宋曉 張珂珂 岳克 黃晨晨 黃紹敏孫建國 郭騰飛 郭斗斗 張水清 裴敏楠

（1 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所，450002，河南鄭州；2 河南省農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，450002，河南鄭州；3 濮陽市土壤肥料工作站，457000，河南濮陽）

土壤酶和土壤微生物是土壤中多種生化反應(yīng)、物質(zhì)循環(huán)和能量代謝的重要參與者，在養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解及污染物降解方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，可以表征土壤肥力和土壤健康狀況[1-2]。根際是植物、土壤、微生物及其生長環(huán)境的一個(gè)重要銜接平臺，是根系與土壤交界的微域[3]。分析和比較不同作物的根際土壤酶活性及微生物群結(jié)構(gòu)等微生態(tài)特性，有利于從微生態(tài)學(xué)角度為作物低肥高效栽培提供理論依據(jù)。

小麥?zhǔn)俏覈匾募Z食作物之一，小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展直接關(guān)系到我國糧食安全和社會穩(wěn)定。近年來，我國小麥連年增產(chǎn)，但同時(shí)伴隨著氮肥的過量施用及肥效下降，從而影響生態(tài)環(huán)境的健康發(fā)展，導(dǎo)致土壤酸化、溫室效應(yīng)及生物多樣性喪失等一系列的生態(tài)環(huán)境問題[4-5]?；诮?jīng)濟(jì)效益和生態(tài)環(huán)境保護(hù)的雙重要求，相關(guān)學(xué)者已就小麥“肥藥雙減”問題開展了不同角度的研究。張娟娟等[6]通過不同氮效率小麥品種的氮素營養(yǎng)診斷研究發(fā)現(xiàn)，不同品種的氮吸收利用效率、根系活力及耐低氮脅迫能力不同。熊淑萍等[7]研究分析不同基因型小麥根系吸收特性與地上部氮素利用的差異發(fā)現(xiàn)，不同氮效率基因型小麥氮素吸收利用的生理機(jī)制。近年來，糧食―土壤可持續(xù)生產(chǎn)力與植物根際微生物區(qū)系的關(guān)系逐漸被關(guān)注[8-9]。董航宇[10]從根際微生態(tài)角度研究了土壤微生物、土壤酶活性與粳稻高效利用氮的關(guān)系。楊珍等[11]基于作物根際微域探究植物病害發(fā)生機(jī)理，挖掘具有潛力的微生物資源；相反，通過根際微域中的土壤酶活性和微生物多樣性也能體現(xiàn)出不同作物或者同一作物不同品種間的差異[12-13]。目前關(guān)于小麥根際土壤微生態(tài)區(qū)系的研究多集中在氮素的吸收、利用及耕作方式方面[7,14]，關(guān)于不同氮效率小麥品種的根際微生物和土壤酶活性差異的研究較少。本研究在前期氮效率篩選試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇氮效率有顯著差異的2 個(gè)基因型小麥品種，綜合分析不同氮效率小麥根系活力、根際土壤酶活性和微生物群落多樣性的差異，為小麥生產(chǎn)上的品種選擇以及土壤生產(chǎn)力的維持提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)于2018-2020 年度在河南省新鄉(xiāng)市原陽縣平原示范區(qū)河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地（全國潮土肥力和肥料效益長期監(jiān)測試驗(yàn)站，113.41°E，35.00°N）開展。該站地處黃淮海平原，處于熱帶向暖溫帶過度地帶，屬于大陸性季風(fēng)氣候，年均降水量645mm，平均日照時(shí)數(shù)12h，年均氣溫14.4℃，無霜期224d。供試土壤為潮土，土壤地力均勻，0～30cm 耕層土壤含有機(jī)質(zhì)14.39g/kg、堿解氮82.6mg/kg、有效磷14.7mg/kg、有效鉀89.9mg/kg、全氮0.88g/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置不施氮0k g/hm2（N0）和正常施氮165kg/hm2（N1）2 個(gè)供氮水平；供試品種為氮高效小麥品種許科168 和氮低效小麥品種鄭品麥8號[15]，小區(qū)隨機(jī)排列，小區(qū)面積54m2（6m×9m），行距20cm，重復(fù)3 次。氮肥為尿素（含N 46%），磷肥為磷酸二氫鈣（含P2O512%）687.5kg/hm2，鉀肥為硫酸鉀（含K2O 57%）144.74kg/hm2。氮肥按基肥:追肥=5:5 施入，追肥于返青期開溝施入，磷肥和鉀肥在播前作為基肥一次性施入，其他栽培管理措施同一般高產(chǎn)田。分別于2018 年10 月12 日和2019 年10 月14 日播種，播種量為150kg/hm2，分別于2019 年6 月1 日和2020 年6 月3 日收獲。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 根系活力 分別于返青期、拔節(jié)期、孕穗期、灌漿期和成熟期采樣后沖洗根部，取根尖處5cm 的根系，采用改良TTC 還原法測定根系活力[16]。

1.3.2 根際土壤酶活性 于小麥孕穗期每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取3 個(gè)點(diǎn)，將植株連根挖出，采用抖土法收集根際土（距離根系周圍0～5mm），于4℃條件下保存并盡快帶回實(shí)驗(yàn)室，過2mm 篩后，除去根系殘?bào)w，自然風(fēng)干過0.25mm 篩，鮮樣保存在-80℃冰箱，用于測定土壤細(xì)菌群落、β-葡萄糖苷酶（β-glocusidase，BG）、亮氨酸氨基肽酶（leucine amiopeptidase，LAP）和多酚氧化酶（POX）活性。采用微孔板熒光分析法[17]測定BG 和LAP 活性，測定原理是BG 分解底物生成對硝基苯酚，后者在400nm 有最大吸收峰；LAP 分解底物生成對硝基苯胺，后者在405nm 有最大吸收峰；采用微孔板比色法[18]測定POX 活性，測定原理是POX 可催化底物生成有色產(chǎn)物，其顯色物質(zhì)在460nm 處有最大吸收峰。3 種酶的底物見表1。根據(jù)測定原理，使用酶標(biāo)儀（Labsystems Multiskan，MS，芬蘭）在特定波長下讀取吸光值，通過測定吸光值升高速率來計(jì)算各種土壤酶活性。所得結(jié)果統(tǒng)一單位為nmol/(h?g)，即每小時(shí)每克鮮土分解相應(yīng)底物產(chǎn)生特定產(chǎn)物的物質(zhì)的量。

表1 土壤酶及其底物Table 1 Soil enzyme names and their substrates

1.3.3 微生物高通量測序 利用Illumina MiSeq 平臺（Illumina Inc.，San Diego，CA，美國）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對土壤微生物群落進(jìn)行測序[19-20]。PCR擴(kuò)增16S rRNA 基因的V3-V4 高變區(qū)，對于每個(gè)DNA 樣品，在ABI GeneAmp 9700 PCR 系統(tǒng)（Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，美國）上使用TransStart Fastpfu DNA 聚合酶對3 個(gè)重復(fù)進(jìn)行獨(dú)立的PCR 擴(kuò)增，使用AxyPrep PCR 純化試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，美國）進(jìn)行純化，并使用Illumina MiSeq 平臺進(jìn)行雙末端測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

首先使用QIIME（Quantitative Insights Into Microbial Ecology）（v1.2.1）對測序結(jié)果的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過濾，并去除嵌合體。挑出序列長度大于200bp、Barcode 和引物序列無錯(cuò)誤堿基、平均質(zhì)量得分Q≥25 的高質(zhì)量序列。采用USEARCH軟件在97%的閾值下劃分分類操作單元（OTU）。根據(jù)Silva 數(shù)據(jù)庫，比對OTU 代表序列并進(jìn)行分類。利用Mothur 軟件計(jì)算Shannon、Simpson 多樣性指數(shù)及Chao、ACE 豐富度指數(shù)，用于評價(jià)細(xì)菌α-多樣性[21]。

采用Microsoft Excel 2010 和SPSS 20.0 等軟件完成統(tǒng)計(jì)分析。采用OriginPro 8.1、Microsoft Excel 2010 與Microsoft PowerPoint 2010 完成圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮效率小麥品種根系活力差異

圖1 顯示，2 年的根系活力結(jié)果趨勢一致，許科168 和鄭品麥8 號的根系活力均隨著生育進(jìn)程呈先增加后降低的趨勢，孕穗期的根系活力最強(qiáng)。N0和N1 處理下，許科168 的根系活力均高于鄭品麥8 號；與鄭品麥8 號相比，N0 處理下，2018-2019年度返青期―成熟期許科168 的根系活力平均增加33.49%，2019-2020 年度平均增加36.15%；N1 處理下，2018-2019 年度平均增加53.59%，2019-2020年度平均增加60.66%。另外，增施氮肥提高了2個(gè)品種的根系活力，與N0 處理相比，2018-2019年度N1 處理下許科168 的根系活力平均增加了26.06%，鄭品麥8 號平均增加了9.91%。

2.2 不同氮效率小麥品種的根際土壤酶活性差異

孕穗期2 個(gè)施氮處理下不同氮效率小麥品種的根際土壤酶活性如表2 所示，許科168 的根際土壤酶活性均高于鄭品麥8 號，其中N0 處理下，BG、LAP 和POX 活性平均增幅分別為59.35%、34.43%和30.50%，且差異達(dá)顯著水平；N1 處理下平均增幅分別為9.31%、18.88%和9.05%。

表2 不同基因型小麥根際土壤酶活性的差異Table 2 Differences of soil enzyme activities in the rhizosphere of different genotypes of wheatnmol/(h?g)

2.3 不同氮效率小麥品種對根際土壤細(xì)菌α-多樣性的影響

從不同氮處理下土壤細(xì)菌α-多樣性特征（表3）可以看出，N0 處理下，氮高效小麥品種許科168 的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)均高于氮低效小麥品種鄭品麥8 號，其中Chao、ACE 和Shannon 指數(shù)達(dá)到顯著差異水平。N1 處理下，許科168 和鄭品麥8號的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)差異不顯著。

表3 不同氮效率小麥品種根際土壤細(xì)菌α-多樣性特征Table 3 Characteristics of α-diversity of rhizosphere soil bacteria in wheat varieties with different nitrogen efficiency

2.4 不同氮效率小麥品種對根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

對土壤細(xì)菌群落在門水平上進(jìn)行分類，2 個(gè)處理共含有28 個(gè)門，相對豐度大于1%的門有11 個(gè)（圖2），其中酸桿菌門、放線菌門、擬桿菌門、變形菌門和奇古菌門為優(yōu)勢門，相對豐度為84.36%～88.20%。與N0 處理相比，N1 處理下氮高效小麥品種許科168 的酸桿菌門和疣微菌門的相對豐度分別降低了38.68%和28.16%，擬桿菌門、綠灣菌門和厚壁菌門相對豐度分別增加了17.68%、66.50%和59.68%；而氮低效小麥品種鄭品麥8 號的酸桿菌門、浮霉菌門和疣微菌門則增加了62.36%、40.79%和50.18%，綠灣菌門降低了32.84%。同一處理下，2 個(gè)品種優(yōu)勢門豐度也有差異，N0 處理下，許科168 的酸酐菌門比鄭品麥8號增加了66.21%，奇古菌門降低了11.74%，N1 處理下許科168 的酸酐菌門比鄭品麥8 號降低了37.23%，奇古菌門則增加了13.30%，其他差異不明顯。

圖2 不同氮效率小麥品種的根際土壤細(xì)菌群落在門水平上的相對豐度Fig.2 Relative abundance of rhizosphere soil bacterial communities at the phylum level in wheat varieties with different nitrogen efficiency

進(jìn)一步對比分析發(fā)現(xiàn)，2 個(gè)處理共含有857 個(gè)屬，其中GP6 屬和亞硝基球藻（Nitrososphaera）為優(yōu)勢屬（圖3）。與氮低效品種鄭品麥8 號相比，N0 處理下，許科168 根際土壤的亞硝基球藻顯著增加了38.06%，GP6 屬顯著降低了21.33%；在N1處理下，許科168 根際土壤亞硝基球藻屬顯著增加了21.79%，GP6 屬降低了9.49%。

圖3 不同氮效率小麥品種的根際土壤優(yōu)勢細(xì)菌屬的相對豐度Fig.3 The relative abundance of rhizosphere soil predominant bacterial genera of wheat varieties with different nitrogen efficiency

3 討論

3.1 小麥根系活力特征

根系是植物的重要作用器官，具有固定和支撐植物的功能，影響植物對養(yǎng)分、水分和礦物質(zhì)等的吸收，同時(shí)又是多種離子、有機(jī)酸和氨基酸等合成的重要場所[22-23]。小麥屬于須根系作物，根系活力的大小一定程度反映了根系新陳代謝活動的強(qiáng)弱[12]。根系活力與作物的品種、土壤類型、肥水措施及自身基因遺傳性狀等密切相關(guān)[24-25]；它反映了作物根系吸收、合成、呼吸和氧化能力等，客觀體現(xiàn)了根系新陳代謝能力的強(qiáng)弱[26-27]。熊淑萍等[7]研究認(rèn)為，氮高效基因型小麥根系具有較高的活力及根系代謝能力。本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，不論在低氮或高氮水平下，氮高效小麥品種許科168 的根系活力均高于氮低效小麥品種鄭品麥8 號，低氮處理下差異顯著。

3.2 根際土壤酶活性特征

土壤酶是由動物、植物和微生物產(chǎn)生的[28-29]，它不僅是土壤中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)換的重要參與者，還是土壤進(jìn)行一切生化反應(yīng)的催化劑[30]。土壤酶活性的高低可以代表土壤中物質(zhì)代謝的旺盛程度，在一定程度上反映了作物對氮素的吸收利用與生長發(fā)育狀況等，是表征土壤肥力的重要指標(biāo)[31-32]。本研究結(jié)果表明，施用氮肥提高了土壤酶活性，與N0 處理相比，N1 處理下BG、LAP 和POX 活性平均增加63.63%、32.35%和13.41%，這可能是由于微生物通過同化利用這些施入的氮素能夠促進(jìn)自身的生長，導(dǎo)致產(chǎn)生的酶量和活性均顯著增加[33]。顯然，氮肥施用與土壤酶之間存在著密不可分的關(guān)系。研究[32]表明，同一氮素水平下不同氮效率品種對根際土壤酶活性的響應(yīng)也有一定的影響。本試結(jié)果表明，2 種施氮處理下，與氮低效品種鄭品麥8號相比，氮高效品種許科168 的BG、LAP 和POX活性均增加；N0 處理下增加幅度分別為59.35%、34.43%和30.50%，達(dá)到差異顯著水平；N1 處理下增加幅度分別為9.31%、18.88%和9.05%。較高的土壤酶活性代表土壤的物質(zhì)和能量轉(zhuǎn)化都很旺盛，從而促進(jìn)了植株的良好生長[34-35]，這也進(jìn)一步證實(shí)了氮高效小麥品種在低氮脅迫條件下具有良好的適應(yīng)能力[7]。

3.3 根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性特征

土壤微生物是農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中最活躍的重要成分之一，其種類豐富，數(shù)量繁多，在土壤有機(jī)質(zhì)礦化分解及腐殖酸形成中扮演重要角色。微生物多樣性和群落豐富度被視為衡量土壤肥力狀況的重要指標(biāo)[36-37]，其與作物的種類有一定的相關(guān)性[38-39]。在本研究中，基于高通量測序分析結(jié)果，不同氮肥處理間主要菌群種落基本相似，其主要差異表現(xiàn)在菌群豐度上；N0 處理下，不同氮效率小麥品種根際微生物的豐富度指數(shù)和多樣性指數(shù)存在顯著差異，N1 處理下差異不顯著，其根本原因在于不同氮效率小麥品種的根系活力和根際土壤酶活性等差異影響了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分布。N0處理下，許科168 根際土壤酸桿菌門相對豐度明顯高于鄭品麥8 號，N1 處理下表現(xiàn)相反。這可能是因?yàn)樗釛U菌門屬于貧營養(yǎng)型菌，生長速率緩慢，富集在養(yǎng)分含量較低環(huán)境中，而N0 處理下氮高效品種許科168 的根系與根際土壤的相互作用有利于根際微生物的生長，從而提高了根際土壤微生物的活性。同時(shí)，N0 處理下許科168 根際土壤奇古菌門的相對豐度明顯低于鄭品麥8 號，這可能與選擇的生育時(shí)期及土壤環(huán)境有關(guān)[40]，因?yàn)椴煌诓煌市←溒贩N吸收土壤有效氮程度不同，影響了土壤氮庫的平衡，不同程度地改變了土壤性質(zhì)，從而影響了土壤微生物群落[41]。

4 結(jié)論

不同氮效率小麥品種的根系活力存在一定差異，品種間的差異不僅存在于處理之間，也表現(xiàn)在同一處理下根際土壤酶活性及根際微生物區(qū)系上；尤其在低氮條件下，不同品種間根際土壤酶活性和根際微生物主要菌群豐度存在顯著差異。因此，氮高效小麥品種能夠增強(qiáng)土壤酶活性，提高細(xì)菌群落多樣性并改善細(xì)菌群落組成。