元超群

（新鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所，河南新鄉(xiāng) 453000）

0 引言

分子診斷技術(shù)與公共衛(wèi)生息息相關(guān)，它可以用于食品檢測(cè)、水質(zhì)監(jiān)察、微生物分析等方面，而且能夠用于癌癥篩查、疾病診斷等臨床操作[1-4]。目前的分析實(shí)驗(yàn)室和檢測(cè)機(jī)構(gòu)中通常依賴的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)、基因測(cè)序等方法較為復(fù)雜繁瑣，亟須發(fā)展通用的、簡(jiǎn)單的檢測(cè)技術(shù)和手段來(lái)進(jìn)行分子診斷。

近年來(lái)，CRISPR 系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)與探究為科研學(xué)者打開(kāi)了一扇新的大門(mén)。序列的特異性識(shí)別功能使得CRISPR 系統(tǒng)被應(yīng)用在越來(lái)越多的領(lǐng)域。最早被發(fā)現(xiàn)的是Cas9 蛋白，后來(lái)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)Cas12a 蛋白、Cas13a 蛋白、Cas14 蛋白等[5-7]。一旦Cas 蛋白復(fù)合物識(shí)別出它們的目標(biāo)DNA 或RNA 后，活性被激活，其中單鏈DNA（ssDNA）或RNA（ssRNA）底物以非特異性的方式被切割降解，這種行為被稱(chēng)作反式切割。本研究開(kāi)發(fā)出一種基于 CRISPR 系統(tǒng)和AuNPs-DNA 探針的比色檢測(cè)方法，開(kāi)發(fā)的比色檢測(cè)方法在CRISPR 系統(tǒng)的識(shí)別輔助下具有較高特異性及簡(jiǎn)便性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

所用核酸序列由上海生工公司合成；用于蛋白表達(dá)和純化的試劑與耗材由廣州萊博瑞公司提供；用于表達(dá)AsCas12a的6His-MBP-TEV-huAsCpf1 質(zhì)粒由美國(guó)麻省理工學(xué)院張峰贈(zèng)送(Addgene 質(zhì)粒#90095，RRID:Addgene_90095)；所用化學(xué)試劑均為分析純，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)中使用超純水(>18.25mΩ)。實(shí)驗(yàn)所用序列如表1 所示。

表1 基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)所使用的序列情況表

1.2 主要儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀：美國(guó)MD 公司的SpectraMax iD5 多功能酶標(biāo)儀；恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司的HH-4；桌面型迷你離心機(jī)：上海生工公司的G508010；臺(tái)式高速微量冷凍離心機(jī)：中國(guó)海爾生物醫(yī)療公司的LX-165T2R。

1.3 試驗(yàn)條件

（1）AuNPs 的合成。AuNPs 由檸檬酸鈉還原法制備。實(shí)驗(yàn)前，將所要用到的玻璃器皿浸泡在王水(濃硝酸:濃鹽酸=1:3)中30min 以上，之后用超純水沖洗干凈，烘干備用。將100mL 濃度為1mM 的氯金酸溶液加入250mL 的燒瓶中，邊攪拌邊加熱，直至溶液沸騰。待沸騰穩(wěn)定后，向燒瓶中加入10mL 濃度為38.8mM 的檸檬酸鈉溶液，并快速攪拌。幾秒鐘之內(nèi)溶液顏色由淺黃變?yōu)闊o(wú)色，并迅速變?yōu)楹谏^續(xù)攪拌加熱，溶液顏色在5min 內(nèi)經(jīng)歷從黑色到紅色的變化。20min 后停止加熱，溶液持續(xù)攪拌直至冷卻到室溫，即得到直徑為13nm 的AuNPs，AuNPs溶液在520nm 處吸收值最大，制備好的AuNPs 溶液轉(zhuǎn)入棕色瓶中4℃保存，待進(jìn)一步使用。

（2）AuNPs-DNA 探針的標(biāo)記。AuNPs-DNA 探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn)使用冷凍法進(jìn)行。具體方法為將50μL 濃度為10μM含多聚腺嘌呤標(biāo)記的DNA 探針加入1mL 濃度為5nM 的AuNPs 溶液中。溶液混勻后放置于-20℃冰箱中至少2h。待室溫下溶液解凍后，在4℃、12000r/min 條件下高速離心30min，將上清液抽吸棄去，沉淀在清洗緩沖液中重懸，此清洗步驟重復(fù)3 次。最后，在重懸緩沖液中將沉淀重懸，AuNPs-DNA 探針溶液置于棕色瓶中4℃保存。

（3）AsCas12a 蛋白蛋白的表達(dá)和純化。委托華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院周小明教授課題組進(jìn)行。

（4）基于CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的通用、可視化比色檢測(cè)。Cas12a/crRNA 反應(yīng)緩沖液為：100mM 氯化鈉、Tris-鹽酸50mM、10mM 氯化鎂、100μg/mL BSA 蛋白、pH=7.9。20μL 反應(yīng)體系中包含100nM AsCas12a 蛋白，200nM crRNA 和200nM 的基底Linker ssDNA。DNA 擴(kuò)增產(chǎn)物被添加到反應(yīng)體系中，將混合液置于37℃水浴鍋反應(yīng)20min。與60μL 的AuNPs-DNA 探針預(yù)混液混勻?；旌弦涸谑覝叵路跤?min 后，經(jīng)小型臺(tái)式離心機(jī)短暫低速離心。將上清吸至新PCR 管中，在LED 白色背光板上進(jìn)行比色分析。

2 結(jié)果與分析

研究表明，當(dāng)Cas12a 蛋白與crRNA 及其目標(biāo)DNA形成三聯(lián)復(fù)合體時(shí)，除了對(duì)目標(biāo)DNA 切割之外，還能夠?qū)⒎磻?yīng)體系內(nèi)單鏈DNA 無(wú)序裂解成2 ～4 個(gè)核苷酸片段，Cas12a 的順式切割和反式切割活性均與其RuvC 結(jié)構(gòu)域有關(guān)。同時(shí)也有研究表明，Cas13a 蛋白與crRNA 及其靶RNA 形成三聯(lián)復(fù)合體時(shí)，也有類(lèi)似切割RNA 的能力。利用Cas12a 蛋白和Cas13a 蛋白的這種依賴于靶標(biāo)的反式切割活性，本研究開(kāi)發(fā)了一種基于AuNPs-DNA 探針光學(xué)特性的新型比色檢測(cè)方法，具體原理如圖1中a圖所示。在該檢測(cè)平臺(tái)中，設(shè)計(jì)了通用的Linker ssDNA 或ssRNA 作為CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)或CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)的反式切割底物，設(shè)計(jì)一對(duì)通用的AuNPs-DNA 探針與Linker ssDNA 或ssRNA 雜交。在沒(méi)有目的靶標(biāo)存在的情況下，反式切割不會(huì)被激活，因此Linker ssDNA 或ssRNA 在反應(yīng)體系中保持完整，AuNPs-DNA 探針對(duì)將與其進(jìn)行雜交誘導(dǎo)交聯(lián)形成聚合態(tài)。當(dāng)Cas12a/crRNA 復(fù)合物和Cas13a/crRNA 復(fù)合物分別識(shí)別它們的目標(biāo)DNA 或RNA 時(shí)，反式切割被激活，Linker ssDNA 或ssRNA 被降解，AuNPs-DNA 探針對(duì)失去了雜交的Linker ssDNA或ssRNA，從而變得分散。由于AuNPs-DNA 探針的光學(xué)特性，可以通過(guò)觀察溶液顏色實(shí)現(xiàn)比色檢測(cè)。

圖1 基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的通用、可視化比色檢測(cè)方法的原理圖和工作流程

比色檢測(cè)方法原理確定之后，比色檢測(cè)方法的工作流程也被確定，如圖1 中b 圖所示。由于可以預(yù)先制備Cas蛋白/crRNA復(fù)合物、Linker ssDNA 或ssRNA 底物和AuNPs-DNA 探針對(duì)混合液，并且這些組分都適合長(zhǎng)期保存，因此整個(gè)檢測(cè)過(guò)程可以分為3 個(gè)步驟：溶液1 的制備、溶液2 的制備和裸眼比色檢測(cè)。溶液1 是將目的靶標(biāo)與Cas 蛋白/crRNA 復(fù)合物和Linker ssDNA 或ssRNA底物混合，目標(biāo)物能夠激活CRISPR/Cas 系統(tǒng)的反式切割反應(yīng)。溶液2 的制備只需將AuNPs-DNA 探針對(duì)等比例混合即可。最后將溶液1 與溶液2 混勻，孵育3min 后，經(jīng)低速離心處理，即可裸眼分析檢測(cè)結(jié)果。通過(guò)觀察溶液的顏色變化，能夠可視化分析核酸樣品的不同拷貝數(shù)。

Cas12a/crRNA 復(fù)合物和Cas13a/crRNA 復(fù)合物具有依賴于靶標(biāo)的反式切割活性。在靶標(biāo)存在的情況下，Linker ssDNA 或ssRNA 被切割裂解，AuNPs-DNA 探針對(duì)失去雜交連接，變得分散。在沒(méi)有靶標(biāo)的情況下，Linker ssDNA或ssRNA 保持完整。AuNPs-DNA 探針對(duì)與Linker ssDNA或ssRNA 的交聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致聚合。基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的通用、可視化比色檢測(cè)的工作流程：首先，在Linker ssDNA 或ssRNA 存在下，將靶標(biāo)DNA 或RNA 添加到Cas蛋白/crRNA 復(fù)合物中以制備溶液1。其次，將AuNPs-DNA 探針對(duì)等比例混合以制備溶液2。最后，進(jìn)行裸眼可視化比色檢測(cè)，通過(guò)向溶液2 中加入溶液1 見(jiàn)圖1（C），進(jìn)行低速離心完成此操作。

探究AuNPs-DNA 探針對(duì)完全交聯(lián)反應(yīng)時(shí)Linker ssDNA或ssRNA 的濃度。以Linker ssDNA 為例，測(cè)試了不同Linker ssDNA 濃度下，AuNPs-DNA 探針對(duì)的交聯(lián)反應(yīng)情況。測(cè)量不同形式下AuNPs-DNA 探針對(duì)溶液在520nm 處的吸收值情況，結(jié)果表明，當(dāng)Linker ssDNA 濃度大于30nM 時(shí)，AuNPs-DNA 探針對(duì)的交聯(lián)反應(yīng)達(dá)到飽和，使用低速離心方法處理之后，能夠觀察到非常明顯的顏色變化。當(dāng)Linker ssDNA 濃度為40nM 時(shí)，低速離心方法能夠得到足夠清晰的背景信號(hào)，信噪比顯著提高。以10ng/μL EGFP 基因作為檢測(cè)目標(biāo),在Cas12a/crRNA 復(fù)合物和40 nM 基底Linker ssDNA 的存在時(shí)，評(píng)估了CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)依賴于目標(biāo)的反式切割的反應(yīng)時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，切割Linker ssDNA 的反應(yīng)可以在20min 內(nèi)完成。最后，測(cè)試了基底Linker ssDNA 的長(zhǎng)度，對(duì)不同長(zhǎng)度的Linker ssDNA 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cas12a 蛋白沒(méi)有這種長(zhǎng)度依賴關(guān)系。考慮到較長(zhǎng)的序列可能在室溫下形成影響雜交的二級(jí)結(jié)構(gòu)，本研究選擇了一個(gè)20bp 長(zhǎng)度的Linker ssDNA。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。

圖2 基于CRISPR/Cas12a系統(tǒng)的通用、可視化比色檢測(cè)方法的條件探究

（a）低速離心法輔助裸眼可視化檢測(cè)。由于Linker ssDNA 的裂解，AuNPs-DNA 探針對(duì)失去雜交模板，從而變得高度分散。低速離心前后顏色無(wú)變化；在完整的Linker ssDNA 中，AuNPs-DNA 探針對(duì)和Linker ssDNA 之間的雜交交聯(lián)會(huì)導(dǎo)致顏色從紅色變?yōu)槠芳t，交聯(lián)物經(jīng)低速離心后沉淀在管底，溶液變得無(wú)色透明。（b）通過(guò)直接觀察顏色變化和在520nm 處測(cè)量吸收值篩選Linker ssDNA 濃度。（c）通過(guò)低速離心法篩選Linker ssDNA 濃度。（d）在低速離心處理情況下，利用AuNPs-DNA 探針對(duì)與CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)中的反式切割活性進(jìn)行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)測(cè)定。（e）在低速離心處理情況下，對(duì)AuNPs-DNA 探針對(duì)與CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)中的Linker DNA 長(zhǎng)度進(jìn)行分析。

此時(shí)，基于CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的通用、可視化基因檢測(cè)平臺(tái)的條件探究已經(jīng)完成。最終結(jié)果表明，基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的可視化檢測(cè)方法只需要20min 的孵育時(shí)間，基底Linker ssDNA 或ssRNA 濃度為40nM，長(zhǎng)度為20bp，低速離心處理之后會(huì)有較高的信噪比結(jié)果。

3 結(jié)論

基于CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)的通用、可視化基因檢測(cè)平臺(tái)的檢測(cè)流程已經(jīng)明確，待測(cè)核酸經(jīng)過(guò)擴(kuò)增后，進(jìn)行20min的CRISPR/Cas 系統(tǒng)反應(yīng)，反應(yīng)液與預(yù)混的AuNPs-DNA 探針對(duì)溶液混合，短暫室溫孵育，經(jīng)過(guò)低速離心(5000r/min)處理后進(jìn)行顏色觀察分析。目前，本研究正在積極探索其在實(shí)際樣品檢測(cè)中的表現(xiàn)。后續(xù)，將進(jìn)一步探究基于CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)的通用、可視化基因檢測(cè)平臺(tái)的檢測(cè)應(yīng)用情況以及這兩種方法在基因分型等方面的應(yīng)用。本研究所提出的這種新型檢測(cè)方法只得到一個(gè)初步的結(jié)論，需要對(duì)其不斷優(yōu)化和改進(jìn)，賦予其巨大潛力。