徐婷玉,匡琳,石佳靈,張佳敏,吳揚(yáng)帆

2型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 2,HSV-2)屬于人類(lèi)皰疹病毒家族中的α皰疹病毒,是具有囊膜的雙鏈DNA病毒［1］。HSV-2是引起生殖器皰疹的主要病原體,主要通過(guò)性接觸傳播引起反復(fù)發(fā)作、難以治愈的生殖器感染［2-3］,研究表明感染HSV-2的患者感染人免疫缺陷病毒(HIV)的危險(xiǎn)性高于普通人,孕婦感染HSV-2會(huì)引起胎兒感染,嚴(yán)重者會(huì)導(dǎo)致胎兒持久性神經(jīng)損傷以及胎兒死亡［4-6］。由于其反復(fù)發(fā)作以及一系列嚴(yán)重的并發(fā)癥,防治單純皰疹病毒感染依然是當(dāng)今世界最重要的公共健康問(wèn)題之一。近年來(lái)中醫(yī)藥抗病毒治療廣泛應(yīng)用于臨床常見(jiàn)的病毒感染性疾病,中草藥抗HSV-2有一定的優(yōu)勢(shì)。本課題組前期在臨床上運(yùn)用知柏地黃湯治療生殖器皰疹,療效確切,有效的降低了復(fù)發(fā)率［7］。但是知柏地黃湯治療生殖器皰疹的作用機(jī)制尚不清楚,相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究較少,未能深入研究知柏地黃湯抗HSV-2的作用機(jī)制。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究方法聯(lián)合蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討知柏地黃湯抗HSV-2的作用機(jī)制,為后續(xù)的深入研究提供方向與依據(jù)。

1 材料與方法

1.1知柏地黃湯抗HSV-2的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1知柏地黃湯活性成分及作用靶點(diǎn)獲取 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)［8］(https://tcmsp-e.com/tcmsp.php)檢索知柏地黃湯各藥物的活性成分和作用靶點(diǎn),并設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%及類(lèi)藥性(drug likeness,DL)≥0.18,利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)［9］(https://www.uniprot.org/)對(duì)獲取的靶點(diǎn)進(jìn)行基因名校正。

1.1.2知柏地黃湯成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 將獲取的知柏地黃湯活性成分及作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1軟件［10］,構(gòu)建藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,利用內(nèi)置插件Cyto Hubba［11］對(duì)網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析。

1.1.3HSV-2相關(guān)靶點(diǎn)獲取 以“herpes simplex virus 2”為關(guān)鍵詞在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)［12］(https://www.genecards.org/)和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)［13］(https://www.omim.org/)中檢索HSV-2相關(guān)靶點(diǎn),并通過(guò)Venny2.1在線(xiàn)平臺(tái)(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲取藥物成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)。

1.1.4知柏地黃湯抗HSV-2的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將交集靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)［14］(https://string-db.org/),獲取PPI網(wǎng)絡(luò)信息,再利用Cytoscape3.9.1軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)信息進(jìn)行可視化,結(jié)合內(nèi)置插件Cyto Hubba分析并篩選核心靶點(diǎn)。

1.1.5交集靶點(diǎn)富集分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)［15］(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析,以P<0.05為閾值篩選符合條件的結(jié)果,利用微生信在線(xiàn)平臺(tái)(http://www.bioinformatics.com.cn/)進(jìn)行可視化處理。

1.1.6運(yùn)用分子對(duì)接預(yù)測(cè)知柏地黃湯有效成分與核心靶點(diǎn)的關(guān)系 通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)將1.1.1中得到的主要有效成分與1.1.4中得到的核心靶點(diǎn)進(jìn)行相互作用的可靠性驗(yàn)證。

1.2知柏地黃湯對(duì)HSV-2感染神經(jīng)元細(xì)胞的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

1.2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠20只,雌雄各半,8周齡,體重為(200±20)g,購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司［許可證號(hào):SCKX(湘)2019-0004］。所有大鼠飼養(yǎng)于屏障環(huán)境內(nèi),12 h晝夜明暗交替,溫度22～26 ℃,濕度40%～60%,自由進(jìn)食及飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):LLBH-202111250002)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑 知柏地黃湯配方顆粒:知母10 g、黃柏10 g、山茱萸15 g、山藥15 g、牡丹皮10 g、澤瀉10 g、茯苓10 g、熟地黃20 g(深圳華潤(rùn)三九股份有限公司提供)。

DMEM高糖培養(yǎng)基(武漢普諾賽公司,貨號(hào)PM150210),BCA蛋白定量試劑盒(武漢伊萊瑞特公司,貨號(hào)E-CK-A362),甲酸(美國(guó)Thermo Fisher公司,貨號(hào)A117),乙腈(德國(guó)Merck公司,貨號(hào)1000304008)。

1.2.3實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及病毒株 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株(SH-SY5Y),購(gòu)于武漢普諾賽,貨號(hào)為CL-028。HSV-2 333株,購(gòu)于武漢病毒所,TCID50為4.5,保存于湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合病原生物實(shí)驗(yàn)室。本實(shí)驗(yàn)中所有病毒操作均在BSL-2實(shí)驗(yàn)室中完成。

1.2.4實(shí)驗(yàn)儀器 二級(jí)生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、高速冷凍離心機(jī)、EasynLC色譜系統(tǒng)、QExactive HF-X質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher公司),倒置熒光顯微鏡(德國(guó)CarelZeiss公司),立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌器(廈門(mén)致微儀器公司)。

1.2.5含藥血清制備 20只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后,按照隨機(jī)數(shù)字表法分為空白對(duì)照組與知柏地黃湯組,每組10只。根據(jù)人與大鼠體表面積換算的等效劑量比值計(jì)算出大鼠給藥劑量［16］。知柏地黃湯組予以9 g/(kg·d)的劑量灌胃,空白對(duì)照組以等體積的生理鹽水灌胃,2次/d,連續(xù)灌胃7 d。末次灌胃24 h后,用40 mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,腹主動(dòng)脈采血,室溫靜置2 h后,3 000 r/min,離心15 min收集上層血清,56 ℃滅活30 min,經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后分裝保存于-80 ℃冰箱中。

1.2.6構(gòu)建HSV-2感染的SH-SY5Y細(xì)胞模型 SH-SY5Y細(xì)胞密度達(dá)80%以上時(shí),胰酶消化,重懸細(xì)胞后接種于6孔板中,設(shè)置正常對(duì)照組(BCG組)、病毒模型組(MCG組)和知柏地黃湯組(ZDD組)。首先各組以10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),待細(xì)胞貼壁且密度達(dá)70%以上時(shí),MCG組和ZDD組加入100TCID50的病毒液進(jìn)行干預(yù),CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h后,BCG組與MCG組更換10%空白血清的培養(yǎng)基,ZDD組更換為10%知柏地黃湯含藥血清的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集相應(yīng)樣本。

1.2.7蛋白質(zhì)組學(xué)研究 取干預(yù)后的SH-SY5Y細(xì)胞樣品,加入SDT裂解液,沸水浴15 min。14 000 g離心15 min,取上清液,BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白樣品經(jīng)丙酮沉淀、重溶、還原、烷基化、酶解、去除SDC及多肽脫鹽處理得到肽段。每份樣品采用納升流速EasynLC色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離,經(jīng)色譜分離后用QExactive HF-X質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用MaxQuant軟件(v1.6.17.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索,數(shù)據(jù)庫(kù)為uniprot_homo_20221024_20402_9606_swiss_prot,采用LFQ(LabelFree Quantitation)算法進(jìn)行定量分析。然后利用t檢驗(yàn)方法計(jì)算P鑒定差異蛋白,以表達(dá)差異倍數(shù)大于1.5倍且P≤0.05為篩選條件;再通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行差異蛋白GO及KEGG通路富集分析。

2 結(jié)果

2.1網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果

2.1.1知柏地黃湯活性成分及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 以O(shè)B≥30%及DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn),共獲得126個(gè)活性成分,其中知母15個(gè),黃柏37個(gè),熟地黃2個(gè),山藥16個(gè),山茱萸20個(gè),牡丹皮11個(gè),澤瀉10個(gè),茯苓15個(gè)。剔除無(wú)對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)信息的活性成分并去重,最終得到69個(gè)活性成分。對(duì)知柏地黃湯活性成分靶點(diǎn)信息預(yù)測(cè)結(jié)果整合去除重復(fù)值后得到213個(gè)作用靶點(diǎn)。

2.1.2知柏地黃湯藥物成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建 利用Cyto Hubba插件計(jì)算各節(jié)點(diǎn)的Degree值,根據(jù)Degree值篩選出排名前10的成分,分別為槲皮素、山奈酚、豆甾醇等,見(jiàn)表1。將得到的藥物活性成分和作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.9.1中,構(gòu)建知柏地黃湯成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,網(wǎng)絡(luò)中共291個(gè)節(jié)點(diǎn),1 263條邊。

表1 知柏地黃湯Degree值前10的活性成分

2.1.3HSV-2相關(guān)靶點(diǎn)篩選結(jié)果 以“herpes simplex virus 2”為關(guān)鍵詞分別在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,將得到的結(jié)果合并刪除重復(fù)值后,最終獲得HSV-2疾病靶點(diǎn)282個(gè)。將其與藥物成分靶點(diǎn)上傳至Venny2.1在線(xiàn)平臺(tái),取交集后共獲得37個(gè)交集靶點(diǎn),韋恩圖見(jiàn)圖1。獲得的交集靶點(diǎn)即為知柏地黃湯抗HSV-2的潛在作用靶點(diǎn)。

圖1 知柏地黃湯與HSV-2靶點(diǎn)韋恩圖

2.1.4知柏地黃湯抗HSV-2的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將37個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù),置信度選擇最高置信度0.9,隱藏?zé)o關(guān)靶點(diǎn),得到PPI網(wǎng)絡(luò)信息。利用Cytoscape3.9.1軟件對(duì)導(dǎo)出的tsv文件進(jìn)行可視化處理,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖2),結(jié)合Cyto Hubba插件進(jìn)行分析,根據(jù)Degree值篩選出排名前10的核心靶點(diǎn),主要有RELA、IL-6、TNF、IL-10等,見(jiàn)圖3,表2。

圖2 知柏地黃湯抗HSV-2潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 知柏地黃湯抗HSV-2核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 知柏地黃湯抗HSV-2核心靶點(diǎn)

2.1.5GO功能分析結(jié)果 通過(guò)David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)37個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO基因功能分析,共得到GO功能富集結(jié)果479個(gè),包括399個(gè)生物過(guò)程,27個(gè)細(xì)胞組分,53個(gè)分子功能,涉及144條KEGG通路。對(duì)于GO分析中BP、CC和MF中排名前10的條目繪制富集條形圖(圖4)。在GO富集分析結(jié)果中,知柏地黃湯抗HSV-2的生物過(guò)程包括基因表達(dá)的正調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡過(guò)程、炎癥反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)控、細(xì)胞凋亡過(guò)程、DNA模板轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)等;細(xì)胞組分中包括細(xì)胞外間隙、胞核、胞質(zhì)、胞漿、線(xiàn)粒體外膜等;分子功能主要富集于酶結(jié)合、細(xì)胞因子活性、蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、激酶活化、DNA結(jié)合等。

圖4 知柏地黃湯抗HSV-2潛在靶點(diǎn)GO分析

2.1.6KEGG富集通路分析結(jié)果 KEGG富集通路分析共得到144條信號(hào)通路,其中主要有IL-17信號(hào)通路、Toll受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等通路,根據(jù)P值篩選出前30條通路繪制KEGG富集圖(圖5)。在30條通路中發(fā)現(xiàn)部分與病毒感染有關(guān)的通路,分別為甲型流感、人巨細(xì)胞病毒感染、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染、丙型肝炎等通路,說(shuō)明知柏地黃湯可能通過(guò)相關(guān)信號(hào)通路途徑發(fā)揮抗病毒作用。

圖5 KEGG富集分析柱狀圖

2.1.7知柏地黃湯主要成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果 選取知柏地黃湯中3個(gè)主要有效成分槲皮素、山柰酚、豆甾醇與3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)IL-10、 IL-6、TNF進(jìn)行分子對(duì)接。結(jié)果表明主要有效成分和靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合性。見(jiàn)表3,圖6。

圖6 槲皮素與IL-10、IL-6、TNF分子對(duì)接示意圖

表3 知柏地黃湯主要有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對(duì)接結(jié)果 (kcal/mol)

2.2蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果

2.2.1蛋白/ 多肽統(tǒng)計(jì) 本研究共鑒定到3 960個(gè)蛋白(groups),28 434 條多肽,見(jiàn)圖7。本實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集自Q Exactive HF-X高分辨率質(zhì)譜儀,能夠獲得高質(zhì)量的MS2圖譜,然后使用Andromeda對(duì)MS圖譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,最終獲得每張MS2圖譜的得分,即肽段離子得分(Ion Score)。從圖8中可以看出,大多數(shù)肽段得分在60分以上,每一套Label-free數(shù)據(jù)在定性分析工作中均使用Peptide FDR≤0.01和Protein FDR≤0.01作為篩選標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合所得的優(yōu)秀肽段得分分布情況,進(jìn)一步說(shuō)明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)質(zhì)量較高。

圖7 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)圖

圖8 肽段離子得分分布圖

2.2.2差異蛋白的篩選與表達(dá)分析 共鑒定出3 960個(gè)蛋白,病毒模型組(MCG組)與正常對(duì)照組(BCG組)相比,有688個(gè)上調(diào)蛋白,641個(gè)下調(diào)蛋白;知柏地黃湯組(ZDD組)與MCG組相比,有569個(gè)上調(diào)蛋白,619個(gè)下調(diào)蛋白,見(jiàn)圖9。比較各組顯著表達(dá)差異蛋白,其中ILF3、MAP1B、SERBP1等差異蛋白在MCG組呈現(xiàn)下調(diào),在ZDD組呈現(xiàn)上調(diào),而ADAM10、ITGAV、CD63等差異蛋白在MCG組呈現(xiàn)上調(diào),在ZDD組呈現(xiàn)下調(diào)。說(shuō)明這部蛋白可能是知柏地黃湯抗HSV-2的核心蛋白,后續(xù)還需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步認(rèn)證。

Note:Points in the figure are upregulated proteins in blue, downregulated proteins in cyan, and no difference in gray and black.

2.2.3差異蛋白GO 功能富集分析 采用 Blast2Go(https://www.blast2go.com/)軟件對(duì)所有差異表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能注釋,通過(guò)Fisher精確檢驗(yàn)來(lái)發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)蛋白的顯著性的富集趨勢(shì)(P<0.05)。結(jié)果表明這些蛋白主要參與了生物進(jìn)程、細(xì)胞組成和分子功能的作用,潛在作用靶點(diǎn)主要集中在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、胞外區(qū)和細(xì)胞膜。知柏地黃湯通過(guò)影響細(xì)胞mRNA的穩(wěn)定性、ATP的合成等途徑干預(yù)HSV-2病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制,見(jiàn)圖10。

Note:The ordinate represents the GO function name, the horizontal axis value is the significance P value-Log10 converted value, the color indicates the different GO function classification, and the number on the column represents the rich factor value.

2.2.4差異蛋白的KEGG 富集分析 對(duì)所有顯著差異蛋白納入KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,找出有顯著關(guān)系的KEGG 通路,結(jié)果顯示知柏地黃湯所涉及的通路主要有Toll、IL-17、P13K-Akt信號(hào)通路等,見(jiàn)圖11。

Note:The ordinate indicates the KEGG pathway name, the abscissa indicates the rich factor value, the circle color represents the converted value, the blue color indicates the smaller P value, and the circle size indicates the number of differential proteins included in the pathway.

3 討論

生殖器皰疹屬于中醫(yī)“陰瘡”、“陰疳”等范疇,主要由于正氣不足,觸染濕熱毒邪而發(fā)病,而濕熱久蘊(yùn),耗氣傷陰,陰虛邪戀,病情反復(fù)發(fā)作［17］。知柏地黃湯最早見(jiàn)于《醫(yī)宗金鑒》,由六味地黃丸化裁而來(lái),主要由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓、黃柏、知母八味中藥組成,主要功效為滋陰降火,臨床上用于治療陰虛邪戀,陰虛火旺證。前期臨床上運(yùn)用知柏地黃湯治療復(fù)發(fā)性生殖器皰疹取得了一定的療效［7］。

本研究網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果顯示,槲皮素、山奈酚、豆甾醇等可能為知柏地黃湯抗HSV-2的主要活性成分。槲皮素是一種天然黃酮類(lèi)化合物,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有抗氧化、抗炎、抗病毒以及光譜抗菌性等藥理作用［18-20］。許玲芬等［21］發(fā)現(xiàn)槲皮素可以通過(guò)TLR4-NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抗炎、抗病毒的作用。山奈酚是一種黃酮化合物,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗病毒、抗氧化等藥理作用［22］。豆甾醇屬于一種植物性甾醇,具有較強(qiáng)的生物活性,具有抗炎、抗氧化、抗癌等作用,其對(duì)過(guò)敏性皮膚病也有一定的藥理作用［23-24］。

根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)及拓?fù)浞治?篩選出較為重要的核心靶點(diǎn),主要有RELA、IL-6、TNF、IL-10等。RELA通過(guò)可以通過(guò)抑制NF-κB和SP1的作用來(lái)阻斷HSV-1病毒的轉(zhuǎn)錄［25］。腫瘤壞死因子、白介素等屬于炎癥細(xì)胞因子,其表達(dá)的異常一定程度上反映了機(jī)體免疫功能狀況。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果一定程度上說(shuō)明知柏地黃湯抗HSV-2的核心靶點(diǎn)蛋白通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥反應(yīng)以及免疫反應(yīng)發(fā)揮抗病毒作用。GO與KEGG富集分析結(jié)果表明,RELA、IL-6、TNF、IL-10等靶點(diǎn),可能通過(guò)參與調(diào)控IL信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等多種信號(hào)通路。其中Toll樣受體(TLRs)是一種模式識(shí)別受體,主要是識(shí)別病原體以及誘導(dǎo)先天免疫應(yīng)答,在免疫系統(tǒng)發(fā)育和維持中起著重要作用［26］。本課題組前期研究表明了Toll樣受體通路在HSV-2感染方面有重要作用［27］。

本研究通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與病毒模型組相比,知柏地黃湯組中有569個(gè)蛋白上調(diào),619個(gè)蛋白下調(diào),共1 188個(gè)差異蛋白,其中ILF3、DDX1、CD63、ITGAV、HLA-C等差異表達(dá)顯著。查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),白介素增強(qiáng)因子(ILF3)在抗病毒感染方面發(fā)揮重要作用,在病毒感染后,ILF3在細(xì)胞質(zhì)中積累并參與抗病毒天然免疫［28］。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示,知柏地黃湯組ILF3上調(diào),表明知柏地黃湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)ILF3來(lái)發(fā)揮抗HSV-2作用。整合素α-V(ITGAV)是多種蛋白的受體,研究發(fā)現(xiàn)α-Vβ6和α-Vβ8作為HSV-1進(jìn)入宿主細(xì)胞的受體,以高親和力結(jié)合gH/gL,從而影響了HSV-2的進(jìn)入途徑［29］。蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果顯示知柏地黃湯組ITGAV下調(diào),說(shuō)明知柏地黃湯可能通過(guò)調(diào)節(jié)ITGAV而發(fā)揮抗HSV-2的作用。

綜上所述,本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法篩選出知柏地黃湯抗HSV-2的核心成分與核心靶點(diǎn),知柏地黃湯可能通過(guò)槲皮素、山奈酚、豆甾醇等核心成分,作用于RELA、IL-6、TNF、IL-10等靶點(diǎn),參與調(diào)控IL、Toll樣受體、TNF等信號(hào)通路干預(yù)HSV-2的復(fù)制,體現(xiàn)了中藥復(fù)方多成分-多靶點(diǎn)-多通路協(xié)同作用的特點(diǎn)。但知柏地黃湯的核心有效成分是如何通過(guò)主要的信號(hào)通路抑制生殖器皰疹復(fù)發(fā)的機(jī)制尚不清楚,有待后續(xù)深入研究及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,為該方的臨床應(yīng)用提供的理論依據(jù)。