.2），使其質(zhì)量濃度為0.5 μg·kg-1，按照1.2.1步驟前處理，取4組每組5個(gè)15 mL的離心管。依次完成4組添加不同量的無(wú)水MgSO4、PSA、HC-C18、MWCNTs實(shí)驗(yàn)，不同用量的凈化劑對(duì)噻呋酰胺回收率的影響如圖3所示。由圖3可知，無(wú)水MgSO4對(duì)回收率影響不明顯；PSA 和HC-C18出現(xiàn)明顯回收率下降現(xiàn)象；MWCNTs回收率均低于80%，添加25 mg時(shí)回收最佳。

綜上，確定改良后的QuEChERS添加量為 800 mg無(wú)水MgSO4、200 mg PSA、100 mg HC-C18和25 mg MWCNTs。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 檢出限、定量限和線(xiàn)性范圍

在空白大豆試樣中添加噻呋酰胺中間液（1.2.2）使其質(zhì)量濃度分別為0.1、0.25、0.5、1.25、2.5 μg·L-1，按1.2.1步驟進(jìn)行操作。配制基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性方程為=9.972 68e5-6 816.266 220。在0.1～2.5μg·L-1的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（）為0.993 93，大于0.99，線(xiàn)性關(guān)系良好。以信噪比/≥3和/≥10計(jì)算檢出限和定量限分別為0.4 μg·kg-1和2.0 μg·kg-1。

2.3.2 回收率和精密度

在5.00 g空白大豆試樣中添加噻呋酰胺中間液（1.2.2），使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.0、5.0、10.0 μg·kg-1，按1.2.1步驟進(jìn)行操作，進(jìn)行3水平6平行測(cè)定，平均回收率分別為90.1%、92.3%、83.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.2%、1.4%、2.3%。

3 結(jié) 論

本研究采用多壁碳納米管優(yōu)化QuEChERS凈化技術(shù)，并建立了分析大豆中噻呋酰胺的液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。此方法操作簡(jiǎn)便、凈化效果顯著、檢出限低、靈敏度和精密度高，可有效應(yīng)用于大豆中噻呋酰胺的檢測(cè)，為殘留限量的制定提供技術(shù) 支持。

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Determination of Thifluzamide in Soybean by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

1,1,2,1*

（1. Shenyang Food and Drug Inspection Institute, Shenyang Liaoning 110136, China;2. College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang Liaoning 110866, China）

An improved QuEChERS purification method based on multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) was established, combined with liquid chromatography-tandem mass spectrometry for the determination of thifluzamide in soybean. The samples were extracted by acetonitrile, cleaned up with QuEChERS method, separated by C18column, detected by MS/MS in negative ion mode using multiple reaction monitoring (MRM), and finally quantified by the external standard method. The results showed that the calibration curves for thifluzamide showed good linearity with correlation coefficients () of 0.99393 in the concentration range of 0.1～2.5μg·L-1. The limits of detection (LOD) and the limits of quantification (LOQ) of the developed method were 0.4μg·kg-1and 2.0μg·kg-1, respectively. The average recoveries at three levels ranged from 83.4% to 92.3% with relative standard deviations (RSD) of 1.4%～6.2% (=6). This method was fast to operate, showed good purification efficiency and sensitive. This method is suitable for the qualitative and quantitative analysis of thifluzamide in soybean.

Multi-walled carbon nanotubes; QuEChERS; Liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Soybean; Thifluzamide

O657

A

1004-0935（2023）09-1388-04

國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：2020MK134）；沈陽(yáng)市科學(xué)技術(shù)局科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：22-322-3-37）。

2022-09-16

李巧蓮（1988-），女，遼寧省沈陽(yáng)市人，中級(jí)工程師，碩士研究生，2014年畢業(yè)于沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)專(zhuān)業(yè)，研究方向：食品藥品質(zhì)量安全檢測(cè)。

王巖松（1980-），男，高級(jí)工程師，博士研究生，研究方向：食品中多種有機(jī)污染物檢測(cè)方法。