婁樹寶 楊夢平 邢金月 翟玲俠 王輝 劉春生 王立春 宋繼玲

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院克山分院/國家馬鈴薯種質(zhì)資源試管苗庫（克山），161005，黑龍江齊齊哈爾；2 青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，810016，青海西寧）

馬鈴薯是世界第三大糧食作物，種植面積僅次于小麥和水稻[1]。目前，全球有160 多個國家和地區(qū)種植馬鈴薯，中國的馬鈴薯種植面積和總產(chǎn)量均居世界首位，但單產(chǎn)沒有達(dá)到世界平均水平[2]。馬鈴薯是無性繁殖作物，生長過程中會受到病毒的侵染并且不斷積累，導(dǎo)致種薯退化減產(chǎn)。病毒病是馬鈴薯生產(chǎn)上的主要病害之一，其危害程度僅次于晚疫病，是馬鈴薯生產(chǎn)中極難解決的問題[3]。自1916 年第一個馬鈴薯病毒病被發(fā)現(xiàn)以來，目前已發(fā)現(xiàn)40 多種病毒侵染馬鈴薯，我國已報(bào)道的有16 種[4-5]。危害我國馬鈴薯生產(chǎn)的主要病毒有PVX、PVY、PVS、PVM、PVA 和PLRV，其中馬鈴薯Y 病毒（PVY）危害最為嚴(yán)重[6]。PVY是馬鈴薯生產(chǎn)中最常見的一種病毒，可引起花葉、皺縮、壞死等癥狀。它是全球分布范圍最廣、破壞性最大的馬鈴薯病毒之一，幾乎遍布所有的馬鈴薯種植區(qū)[7]。馬鈴薯感染PVY 后一般減產(chǎn)50%，當(dāng)與其他病毒復(fù)合侵染后，最高可減產(chǎn)80%[8]。馬鈴薯X 病毒（PVX）又稱普通花葉病毒，一般只產(chǎn)生輕微癥狀，產(chǎn)量損失可達(dá)10%～40%，若與PVY 或PVA 復(fù)合侵染可導(dǎo)致塊莖產(chǎn)量損失80%以上[9-10]。目前，針對馬鈴薯病毒病缺乏有效的防治措施，主要通過莖尖脫毒技術(shù)或者選育抗病毒的馬鈴薯品種，其中培育抗病毒品種是控制病毒最為簡便快捷、經(jīng)濟(jì)有效的途徑[11-12]。

篩選高抗馬鈴薯病毒病的資源，發(fā)掘抗病基因?qū)Ψ揽伛R鈴薯病毒病具有重大的意義。隨著馬鈴薯病毒病抗性基因的克隆及抗性遺傳研究發(fā)展，開發(fā)分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，篩選出具有抗性基因的馬鈴薯品種是一個快捷、精準(zhǔn)的方法[13-14]。在引起馬鈴薯病毒病的病毒中，PVY 和PVX 是危害比較嚴(yán)重的2 種病毒。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3 個PVY抗性基因Ryadg[15]、Rysto[16]和Rychc[17]，對PVY 具有極端抗性。Ryadg來源于安第斯亞種（Solanum tuberosumssp.andigena），1996 年被定位在11 號染色體的末端[18]，根據(jù)Ryadg基因開發(fā)的標(biāo)記RYSC3 在國外育種中已經(jīng)成功應(yīng)用[19-20]。Rysto是馬鈴薯抗PVY 的顯性基因，來源于S.stoloniferum[21]，該基因也定位在11 號染色體，開發(fā)的STS 標(biāo)記YES3-3B 被用于檢測Rysto基因[22]。Rychc是顯性單基因，從日本品種‘Konafubuki’中發(fā)現(xiàn)，被定位在9 號染色體的末端[23]，根據(jù)該基因開發(fā)的STS 標(biāo)記Ry186 用于檢測Rychc極端抗性[24]。Rx基因?qū)VX 具有極端抗性，可以快速地抑制病毒在最初感染的細(xì)胞中的積累[25]，Rx1來源于安第斯亞種，定位于12 號染色體上。Mori等[26]根據(jù)Rx1基因序列開發(fā)了STS 標(biāo)記Rxsp，重組率為1.3%，說明其與Rx1緊密連鎖。

常規(guī)的抗病育種選擇周期長、效率低，選育過程需要花費(fèi)大量的時(shí)間、財(cái)力和物力，但利用分子標(biāo)記輔助育種（MAS），可在育種早期進(jìn)行快速檢測，而且不受環(huán)境條件的限制，可加速育種進(jìn)程，提高育種選擇效率。本研究利用與抗PVY的基因Ryadg、Rysto、Rychc緊密連鎖的分子標(biāo)記RYSC3、YES3-3B、Ry186 和抗PVX 的基因Rx緊密連鎖的分子標(biāo)記Rxsp，對102 份主要育成品種進(jìn)行標(biāo)記檢測，目的是篩選出具有多個病毒抗性基因的馬鈴薯品種，為馬鈴薯抗病毒育種提供寶貴資源，同時(shí)為馬鈴薯分子標(biāo)記聚合育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為國家馬鈴薯種質(zhì)資源試管苗庫（克山）保存的102 份馬鈴薯種質(zhì)資源的脫毒試管苗，主要選擇國內(nèi)各育種單位近幾年登記的品種及部分野生種和原始栽培種。

1.2 馬鈴薯基因組DNA 提取

取試管苗頂部莖葉，使用天根DP-320 試劑盒提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 質(zhì)量，DNA 樣品保存于-20℃冰箱。

1.3 PCR 和電泳

分子標(biāo)記信息見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系20μL：2×TaqPCR Master Mix 10μL、正反引物各1μL、DNA 模板1μL、ddH2O 7μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?5℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，55℃～59℃退火40s，72℃延伸1min，35 個循環(huán)；72℃延伸5min，4℃保存。PCR 結(jié)束后，取4μL 擴(kuò)增產(chǎn)物與2μL 6×Loading Buffer 混勻，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察并拍照。

表1 分子標(biāo)記信息Table 1 Information of molecular markers

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 的提取

對供試的102 份材料進(jìn)行基因組DNA 的提取。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA 主帶清晰，無拖尾、降解現(xiàn)象。各樣品間DNA 濃度均勻一致，純度高，質(zhì)量好（圖1）。

圖1 DNA 濃度與質(zhì)量檢測Fig.1 Examination of DNA concentration and quality

2.2 PVX 抗性基因分子標(biāo)記Rxsp 的檢測

根據(jù)與馬鈴薯PVX 抗性基因Rx1連鎖標(biāo)記Rxsp 的擴(kuò)增結(jié)果（圖2）顯示，含Rxsp 標(biāo)記的材料可以擴(kuò)增出約1230bp 的特異性片段，102 份材料中有11 份材料含有Rxsp 標(biāo)記，占供試材料的10.78%。

圖2 部分材料Rxsp 標(biāo)記擴(kuò)增Fig.2 The PCR of Rxsp marker of part of accessions

2.3 PVY 抗性基因分子標(biāo)記RYSC3、YES3-3B、Ry186 的檢測

根據(jù)與馬鈴薯PVY 抗性基因Ryadg連鎖標(biāo)記RYSC3 的擴(kuò)增結(jié)果（圖3）顯示，含RYSC3 標(biāo)記的材料可以擴(kuò)增出約321bp 的特異性片段，102 份材料中有95 份材料含有RYSC3 標(biāo)記，占供試材料的93.14%。含YES3-3B 標(biāo)記的材料可以擴(kuò)增出約284bp 的特異性片段（圖4），102 份材料中有101 份材料含有YES3-3B 標(biāo)記，占供試材料的99.02%。含Ry186 標(biāo)記的材料可以擴(kuò)增出2～3 條帶（圖5），能夠擴(kuò)增出587bp 的片段記為含有Ry186 標(biāo)記，102 份材料中有35 份材料含有Ry186標(biāo)記，占供試材料的34.31%。

圖3 部分材料RYSC3 標(biāo)記擴(kuò)增Fig.3 The PCR of RYSC3 marker of part of accessions

圖4 部分材料YES3-3B 標(biāo)記擴(kuò)增Fig.4 The PCR of YES3-3B marker of part of accessions

圖5 部分材料Ry186 標(biāo)記擴(kuò)增Fig.5 The PCR of Ry186 marker of part of accessions

2.4 102 份馬鈴薯品種病毒抗性標(biāo)記分析

表2 列出了不同品種抗性標(biāo)記的分布情況，其中只含有1 個標(biāo)記的品種有4 個，占供試材料的3.92%；同時(shí)含有2 個標(biāo)記的品種有62 個，占供試材料的60.78%；同時(shí)含有3 個標(biāo)記的品種有30 個，占供試材料的29.41%；同時(shí)含有4 個標(biāo)記的品種有6 個，占供試材料的5.88%。

表2 不同品種抗性標(biāo)記分析Table 2 Analysis of markers of distinct varieties

3 討論

馬鈴薯是我國重要的糧菜兼用作物，但長期以來育種工作因?yàn)椴《靖腥径M(jìn)展緩慢，很多優(yōu)異材料在選種的過程中由于病毒侵染沒有及時(shí)脫毒處理而被淘汰掉，而隨著育種圃場規(guī)模的增加和病毒變異的加快，育種材料的脫毒工作日益繁重，因此，抗病毒育種在馬鈴薯育種工作中的重要性就凸顯出來。培育馬鈴薯抗病品種首先就需要擴(kuò)大遺傳背景和豐富遺傳多樣性，鑒定并篩選出抗病品種是獲得抗病親本材料的最基礎(chǔ)有效的手段之一。常規(guī)的病毒抗性鑒定方法周期長、效率低，而分子標(biāo)記輔助選擇運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)可以快速篩選出具有不同抗性標(biāo)記的材料。

本研究利用4 個與馬鈴薯病毒病抗性基因連鎖的分子標(biāo)記（Rxsp、RYSC3、YES3-3B 和Ry186）對102 份馬鈴薯品種進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，所有檢測的材料至少含有1 個抗性標(biāo)記，其中同時(shí)含2 個標(biāo)記的品種最多，同時(shí)含4 個標(biāo)記的品種只有6 份。在6 份野生種和原始栽培種中都至少含有2 個抗性標(biāo)記，說明野生種和原始栽培種中含有豐富的抗病毒基因，這些資源的利用對馬鈴薯育種工作起著決定性的作用。生產(chǎn)實(shí)踐證明，在生產(chǎn)上能夠較長期發(fā)揮作用的品種，除了品質(zhì)好、產(chǎn)量高等性狀外，抗病性好也是重要的原因，如克新1 號自1965 年開始推廣，由于高抗環(huán)腐病、抗PVY 和PLRV 并且耐旱和高產(chǎn)，到目前為止仍有較大種植面積[29]。

本研究表明，所有供試材料中含有YES3-3B標(biāo)記的品種最多，為101 份，占供試材料的99.02%，含有Rxsp 標(biāo)記的品種最少，為11 份，占供試材料的10.78%，這與黃鑫華等[30]的研究結(jié)果一致，并且檢測到隴薯10 號、冀張薯5 號和云薯401 同時(shí)含有RYSC3 和YES3-3B 標(biāo)記，內(nèi)薯7 號同時(shí)含RYSC3、YES3-3B 和Ry186 標(biāo)記，大同里外黃同時(shí)含Rxsp、RYSC3 和YES3-3B 標(biāo)記，這與黃鑫華等[30]研究結(jié)果也相符，但與白磊等[11]的研究結(jié)果不同。白磊等[11]研究認(rèn)為，隴薯10 號不含RYSC3 和Ry186 標(biāo)記、黑美人不含RYSC3 和Ry186 標(biāo)記（本研究中黑美人同時(shí)含RYSC3 和YES3-3B 標(biāo)記）、隴薯11 號只含RYSC3 標(biāo)記（本研究中隴薯11 號同時(shí)含Rxsp、RYSC3、YES3-3B 和Ry186 標(biāo)記），造成這一結(jié)果差異的原因還不清楚。本研究還檢測到克新23 號和克新25 號均含有RYSC3、YES3-3B和Ry186 標(biāo)記，2 個品種是姊妹系，基因來源于同一個父母本。

分子標(biāo)記技術(shù)作為一種輔助選擇手段，與人工接種病毒鑒定結(jié)果不能100%吻合，所以我們下一步的研究方向是對篩選出的含有多個抗性標(biāo)記的材料進(jìn)行人工接種鑒定，以確定其病毒抗性組成，并且依托國家馬鈴薯種質(zhì)資源試管苗庫（克山）平臺，加大對資源庫保存資源病毒抗性分子標(biāo)記的檢測，篩選出含有多個不同抗性標(biāo)記的材料作為親本用于聚合育種，在育種早代進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，結(jié)合產(chǎn)量、品質(zhì)等性狀綜合評價(jià)，創(chuàng)造出聚合多個抗性基因的優(yōu)異材料，提高育種效率，縮短育種年限，真正做到分子標(biāo)記輔助選擇與聚合育種有效結(jié)合。

4 結(jié)論

本研究利用抗PVY 和抗PVX 基因的分子標(biāo)記對102 份育成品種、野生種和原始栽培種進(jìn)行標(biāo)記檢測，結(jié)果表明，含有YES3-3B 標(biāo)記的材料最多，占比99.02%；含有Rxsp 標(biāo)記的材料最少，占比10.78%；只含有1個標(biāo)記的品種有4個，占比3.92%；同時(shí)含有2 個標(biāo)記的品種有62 個，占比60.78%；同時(shí)含有3 個標(biāo)記的品種有30 個，占比29.41%；同時(shí)含有4 個標(biāo)記的品種有6 個，分別是隴薯11號、S.acaule、富金、云薯105、晉薯8 號和大西洋，占供試材料的5.88%。