趙鵬鵬 李魯華 任明見 安暢 洪鼎立 李欣 徐如宏

（貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國家小麥改良中心貴州分中心，550025，貴州貴陽）

小麥（TriticumaestivumL.）是我國重要的糧食作物之一，在其生長發(fā)育過程中，會遭遇各種非生物脅迫，進(jìn)而嚴(yán)重影響產(chǎn)量與品質(zhì)。鈣調(diào)磷酸酶B 類似蛋白互作蛋白激酶（CBL-interacting protein kinase，CIPKs）是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能與鈣離子感受器——鈣調(diào)磷酸酶B 樣蛋白（calcineurin B-like protein，CBL）相互作用，形成復(fù)雜的信號傳遞系統(tǒng)/網(wǎng)絡(luò)[1]及響應(yīng)干旱[2]、高溫[3]、低溫[4]和鹽[5]等多種非生物脅迫以及應(yīng)答激素信號[6-7]。

許多植物中都發(fā)現(xiàn)CIPKs 家族基因，如水稻、擬南芥、大麥、玉米、小麥和豌豆等[8-9]。研究[2]表明，在非生物脅迫響應(yīng)方面，小麥TaCIPK2、TaCIPK27和TaCIPK23基因在擬南芥中異源過表達(dá)，可增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性。ZmCIPKHT基因的表達(dá)受高溫脅迫的顯著誘導(dǎo)，該基因的擬南芥過表達(dá)株系對高溫脅迫表現(xiàn)出耐受性[3]。CIPK7在擬南芥中與冷誘導(dǎo)的CBL1相互作用，在冷反應(yīng)中發(fā)揮作用，提升了擬南芥在冷脅迫中的耐受性[10]。CIPK24在擬南芥中過量表達(dá)提高了植物對Na+的耐受能力[11]。而OsCIPK03、OsCIPK12和OsCIPK15在水稻中過量表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株的耐寒、耐旱和耐鹽能力[12]。TaCIPK25過表達(dá)增強(qiáng)了小麥對鹽脅迫的敏感性[13]。在植物對礦質(zhì)營養(yǎng)吸收及植物生長方面，有研究[14]表明，AtCIPK23在擬南芥中通過影響鐵螯合還原酶活性參與鐵的獲取。CIPK18在NHX5 和NHX6 介導(dǎo)擬南芥Li+穩(wěn)態(tài)中起重要作用，且協(xié)同控制幼苗生長[15]。此外，有研究[16]發(fā)現(xiàn)，高濃度的蔗糖載體能夠結(jié)合到UFGT1 的特異位點(diǎn)抑制其活性，從而抑制草莓花青素的合成，而鈣/鈣調(diào)蛋白能夠特異地結(jié)合到UFGT1 與域間鏈接器部分重疊的位點(diǎn)，進(jìn)而顯著緩解底物的抑制作用。擬南芥中鈣調(diào)蛋白結(jié)合蛋白CBP60g 也能夠通過負(fù)調(diào)控花青素合成的結(jié)構(gòu)基因（CHS、CHI和DFR）及調(diào)控基因（如PAP1）抑制蔗糖誘導(dǎo)的花青素積累[17]?？芍?，鈣離子信號通路蛋白能夠通過調(diào)控蔗糖途徑參與花青素合成的生物學(xué)過程。

目前，在紫粒小麥花青素合成途徑的結(jié)構(gòu)基因方面取得了較好的研究基礎(chǔ)，然而由于小麥基因存在于不同染色體的多拷貝以及多轉(zhuǎn)錄本等現(xiàn)象，關(guān)于其他途徑如鈣離子信號途徑和植物激素信號途徑等相關(guān)基因調(diào)控花青素合成的研究較少。CIPKs 家族是鈣離子信號途徑中重要的蛋白家族，且GzCIPK7-5B基因在影響小麥籽粒花青素的相關(guān)研究鮮有報道。因此，本研究以特色小麥品種貴紫麥1 號為試驗材料，使用RT-PCR 克隆獲得GzCIPK7-5B基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析以及實時熒光定量驗證分析，為GzCIPK7-5B基因的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗以特色小麥品種貴紫麥1 號（Triticum aestivumL.cv.Guizi 1，GZ1，審定編號為黔麥2015003）為材料，種植于貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，取15d苗齡的根、莖、葉以及花后10、25、35d 的籽粒為樣品。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 從前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出GzCIPK7-5B基因，根據(jù)基因登錄號從Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫中下載目的基因核苷酸序列，使用Primer 5.0 設(shè)計特異性引物（表1），用于GzCIPK7-5B基因擴(kuò)增、RT-PCR 和熒光定量PCR，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 試驗所使用的特異性引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.2 總RNA 提取與cDNA 的合成 選取生長一致的15d 苗齡幼苗，利用植物總RNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取總RNA。分別用紫外分光光度計以及1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的濃度和質(zhì)量。選取可用的RNA 使用試劑盒（FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix，天根）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得根、莖、葉、籽粒cDNA。

1.2.3GzCIPK7-5B基因的克隆 以貴紫麥1 號15d 苗齡葉片cDNA 為模板，使用超保真DNA 聚合酶對該基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，50μL PCR 反應(yīng)體系為2×Phanta 最大緩沖液25μL、dNTP 混合物1μL、上、下游引物各2μL、超保真DNA 聚合酶1μL、DNA 模板1.5μL、ddH2O 17.5μL。擴(kuò)增程序為預(yù)變性95℃3min；變性95℃15s，退火61℃15s，延伸72℃120s，循環(huán)34 次；修復(fù)延伸72℃10min，于4℃保存。產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，條件為80V/cm 電壓，穩(wěn)定10min 后，再升高電壓到120V/cm 40min，得到目的條帶。將目的基因的PCR產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析使用在線軟件對GzCIPK7-5B基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括氨基酸多重序列比對、進(jìn)化樹構(gòu)建、蛋白的理化參數(shù)分析、磷酸化位點(diǎn)和亞細(xì)胞定位預(yù)測、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測，具體見表2。

表2 生物信息學(xué)分析軟件及用途Table 2 Softwares and usage of biological information analysis

1.2.5 表達(dá)譜分析選用貴紫麥1 號15d 幼苗的根、莖、葉和花后10d 時籽粒的cDNA，用特異性引物（表1）進(jìn)行RT-PCR 檢測GzCIPK7-5B在各組織的表達(dá)情況。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板進(jìn)行PCR 檢測。PCR 反應(yīng)體系包括DNA 模板1μL、ddH2O 4.5μL、2×TaqPCR 混合物Ⅱ12.5μL、上游引物（10μmol/L）1μL、下游引物（10μmol/L）1μL，總體積20μL。PCR 反應(yīng)條件為94℃5min；94℃30s，41.5℃30s，72℃1min 34 個循環(huán)；72℃5min；4℃進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6GzCIPK7-5B在貴紫麥1 號花青素合成重要時期相對表達(dá)量 選用貴紫麥1 號花后10、25、35d時的籽粒cDNA，用特異性引物（表1）及qRT-PCR檢測花后10、25、35d 時籽粒中GzCIPK7-5B表達(dá)情況與趨勢。反應(yīng)體系為cDNA 1μL、2×Talent qPCR 預(yù)混物(熒光染料摻入法)10μL、ddH2O 7.8μL、上游引物（10μmol/L）0.6μL、下游引物（10μmol/L）0.6μL，總體積20μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min；95℃變性15s，41.5℃退火30s，72℃延伸20s，40 個循環(huán)，每個待測樣設(shè)置3 個重復(fù)。以Actin 為內(nèi)參基因，采用2-??CT法計算目的基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GzCIPK7-5B 基因的克隆

以貴紫麥1 號15d 苗齡葉的cDNA 為模板，利用特異性引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（表1），凝膠電泳檢測（圖1）顯示，GzCIPK7-5B基因（Genebank 登錄號為TraesCS5B02G381500）在1296bp 有明顯的條帶。符合目的基因序列的長度。測序結(jié)果表明，擴(kuò)增出來的基因序列與TaCIPK7-5B一致，將其命名為GzCIPK7-5B。

圖1 GzCIPK7-5B 的PCR 擴(kuò)增電泳圖Fig.1 PCR amplification and electrophoresis of GzCIPK7-5B gene

2.2 GzCIPK7-5B 編碼蛋白理化性質(zhì)分析與亞細(xì)胞定位預(yù)測

利用在線工具ExPASy-ProtParam 對蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析。圖2 顯示，該蛋白的分子式為C2087H3370N606O596S20，等電點(diǎn)（pI）為8.82，總原子數(shù)為6679，分子量為47 128.62，帶負(fù)電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）為50，帶正電荷的氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）為55。其編碼的氨基酸數(shù)量為431 個，其中亮氨酸含量最高，為63 個，占氨基酸總數(shù)的14.6%，脂肪指數(shù)為96.68，不穩(wěn)定系數(shù)為53.83，表明此蛋白為不穩(wěn)定性蛋白。

圖2 GzCIPK7-5B 的氨基酸組成Fig.2 Amino acid composition of GzCIPK7-5B

利用Cell-PLoc2.0 進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測分析，分析結(jié)果顯示該蛋白定位在細(xì)胞核。

2.3 GzCIPK7-5B 編碼蛋白功能結(jié)構(gòu)域、信號肽與親疏水性分析

在NCBI 中利用CD search 對編碼的蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測，結(jié)果（圖3）顯示，該蛋白含有絲氨酸―蘇氨酸蛋白激酶家族保守結(jié)構(gòu)域，分別是絲氨酸―蘇氨酸蛋白激酶區(qū)和CBL 結(jié)合區(qū)即NAF結(jié)構(gòu)域，同時還具有ATP 結(jié)合區(qū)，具有CIPK 家族基因的特征。

圖3 GzCIPK7-5B 的保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.3 Prediction of amino acid conservative domain in GzCIPK7-5B

利用SingalP 5.0 Server 與SingalP 3.0 Server進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽分析。SingalP 5.0 Server 結(jié)果（圖4）顯示，編碼蛋白具有信號肽的可能性為0.0007，推測該蛋白無信號肽；SingalP 3.0 Server結(jié)果顯示，基因編碼的蛋白為非分泌蛋白（D值為0.14）。

圖4 GzCIPK7-5B 蛋白信號肽預(yù)測Fig.4 Prediction of signal peptide of GzCIPK7-5B protein

通過在線工具ProtScale 預(yù)測編碼蛋白的親疏水性，分析結(jié)果（圖5）顯示，該蛋白第213 個氨基酸表現(xiàn)最大疏水性，為2.79，第331 個氨基酸表現(xiàn)最大親水性，為-3.69，親水平均系數(shù)為-0.08，小于0，故推測編碼蛋白為親水性蛋白。

圖5 GzCIPK7-5B 蛋白親疏水性預(yù)測Fig.5 Prediction of affinity and hydrophobicity of GzCIPK7-5B protein

2.4 GzCIPK7-5B 編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域及磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

利用工具TMHMM 和NetPhos 3.1Server 對蛋白質(zhì)序列進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測（圖6），發(fā)現(xiàn)此蛋白質(zhì)無明顯的跨膜區(qū)域，說明該蛋白不具有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)功能的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)。

圖6 GzCIPK7-5B 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Prediction of transmembrane structure of GzCIPK7-5B protein

磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果（圖7）顯示，此蛋白有29 個磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（Serine）21 個、蘇氨酸（Threonine）7 個、酪氨酸（Tyrosine）1 個。其中最有可能的潛在磷酸化位點(diǎn)是第142、172、282、331、341 和381 位的絲氨酸，它們的值均高于0.95，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過標(biāo)準(zhǔn)值（0.5），同時這一結(jié)果也表明，編碼的蛋白可能通過調(diào)控相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化來實現(xiàn)其功能。

圖7 GzCIPK7-5B 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.7 Prediction of phosphorylation site of GzCIPK7-5B protein

2.5 GzCIPK7-5B 編碼蛋白二、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析

利用SOPMA 在線網(wǎng)站分析編碼蛋白的二級結(jié)構(gòu)（圖8）發(fā)現(xiàn)，該蛋白由α-螺旋（有155 個氨基酸，占35.96%）、無規(guī)則卷曲（有155 個氨基酸，占35.96%）、延伸鏈（有81 個氨基酸，占18.80%）和β-轉(zhuǎn)角（有40 個氨基酸，占9.28%）二級結(jié)構(gòu)組成。

圖8 GzCIPK7-5B 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.8 Prediction of secondary structure of GzCIPK7-5B protein

使用SWISS-MODEL 進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果（圖9）顯示，該蛋白三級結(jié)構(gòu)由1 個PDB 號為6c9d.1.A 的結(jié)構(gòu)為模板建立，6c9d.1.A 屬于KA1自抑制MARK1 激酶（絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶）的晶體結(jié)構(gòu)，序列一致性為31.34%。推測蛋白可能參與相關(guān)激酶的合成。

圖9 GzCIPK7-5B 蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.9 Prediction of tertiary structure of GzCIPK7-5B protein

2.6 GzCIPK7-5B 基因進(jìn)化樹分析與同源氨基酸序列比對

在NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲取野生二粒小麥（Triticum dicoccoides）和擬南芥（Arabidopsisthaliana）等15 個物種的CIPK 家族蛋白基因，利用MEGA7.0進(jìn)行同源性聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果（圖10）顯示，GzCIPK7-5B基因與野生二粒小麥TdCIPK7-5B、AtCIPK7-5D、TdCIPK7-5A和TaCIPK7同源性較高。利用DNAMAN 將GzCIPK7-5B與野生二粒小麥TdCIPK7-5B、節(jié)節(jié)麥AtCIPK7-5D、野生二粒小麥TdCIPK7-5A、小麥TaCIPK7和小麥TaCIPK7-5A基因的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行同源性序列比對，結(jié)果（圖11）顯示，它們的同源性分別為100.00%、99.07%、98.84%、98.61%和98.61%。綜合多重序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，可知GzCIPK7-5B在小麥中相對保守，與野生二粒小麥的TdCIPK7-5B在生物學(xué)功能上更為接近。

圖10 GzCIPK7-5B 基因的進(jìn)化樹分析Fig.10 Phylogenetic tree analysis of GzCIPK7-5B gene

圖11 GzCIPK7-5B 氨基酸多重序列比對Fig.11 Multiple sequence alignment of amino acids GzCIPK7-5B

2.7 GzCIPK7-5B 基因的表達(dá)譜分析

為了分析GzCIPK7-5B在貴紫麥1 號不同組織中的表達(dá)，取15d 苗齡幼苗的根、莖、葉以及花后10d 時的籽粒為樣品，以cDNA 為模板，Actin 為內(nèi)參基因，進(jìn)行RT-PCR 檢測。結(jié)果（圖12）顯示，GzCIPK7-5B在貴紫麥1 號的根、莖、葉、籽粒中均有表達(dá)，葉與根中表達(dá)量高于莖和籽粒。

圖12 GzCIPK7-5B 的表達(dá)譜分析Fig.12 Expression profile analysis of GzCIPK7-5B

2.8 GzCIPK7-5B 在貴紫麥1 號籽?；ㄇ嗨睾铣芍匾獣r期的相對表達(dá)量

分析前期貴紫麥1 號不同灌漿時期花青素積累的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，GzCIPK-7-5B在不同時期差異表達(dá)。為了確定GzCIPK7-5B在貴紫麥1 號籽?；ㄇ嗨睾铣芍匾獣r期的表達(dá)變化水平，取花后10、25、35d 時的籽粒為樣品進(jìn)行qRT-PCR 驗證。結(jié)果（圖13）顯示，在籽粒發(fā)育的3 個時期中，與花后10d時相比，在25d 時GzCIPK7-5B顯著升高，然后在35d 時降低，且25 和35d 時極顯著上調(diào)（P＜0.01）。

圖13 GzCIPK7-5B 在貴紫麥1 號籽粒花青素合成關(guān)鍵期的相對表達(dá)量Fig.13 Relative expression levels of GzCIPK7-5B in the critical period of anthocyanin synthesis in GZ1 grains

3 討論

作為植物中普遍存在的激酶，CIPKs 在逆境脅迫信號傳導(dǎo)中起著重要作用。它能與鈣離子感應(yīng)蛋白CBL 結(jié)合實現(xiàn)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，激活下游相關(guān)基因。CIPKs 蛋白具有2 個特定的結(jié)構(gòu)域，分別為N 端的蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域和C 端的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。其中C端含有特定的由24 個氨基酸組成的高度保守的NAF 結(jié)構(gòu)域。目前在許多植物中都鑒定出了該家族的基因，如水稻[18]、玉米[8]、擬南芥[18]和高粱[19]等。本研究中，GzCIPK7-5B具有該家族典型的N端蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域和NAF 結(jié)構(gòu)域，說明GzCIPK7-5B具有該家族的相似功能。

CIPKs 家族基因響應(yīng)多種非生物脅迫。研究[20]發(fā)現(xiàn)，干旱和高鹽脅迫顯著誘導(dǎo)小麥TaCIPK23基因的表達(dá)。谷子SiCIPK16基因在低溫脅迫下表達(dá)量呈現(xiàn)上調(diào)[21]。CIPK8基因在大豆中響應(yīng)干旱脅迫，根和葉表達(dá)量呈上調(diào)[22]。在紫花苜蓿中，不僅對干旱有響應(yīng)，還對低溫和鹽脅迫有應(yīng)答[23]。此外，CBL-CIPKs 網(wǎng)絡(luò)還參與調(diào)節(jié)礦質(zhì)元素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明，CIPK23參與調(diào)節(jié)根系對K+的吸收[24-25]，通過對高鐵還原酶活性的調(diào)節(jié)參與擬南芥對鐵的獲取[14]，還涉及通過磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)體（CHL）調(diào)節(jié)CHL 對硝酸鹽的親和力[26]。GzCIPK7-5B具有CIPKs 家族的典型特征，可能對干旱、低溫和高鹽等脅迫存在響應(yīng)以及與礦質(zhì)營養(yǎng)元素吸收有關(guān)。因此，該基因在小麥中的具體功能值得進(jìn)一步研究。

CIPKs 家族基因在植物不同組織中廣泛表達(dá)[27-28]，本研究中，貴紫麥1 號GzCIPK7-5B的表達(dá)也有一定差異，其在根、莖、葉和籽粒中均有表達(dá)，根和葉中表達(dá)水平高于莖和籽粒。可能在該時期GzCIPK7-5B對根系和葉的生長發(fā)育影響較大。GzCIPK7-5B屬于鈣離子信號通路系統(tǒng)中的鈣調(diào)磷酸酶B 類似蛋白互作蛋白激酶基因，且在貴紫麥1號籽?；ㄇ嗨厣锖铣? 個重要時期（花后10、25、35d），相比于10d，GzCIPK7-5B基因的表達(dá)量在25 和35d 時顯著上調(diào)，表明該基因與小麥籽?；ㄇ嗨氐姆e累有關(guān)。

4 結(jié)論

GzCIPK7-5B具有CIPKs 家族的典型特征。CDS 序列長1296bp，編碼431 個氨基酸，蛋白含有29 個磷酸化位點(diǎn)，無跨膜結(jié)構(gòu)，是一種無信號肽的不穩(wěn)定親水性質(zhì)的核蛋白。該基因與野生二粒小麥TdCIPK7-5B的序列相似度最高，亞細(xì)胞定位顯示該基因定位于細(xì)胞核。GzCIPK7-5B在根、莖、葉、籽粒表達(dá)具有組織特異性，在籽粒花青素合成關(guān)鍵期表達(dá)量具有顯著變化，其中在花后25 和35d表達(dá)水平較10d 時顯著升高。該結(jié)果豐富了小麥CIPK7基因資源，也為探討鈣離子信號途徑參與小麥籽?；ㄇ嗨胤e累奠定了基礎(chǔ)。