趙麗華,郭長磊,呂風(fēng)華

高血壓是全球心血管疾病的主要危險因素之一,近年來,高血壓的患病率有所增加,目前,它已成為一個重大的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[1]。高血壓會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損,而內(nèi)皮功能的破壞與血管舒張、氧化應(yīng)激、內(nèi)皮前炎癥和血栓前狀態(tài)相關(guān),其嚴(yán)重程度與心血管事件相關(guān)[2]。因此,了解高血壓引起內(nèi)皮功能障礙的分子機制尤為迫切。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)被定義為長度超過200個核苷酸的非蛋白編碼RNA,近年來受到研究人員的關(guān)注。研究報道,許多l(xiāng)ncRNA在內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達,它們在內(nèi)皮細(xì)胞正常功能中起重要的調(diào)節(jié)作用,lncRNA的異常表達與高血壓相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙密切相關(guān)[3]。母系表達基因3(Maternally expressed gene 3,MEG3)編碼一個lncRNA,被報道作為腫瘤抑制因子發(fā)揮著重要作用,其過表達能夠抑制細(xì)胞增殖并促進細(xì)胞凋亡[4]。有研究證實lncRNA MEG3與高血壓的進展有關(guān)[5]。微小RNA(MicroRNA,miRNA)是由18～24個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA,通過與特定mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合,負(fù)向調(diào)節(jié)基因功能,最近的研究報道,微小RNA(miRNA)表達的異常調(diào)控與大量臨床上重要的心血管疾病有關(guān)[6]。miR-142-3p作為MicroRNA家族成員之一,研究表明,miR-142-3p的表達升高會對血管造成損傷,在機體血管的生理和病理過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用[7]。到目前為止,還少有研究揭示lncRNA MEG3和miR-142-3p在高血壓誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙中的作用。因此,本研究檢測高血壓病人血清lncRNA MEG3和miR-142-3p的表達水平,以探討兩者與內(nèi)皮功能的相關(guān)性,為尋找高血壓誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙的分子生物標(biāo)志物提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究方案經(jīng)我院倫理委員會批準(zhǔn)后進行。觀察組研究對象為我院門診部2018年8月—2020年10月收治的符合《中國高血壓防治指南(2010年修訂版)》[8]診斷標(biāo)準(zhǔn)的高血壓病人,共145例,其中男79例,女66例;年齡38～80歲,病程4～15年。根據(jù)高血壓分級標(biāo)準(zhǔn)[8]將觀察組病人分為3組,輕度組(1級高血壓)45例、中度組(2級高血壓)60例和重度組(3級高血壓)40例。所有病人臨床資料完善,無先天性心臟病或其他系統(tǒng)性免疫疾病,且近2周未服用過治療藥物;排除繼發(fā)性高血壓、心律失常、意識不清的病人。對照組研究對象為同期在我院體檢的健康個體,共145人,其中男72人,女73人,年齡35～75歲。對照組與觀察組研究對象均簽署了知情同意書,且兩組性別、年齡等一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 血清采集與保存

觀察組病人(開始治療當(dāng)天)及對照組健康體檢者(體檢當(dāng)天)空腹采集5 mL靜脈血,靜置20 min,在4 ℃條件下以1 500 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min,取上層血清分裝到潔凈的收集管中,一部分用于實驗室指標(biāo)檢測,一部分儲存在-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 血清lncRNA MEG3和miR-142-3p的表達水平檢測

參照試劑盒說明書,使用TRIzol試劑(貨號:10296028,賽默飛世爾科技有限公司)從血清中提取總RNA,并通過分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳測定RNA質(zhì)量。檢測合格后每個樣品取1 μL RNA,使用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號:No.04 896866001,大連寶生物Takara有限公司)將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,按照試劑盒說明書的步驟進行。實時反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)分析,使用ABI 7700 PCR儀器(美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)和SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒(貨號:QPK-201,北京索萊寶科技有限公司)進行,反應(yīng)體系和反應(yīng)條件參照試劑盒說明書進行設(shè)定。分別以GAPDH和U6作為內(nèi)源基因,應(yīng)用2-ΔΔCt的方法計算lncRNA MEG3和miR-142-3p的RNA相對表達水平,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.3 血管內(nèi)皮相關(guān)因子檢測

血清一氧化氮(nitric oxide,NO)、血管內(nèi)皮素(endothelin-1,ET-1)、血管性血友病因子(von Willebrand Factor,vWF)表達水平的檢測均采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA),ET-1試劑盒(貨號:18016208,武漢華美生物工程有限公司),NO試劑盒(貨號:csB-F13209h,武漢華美生物工程有限公司),vWF試劑盒(貨號:mlE1405,上海酶聯(lián)生物科技有限公司),具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組臨床資料比較

不同分級高血壓病人及對照組年齡、性別、吸煙史、體質(zhì)指數(shù)(BMI)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),而各組收縮壓和舒張壓比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組臨床資料比較

2.2 觀察組和對照組血清lncRNA MEG3、miR-142-3p及血管內(nèi)皮相關(guān)因子的表達水平比較

與對照組比較,觀察組血清lncRNA MEG3和NO的表達水平下降,血清miR-142-3p mRNA、ET-1和vWF的表達水平升高(P<0.05)。詳見表3、表4。

表3 兩組血清lncRNA MEG3、miR-142-3p的mRNA相對表達量(±s)

表4 兩組血管內(nèi)皮相關(guān)因子水平比較(±s)

2.3 不同高血壓分級組血清lncRNA MEG3、miR-142-3p及血管內(nèi)皮相關(guān)因子的表達水平

血清lncRNA MEG3和NO在輕度組、中度組和重度組高血壓病人中的表達水平依次降低,血清miR-142-3p、ET-1和vWF的表達水平則依次增高(P<0.05)。詳見表5、表6。

表5 不同高血壓分級組血清lncRNA MEG3和miR-142-3p的mRNA相對表達量(±s)

表6 不同高血壓分級組血管內(nèi)皮相關(guān)因子水平比較(±s)

2.4 觀察組血清lncRNA MEG3和miR-142-3p表達、血壓與血管內(nèi)皮相關(guān)因子的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,觀察組病人的血清lncRNA MEG3表達水平與NO水平呈正相關(guān),與ET-1和vWF水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);血清miR-142-3p表達水平與NO水平呈負(fù)相關(guān),與ET-1和vWF水平呈正相關(guān)(P<0.05);收縮壓和舒張壓與NO水平呈負(fù)相關(guān),與ET-1和vWF水平呈正相關(guān)(P<0.05)。詳見表7。

表7 觀察組血清lncRNA MEG3和miR-142-3p表達、血壓與血管內(nèi)皮相關(guān)因子的相關(guān)性

2.5 觀察組血清lncRNA MEG3與miR-142-3p表達水平的相關(guān)性

進一步相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),觀察組血清lncRNA MEG3與miR-142-3p表達水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.607,P<0.05)。詳見圖1。

圖1 觀察組血清lncRNA MEG3與miR-142-3p表達水平的相關(guān)性分析

2.6 高血壓多因素Logistic回歸分析

多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示, lncRNA MEG3、NO水平降低及miR-142-3p、ET-1和vWF水平升高均是高血壓的危險因素(P<0.05)。詳見表8。

表8 影響高血壓的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

高血壓是常見的健康問題之一,其發(fā)病機制復(fù)雜,受多種因素影響。目前,已有多種藥物研發(fā)用于控制血壓,然而,由于炎癥、血管疾病等并發(fā)癥發(fā)生率高,疾病很難根除。有研究報道顯示,高血壓病人通常伴隨內(nèi)皮功能紊亂,是引起心血管疾病的關(guān)鍵原因,血管內(nèi)皮功能障礙與高血壓的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[9-10]。故篩選與高血壓和內(nèi)皮功能相關(guān)的關(guān)鍵靶點,對于臨床緩解高血壓和預(yù)防心血管疾病具有重要意義。

血管內(nèi)皮對機體穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要,血壓升高會激活內(nèi)皮細(xì)胞,引起血管活性因子釋放,導(dǎo)致高血壓發(fā)生[5]。lncRNA是一種新的RNA分子類型,越來越多的證據(jù)表明其異常表達在許多病理過程中起著關(guān)鍵作用,包括炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng),lncRNA參與了高血壓相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙,如lncRNA GAS5主要通過β-連環(huán)蛋白信號調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞功能,其在高血壓病人中下調(diào),能導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào)[11]。MEG3位于人類染色體14q32上,編碼一種lncRNA,近年來,在血管疾病和炎性疾病的進展中的作用受到關(guān)注。田艷娟等[12]發(fā)現(xiàn)IncRNA MEG3在2型糖尿病伴幽門螺桿菌(Hp)感染病人血清中表達水平降低,可能通過調(diào)節(jié)機體內(nèi)脂肪酸水平、炎性因子表達及氧化應(yīng)激水平參與2型糖尿病合并Hp感染的發(fā)生與發(fā)展。lncRNA MEG3通過調(diào)控VSMCs參與血管重構(gòu),調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞功能,Wang等[4]研究表明lncRNA MEG3參與了高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙,在高血糖的內(nèi)皮細(xì)胞模型中下調(diào),敲低lncRNA MEG3可能會加劇內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥損傷。本研究中發(fā)現(xiàn),lncRNA MEG3在高血壓病人血清中的表達水平降低,并且隨著病情的加重而逐漸降低,說明lncRNA MEG3在高血壓的發(fā)展中起到重要作用。

除lncRNA以外,大量研究證實miRNA在調(diào)節(jié)高血壓內(nèi)皮細(xì)胞功能和/或功能障礙中起到至關(guān)重要的作用[13]。高血壓病人發(fā)生血管內(nèi)皮功能障礙可能與治療前病人血清中miR-297a、miR-143的表達水平降低有關(guān)[14];之前有報道m(xù)iR-142-3p在免疫相關(guān)炎性疾病中發(fā)揮調(diào)控作用[15];Sha等[7]研究發(fā)現(xiàn),miR-142-3p在高糖誘導(dǎo)下表達上調(diào),通過抑制SPRED2介導(dǎo)的自噬促進糖尿病的發(fā)生,包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、加重細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎性因子的分泌。本研究結(jié)果顯示,相對于對照組而言,高血壓病人血清miR-142-3p的表達水平升高,并且隨著病情的加重而逐漸升高,說明miR-142-3p的表達升高與高血壓的發(fā)展緊密相關(guān)。

另有研究表明,血管內(nèi)皮指標(biāo)可在一定程度上反映疾病嚴(yán)重程度[16]。臨床上常使用NO、ET-1和vWF的水平來評價內(nèi)皮細(xì)胞功能,NO和ET-1是血管內(nèi)皮細(xì)胞中的重要活性物質(zhì),在調(diào)節(jié)血壓方面起作用,當(dāng)發(fā)生內(nèi)皮功能障礙時,體內(nèi)NO的水平下降,ET-1水平升高;vWF是一種在內(nèi)皮細(xì)胞受損中分泌較多的多聚糖蛋白,是評價機體內(nèi)皮受損的重要特異性標(biāo)志物。本研究檢測高血壓病人和對照組血清NO、ET-1和vWF水平,結(jié)果顯示,高血壓病人血清中NO水平降低,ET-1和vWF水平升高,并且3項指標(biāo)的水平均與高血壓的分級有關(guān),收縮壓和舒張壓分別與NO水平呈負(fù)相關(guān),與ET-1和vWF水平呈正相關(guān),高血壓病人的內(nèi)皮細(xì)胞功能受到損傷,高血壓與內(nèi)皮功能受損的程度有關(guān)。為了進一步了解lncRNA MEG3和miR-142-3p與內(nèi)皮功能的關(guān)系,采用Pearson法分析了兩者表達水平分別與NO、ET-1和vWF水平的相關(guān)性,結(jié)果顯示,lncRNA MEG3表達水平與NO水平正相關(guān),與ET-1和vWF水平呈負(fù)相關(guān),而miR-142-3p表達水平與NO水平呈負(fù)相關(guān),與ET-1和vWF水平呈正相關(guān),表明lncRNA MEG3和miR-142-3p在高血壓相關(guān)內(nèi)皮功能障礙病理調(diào)節(jié)中具有作用。多因素Logistic回歸分析結(jié)果也表明lncRNA MEG3、NO、miR-142-3p、ET-1和vWF均是高血壓的獨立影響因素。此外,lncRNAs和miRNAs之間的相互作用已被證明在不同的生物過程中發(fā)揮著重要作用,本研究中發(fā)現(xiàn)lncRNA MEG3與miR-142-3p的表達水平表現(xiàn)為呈負(fù)相關(guān),提示lncRNA MEG3可能通過負(fù)向調(diào)控miR-142-3p參與調(diào)節(jié)高血壓相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙。

綜上所述,高血壓病人血清中l(wèi)ncRNA MEG3表達水平降低,miR-142-3p表達水平升高,可能在高血壓的進展中具有調(diào)節(jié)作用,其表達水平能夠反映高血壓病人內(nèi)皮功能受損的程度,可能是高血壓相關(guān)的內(nèi)皮功能障礙的新型治療靶點和分子生物標(biāo)志物。