王芳,李心欣,李曼,2,丁曉嵐,徐前喜,杜娟

局限性硬皮病(localized scleroderma,LS)和系統(tǒng)性硬化癥(systemic sclerosis,SSc)的患者皮損均出現(xiàn)不同程度纖維硬化,組織病理均表現(xiàn)為早期混合炎癥細(xì)胞浸潤,晚期真皮大量膠原沉積和附屬器減少［1-2］。近年來,巨噬細(xì)胞在組織纖維化和創(chuàng)傷愈合中的作用逐漸受到關(guān)注［3］。巨噬細(xì)胞是固有免疫中的重要調(diào)節(jié)者,激活后可極化為M1型或M2型,兩種細(xì)胞亞型在炎癥活動(dòng)、創(chuàng)傷愈合以及組織纖維化的不同階段各司其職［4］。M1型細(xì)胞以促進(jìn)炎癥、清除病原體和細(xì)胞,促進(jìn)纖維溶解為主;M2型細(xì)胞則傾向抑制炎癥、促纖維化和血管增生等作用［3, 5］。目前,國內(nèi)尚無針對(duì)這一組硬化性皮膚疾病皮損中巨噬細(xì)胞極化狀態(tài)的相關(guān)研究,而其極化與皮損硬化程度、患者臨床病程和其他臨床指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性尚需探討。因此,本研究收集LS和SSc患者的皮損,觀察巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)及其與疾病的相關(guān)性,探討巨噬細(xì)胞極化在LS和SSc皮膚纖維化中的作用。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 收集2018年1月—2020年9月就診于本科的局限性硬皮病和系統(tǒng)性硬化患者病例并進(jìn)行回顧性研究,包括:局限性硬皮病24例和系統(tǒng)性硬化18例,同時(shí)收集健康人對(duì)照10例。患者的病史、臨床表現(xiàn)及組織病理檢查均符合相應(yīng)疾病診斷標(biāo)準(zhǔn):LS參見2016年歐洲或2018年日本［6］局限性硬皮病診斷標(biāo)準(zhǔn);SSc參見2013年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(EULAR)聯(lián)合提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］;皮損活檢前4周內(nèi)未進(jìn)行任何口服糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或外用藥治療,取材部位為活動(dòng)期邊緣,同時(shí)完整記錄患者病情、皮損部位和相關(guān)血清學(xué)檢查(ANA和Scl-70)結(jié)果。對(duì)照組選取整形或外傷手術(shù)需切取的健康皮膚,臨床中無自身免疫或其他疾病,無糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或外用藥使用史。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在性別、年齡等方面相符,具有可比性。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2主要試劑 免疫組化CD68抗體購于北京中杉金橋、iNOS抗體購于美國Abcam公司、CD163抗體購于美國徠卡公司,Masson三染色試劑盒購于瑞士Roche公司,自身抗體ANA和Scl-70均由北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科提供檢測(cè)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法和步驟 取皮損/皮膚后經(jīng)4%甲醛溶液固定,石蠟包埋,連續(xù)切取4 μm切片,脫蠟和暴露抗原處理,嚴(yán)格按照免疫組織化學(xué)和Masson三染色試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行,設(shè)立相應(yīng)陽性、陰性參照?？偩奘杉?xì)胞、M1亞型和M2亞型分別用CD68、iNOS和CD163標(biāo)記,用Masson三染色法行膠原染色并測(cè)定膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)。

1.4圖像分析 將免疫組織化學(xué)和特殊染色切片用顯微鏡(美國Leica)高倍鏡頭下(400×)采集圖像,對(duì)每個(gè)標(biāo)本目標(biāo)區(qū)域隨機(jī)選取不重疊的3～5處視野,在Image J 1.53圖像系統(tǒng)輔助下分別測(cè)算LS組、SSc組和對(duì)照組標(biāo)本組織真皮區(qū)域單位面積內(nèi)CD68、CD163、iNOS的單位面積內(nèi)細(xì)胞陽性數(shù)(cells/HP)和膠原容積百分比(%)。

2 結(jié)果

2.1患者臨床資料 LS組、SSc組和對(duì)照組患者的年齡、性別、病程、自身抗體譜ANA和Scl-70陽性率分別如表1所示,各組患者年齡具有可比性(F=1.09,P=0.35)。LS組中僅有1例患者表達(dá)ANA(1∶80斑點(diǎn)型),Scl-70均為陰性;而SSc組患者中ANA表達(dá)比例較高(83.33%,陽性患者滴度從1∶160至1∶1 280),Scl-70陽性率為(16.67%,陽性患者從+至3+),見表1。

表1 患者臨床資料及血清學(xué)指標(biāo)

2.2M1/M2型巨噬細(xì)胞在兩種疾病皮損中的表達(dá)分布情況 LS組和SSc組皮損的真皮淺深層血管周圍及膠原束間可見CD68+總巨噬細(xì)胞表達(dá)均較對(duì)照組升高(圖1),分別為LS組(32.54±12.12)/HP、SSc組(21.83±7.28)/HP和對(duì)照組(6.70±2.83)/HP。LS、SSc組和對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.61、6.27,P<0.05),見圖2。其中,特異性表達(dá)iNOS的M1型巨噬細(xì)胞在LS組和SSc患者真皮淺層僅有較少淡棕色陽性著色(圖1),與對(duì)照組染色結(jié)果相似,分別為LS組(11.29±8.65)/HP、SSc組(13.08±7.41)/HP和對(duì)照組 (8.05±4.69)/HP,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.11、1.93,P>0.05)。然而,特異性表達(dá)CD163的M2型巨噬細(xì)胞在真皮淺深層的血管周圍和膠原束間均有深棕色中等密度表達(dá)(圖1),分別為LS組(42.48±18.77)/HP、SSc組(38.63±17.71)/HP和對(duì)照組(10.42±3.55)/HP,疾病組和對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.32、4.94,P<0.05),見圖2。

圖1 CD68、iNOS、CD163在LS組、SSc組和對(duì)照組皮損的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 (×400)

Note:**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1,ns P>0.05.

2.3M2型巨噬細(xì)胞浸潤與病程相關(guān)性 將LS組患者根據(jù)病程長短(起病至皮損取材的時(shí)間)分層為LS早期組(≤1年,12例)和LS晚期組(>1年,12例),真皮CD163+細(xì)胞浸潤數(shù)量分別為(45.43±18.34)/HP和(39.52±19.52)/HP,兩亞組間M2型巨噬細(xì)胞浸潤的數(shù)量相當(dāng),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.77,P>0.05)。同樣,將SSc組患者按病程分為早期組(≤1年,8例)和晚期組(>1年,10例)得到一致趨勢(shì),差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.45,P>0.05)。

2.4M2型巨噬細(xì)胞和真皮膠原容積的相關(guān)性 通過Masson三染色可顯示真皮膠原束形態(tài)和分布,LS組和SSc組中膠原束粗大增厚,膠原間隙變窄,而對(duì)照組真皮中可見纖細(xì)彎曲的膠原束錯(cuò)落有致排列(圖3)。通過ImageJ分離顏色通道所得的灰度圖計(jì)算CVF發(fā)現(xiàn),LS組和SSc組的CVF均遠(yuǎn)高于對(duì)照組,分別為LS組(75.81±5.43)%、SSc組(68.33±8.37)%和對(duì)照組(55.53±3.83)%(t=10.71、4.55,P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示,LS皮損和SSc皮損中M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)均與CVF無明顯關(guān)聯(lián)(r=-0.06、-0.12,P>0.05)。

圖3 LS組、SSc組和對(duì)照組皮損真皮Masson染色 (×200)

3 討論

局限性硬皮病和系統(tǒng)性硬化癥是一組與T淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞失衡相關(guān)的自身免疫疾病,皮膚可表現(xiàn)為纖維硬化。血液中靜息狀態(tài)的單核/巨噬細(xì)胞M0在外傷、炎癥等刺激因素作用下募集至皮膚組織,轉(zhuǎn)化為經(jīng)典M1型或替代激活M2型細(xì)胞發(fā)揮作用,這個(gè)過程稱為極化［5］。經(jīng)典M1型巨噬細(xì)胞在組織創(chuàng)傷和炎癥早期發(fā)揮作用,通過釋放一氧化氮合酶(iNOS,本實(shí)驗(yàn)標(biāo)記蛋白)、白介素IL-1β、IL-6、IL-12和TNF等促進(jìn)炎癥過程、吞噬凋亡細(xì)胞或病原體、抗原提呈和促纖維溶解等作用。而組織創(chuàng)傷和炎癥后期,替代激活M2型巨噬細(xì)胞升高,特異性標(biāo)記為甘露糖受體-1(CD206)和巨噬細(xì)胞清除劑受體(CD204和CD163)。M2型細(xì)胞可釋放VEGF、EGF、IL-10、TGF-β1等,參與血管增生和組織纖維化等修復(fù)過程［5,8］。在不同的疾病、病程和組織器官中巨噬細(xì)胞的極化狀態(tài)和作用可能不同。

本研究發(fā)現(xiàn),LS和SSc患者皮損中的CD68+總巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量顯著升高,以CD163+M2型細(xì)胞占主導(dǎo);iNOS+M1型細(xì)胞在兩組疾病中表達(dá)均很低。據(jù)文獻(xiàn)檢索,本研究首次收集了兩種以皮膚纖維化為特點(diǎn)的疾病,證實(shí)M2型巨噬細(xì)胞主導(dǎo)的炎癥在皮膚纖維化的早晚期主導(dǎo)作用,而促炎相關(guān)的M1型巨噬細(xì)胞可能僅參與在極早期的炎癥過程中。M2型巨噬細(xì)胞不僅在皮損中表達(dá)升高,有研究發(fā)現(xiàn)SSc患者外周血中單核/巨噬細(xì)胞數(shù)量增加且凋亡降低［9］,M2型細(xì)胞(CD163、CD206、CD204三標(biāo))的百分比顯著高于健康人［10］,并且與患者肺間質(zhì)纖維化程度等臨床表現(xiàn)正相關(guān)。多條細(xì)胞通路可參與M2型巨噬細(xì)胞的極化,IL-4/IL-13/STAT6、TGF-β1/smad2/3、PPARγ/SOCS1/STAT6等多條通路可以促進(jìn)靜息狀態(tài)巨噬細(xì)胞M0或經(jīng)典激活M1型向M2型極化［11］。極化后的M2型巨噬細(xì)胞如何影響皮膚纖維化仍值得研究。以LS患者為例,Higashi-Kuwata等［12］發(fā)現(xiàn)M2型細(xì)胞直接分泌大量TGFβ-1,促進(jìn)成纖維細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì),同時(shí)通過增加組織金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)合成而抑制金屬蛋白酶類(MMPs)活性,減少膠原蛋白降解。M2型巨噬細(xì)胞也可通過分泌IL-10、IL-13、IL-33等Th2型細(xì)胞因子促進(jìn)纖維化過程,同時(shí)趨化因子(CCL2、CCL17、CCL22和CCL18等)和金屬蛋白酶MMPs也參與到細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和重塑中［13］。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)在LS組和SSc組的早晚期皮損中M2型巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量均較多,M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量并不隨病程延長而減少或凋亡,M2型巨噬細(xì)胞應(yīng)該在皮膚纖維化早期即發(fā)揮作用。而真皮中M2型巨噬細(xì)胞是如何發(fā)揮作用的,是否與Th2型細(xì)胞及其相關(guān)因子互相協(xié)同作用也值得進(jìn)一步研究［14］。本研究值得進(jìn)一步思考:是否臨床中有皮膚纖維硬化的疾病(如:硬腫病、硬化性黏液水腫或硬皮病樣GVHD等)均有M2型巨噬細(xì)胞的參與?而調(diào)節(jié)相關(guān)炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子可成為皮膚纖維化疾病中的共同靶點(diǎn)。

Masson三染色后測(cè)量真皮層CVF可衡量皮損的纖維化程度［15］。本實(shí)驗(yàn)中LS組和SSc組CVF較健康組均明顯升高。但通過Pearson相關(guān)性分析顯示,M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量(cells/HP)與CVF無直接線性相關(guān)。分析認(rèn)為,M2型巨噬細(xì)胞極化可能為皮損纖維化的早期改變,與相關(guān)的Th2型淋巴細(xì)胞共同分泌相關(guān)白介素、趨化因子和生長因子等,進(jìn)而激活成纖維細(xì)胞活化,促進(jìn)膠原纖維合成。因此這一復(fù)雜的炎癥過程中M2型細(xì)胞的數(shù)量和晚期的“結(jié)果”非直接線性相關(guān)。

綜上所述,LS和SSc患者皮損中均存在巨噬細(xì)胞向M2型極化,提示其在病程早晚期均發(fā)揮作用,但可能與皮膚纖維化程度無直接線性關(guān)聯(lián)。