陸 鵬 陳 剛 崔夢(mèng)醒 楊逸飛 梁 驁 黃鶴群 梁 波

1安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚性病科,安徽合肥,230022;2安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,安徽合肥,230022;3安徽醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,安徽合肥,230022

X連鎖隱性遺傳性魚(yú)鱗病(OMIM 308100,X-linked ichthyosis,XLI),也被稱(chēng)為類(lèi)固醇硫酸酯酶(steroid sulfatase,STS)缺乏癥,主要由STS催化功能缺失引發(fā)[1]。XLI是遺傳性魚(yú)鱗病的第二大常見(jiàn)形式,患病率僅次于尋常型魚(yú)鱗病,全球發(fā)病率為1∶1500至1∶6000[2],好發(fā)于男性(女性多為無(wú)癥狀攜帶者),癥狀常起始于新生兒或出生后不久[3]。典型的臨床表現(xiàn)為皮屑脫落,皮膚表面干燥,軀干部位及四肢多邊形褐色鱗片,病情常冬重夏輕。由于相近的臨床皮損,XLI可與尋常型魚(yú)鱗病、銀屑病、表皮松解性魚(yú)鱗病等脫屑性皮膚病相混淆,因而,容易發(fā)生誤診或漏診[4]。

本研究收集4例漢族X(qián)LI患者外周血及臨床信息,采用全外顯子組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)基因突變情況,同時(shí)采用拷貝數(shù)變異(copy number variation, CNV)分析及目標(biāo)區(qū)域瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)FLG突變位點(diǎn)進(jìn)行Sanger 測(cè)序驗(yàn)證。

1 資料和方法

1.1 臨床資料 4例漢族男性XLI病例為安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診患者。除皮膚表現(xiàn)外無(wú)其他器官異常?；颊?來(lái)自安徽省,27歲,出生時(shí)眉弓上方及軀干輕微鱗屑,隨年齡增長(zhǎng)皮損增加,皮損主要集中于腰部及四肢,可見(jiàn)褐色脫屑,患者有一舅舅有類(lèi)似癥狀?；颊?來(lái)自安徽省,41歲,出生后四肢干燥,后泛發(fā)全身,脛前伴有抓痕,患者有一外甥有類(lèi)似癥狀?；颊?來(lái)自河北省,31歲,出生后三個(gè)月腹部出現(xiàn)魚(yú)鱗樣脫屑,后逐漸向四肢蔓延,可見(jiàn)四肢干皮樣脫屑,患者曾被診斷為尋常型魚(yú)鱗病,家中有一舅舅有類(lèi)似癥狀。患者4來(lái)自安徽省,18歲,出生后腳背有輕微脫屑,后泛發(fā)全身,冬季加重夏季緩解,現(xiàn)全身可見(jiàn)褐色多邊形鱗片樣皮損,并伴有黑褐色角化顆粒,病癥尤以膝關(guān)節(jié)和肘關(guān)節(jié)為重,該患者曾被診斷為表皮松解性魚(yú)鱗病,家族史不詳。患者1～3家系圖見(jiàn)圖1?；颊吲R床照片見(jiàn)圖2。

圖1 隱性X連鎖魚(yú)鱗病患者(1～3)家系圖,黑圓點(diǎn)為攜帶者,黑色方形為XLI患者

圖2 4例隱性X連鎖魚(yú)鱗病患者的臨床表現(xiàn),下肢可見(jiàn)褐色斑塊形魚(yú)鱗樣皮損(2a～2d分別對(duì)應(yīng)患者1～4)

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 本研究得到安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理會(huì)批準(zhǔn),并按照《赫爾辛基宣言》執(zhí)行,獲取入組4例患者簽署的知情同意書(shū),然后填寫(xiě)調(diào)查表信息并采集典型臨床照片,同時(shí)取4 mL外周靜脈血,采用FlexiGene DNA試劑盒(Qiagen,德國(guó))抽提基因組DNA。

1.2.2 全外顯子組測(cè)序 構(gòu)建DNA文庫(kù)后用探針將全部外顯子區(qū)域富集,再將外顯子文庫(kù)進(jìn)行Illumina Hiseq2000平臺(tái)高通量測(cè)序。將測(cè)序得到的bcl文件用CASAVA1.8軟件轉(zhuǎn)換為fastq文件,再將全部測(cè)序讀長(zhǎng)用BWA、Samtools和Picard軟件比對(duì)到人類(lèi)參考基因組(版本為GRCh37/hg19)上,然后用GATK系列軟件將生成的bam文件進(jìn)行局部重新比對(duì),去掉重復(fù)序列后利用其中的Haplotypecaller進(jìn)行變異檢測(cè)并導(dǎo)出vcf變異文件,最后用Annovar軟件對(duì)vcf變異文件進(jìn)行注釋。另外,通過(guò)計(jì)算各探針捕獲區(qū)域的相對(duì)平均測(cè)序深度分析CNV。

1.2.3 瓊脂糖凝膠電泳 根據(jù)STS基因參考序列設(shè)計(jì)引物,對(duì)患者及健康對(duì)照的STS基因外顯子進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分析。引物序列及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1～3。

表1 STS基因2-11號(hào)外顯子PCR擴(kuò)增引物序列

表2 PCR體系

表3 PCR條件

1.2.4 突變分析及Sanger測(cè)序 突變通過(guò)人群頻率進(jìn)行篩選,查詢(xún)ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)突變的致病性,通過(guò)scsnv、revel、Func.refGene等工具搜尋可疑突變,分析拷貝數(shù)變異。

根據(jù)外顯子測(cè)序提示FLG突變位點(diǎn)c.5368C>T設(shè)計(jì)引物,上游引物:CGGGAGACATCAGACCTTTC,下游引物:CGAGGGTCCAGTGGTAGCCA,進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 STS基因檢測(cè) CNV分析顯示患者STS基因的外顯子區(qū)域基本無(wú)讀長(zhǎng)覆蓋(見(jiàn)圖3)。患者相對(duì)平均測(cè)序深度(relative average sequencing depth, RASD)在0.4～0.6的探針覆蓋區(qū)域標(biāo)記為藍(lán)色,相對(duì)平均測(cè)序深度小于0.1的探針覆蓋區(qū)域標(biāo)為紅色。和藍(lán)色區(qū)域相比,紅色區(qū)域的相對(duì)平均測(cè)序深度基本為0,這表明紅色區(qū)域缺失?；颊吣赣HCNV分析顯示,和藍(lán)色區(qū)域相比,紅色區(qū)域相對(duì)平均測(cè)序深度降低了大約一半,這表明紅色區(qū)域存在雜合缺失。

圖3 STS基因外顯子拷貝數(shù)變異分析(3a:患者:3b:患者母親)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示4例患者STS基因10個(gè)外顯子無(wú)相應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物,健康對(duì)照擴(kuò)增出相應(yīng)大小擴(kuò)增片段。見(jiàn)圖4。

圖4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖 S2-S11:患者;C2-C11:對(duì)照

2.2 FLG基因檢測(cè) 外顯子測(cè)序顯示患者1～3未發(fā)現(xiàn)FLG基因異常,4號(hào)患者攜帶一個(gè)已報(bào)道的FLG基因無(wú)義雜合突變:c.5368C>T(p.Gln1790Ter),在4號(hào)患者及健康對(duì)照中Sanger測(cè)序證實(shí)。見(jiàn)圖5。

5a:患者4雜合突變;5b:對(duì)照野生型圖5 FLG c.5368C>T突變Sanger測(cè)序圖

3 討論

遺傳性魚(yú)鱗病是一組先天性魚(yú)鱗病,病變不只局限于皮膚,其遺傳模式包括性連鎖隱性遺傳,常染色體顯性遺傳,常染色體半顯性遺傳,常染色體隱性遺傳等。XLI為常見(jiàn)遺傳性魚(yú)鱗病,除皮膚鱗屑外,也可累及身體其他系統(tǒng)和器官,如出現(xiàn)角膜混濁、智力障礙、隱睪等癥狀,危害較大[5]。本研究的4例患者僅表現(xiàn)皮膚癥狀,但表型明顯存在差異。其中,患者3癥狀輕微,主要表現(xiàn)為脛前鱗狀皮損,余部?jī)H表現(xiàn)為干皮樣脫屑?；颊?皮損嚴(yán)重程度最高,膝蓋和關(guān)節(jié)部位可見(jiàn)污垢樣皮損,全身均覆蓋有褐色多邊形皮損。XLI與其他脫屑性疾病有相似的臨床表現(xiàn),對(duì)于不典型的XLI患者,臨床上容易發(fā)生誤診或漏診,可能被診斷為尋常型魚(yú)鱗病或角化型魚(yú)鱗病。尤為值得注意的是,嚴(yán)重型尋常型魚(yú)鱗病和輕微型XLI的表型存在交叉重疊,僅根據(jù)患者的臨床特征難以做出準(zhǔn)確診斷。本研究4例患者,有2例曾被診斷為其他疾病。因此,對(duì)性連鎖隱性魚(yú)鱗病病史的采集至關(guān)重要,同時(shí),基因檢測(cè)對(duì)可疑病例的確診不可或缺[6]。

全球范圍內(nèi),約90%XLI病例由STS基因完全缺失所致,少數(shù)患者可見(jiàn)STS基因部分缺失及點(diǎn)突變。納入本研究的4例患者均為STS基因完全缺失,與既往報(bào)道一致,這提示STS基因完全缺失可能也是我國(guó)XLI發(fā)病的主要原因。STS基因是循環(huán)膽固醇利用的關(guān)鍵基因,含有10個(gè)外顯子,編碼一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的多通道膜蛋白。STS屬于硫酸酯酶家族,水解3-β-羥基類(lèi)固醇硫酸鹽,作為雌激素,雄激素和膽固醇的代謝前提。STS功能的完整性與皮膚及其附屬器的發(fā)育和功能維持緊密相關(guān)。

此外,本研究中1例患者(患者4)出現(xiàn)FLG提前終止突變,c.5368C>T (p.Gln1790Ter)。該突變?yōu)橐阎蛔?曾在多個(gè)人群有過(guò)報(bào)道[7]。生物信息學(xué)工具SIFT及MutationTaster均預(yù)測(cè)突變效應(yīng)為“Damage”,提示為致病突變,人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳在線網(wǎng)站(OMIM)顯示該突變與特應(yīng)性皮炎及尋常型魚(yú)鱗病相關(guān)。gnomAD數(shù)據(jù)庫(kù)顯示c.5368C>T最小等位基因頻率為0.00004467,提示該突變?cè)谡Ｈ巳河幸欢ǖ臄y帶率。既往XLI患者隊(duì)列中進(jìn)行FLG突變研究主要在歐洲國(guó)家,丹麥的一項(xiàng)109例XLI患者隊(duì)列中,有66例患者做了FLG突變檢測(cè),其中23例發(fā)現(xiàn)了FLG突變(34.85%)[4],德國(guó)和澳大利亞的一項(xiàng)51例XLI患者隊(duì)列中,FLG突變的患者是9例(17.6%)[8],我們的研究中4例患者中有1例出現(xiàn)FLG突變(25%),XLI患者中FLG突變的頻率顯著高于正常對(duì)照人群,這提示FLG突變可能也是漢族X(qián)LI患者中一個(gè)常見(jiàn)的修飾因子。FLG突變與XLI的臨床嚴(yán)重程度也存在關(guān)聯(lián),在蘇格蘭的一個(gè)家族中,同父異母的哥哥和弟弟都是XLI患者,哥哥伴有FLG突變(p.Arg501Ter),表現(xiàn)出了類(lèi)似表皮松解性魚(yú)鱗病的更嚴(yán)重表型[9]。中國(guó)的一個(gè)XLS家系中STS和FLG突變(p.Ser1107SerfsTer15)的突變加重了IV表型,其他地區(qū)的病例也支持了STS和FLG突變的共同作用可能加重皮損表現(xiàn)的理論[10,11]。我們研究中,帶有FLG突變的患者表現(xiàn)出了更為嚴(yán)重的表型,膝關(guān)節(jié)有密集黑褐色角化顆粒,和既往報(bào)道結(jié)論一致。

從功能上來(lái)說(shuō),STS催化活性的缺失導(dǎo)致膽固醇硫酸鹽水解減少,從而積聚角質(zhì)層,影響角質(zhì)層脂類(lèi)組分[12]。FLG基因提前終止突變導(dǎo)致編碼的絲聚蛋白的截短和蛋白功能的不完整性[13],進(jìn)而影響角質(zhì)層中的蛋白質(zhì)組分,使得角質(zhì)層中的脂類(lèi)組分和蛋白質(zhì)組分均發(fā)生變化,從而加重皮膚屏障的損害[14]。皮膚屏障受損使皮膚防御功能下降,引發(fā)感染和炎癥反應(yīng),從而進(jìn)一步加劇遺傳性魚(yú)鱗病的臨床表型[15]。

本研究擴(kuò)展了對(duì)患者的基因型和表型的認(rèn)識(shí),FLG基因與XLI表型間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究闡明。