劉松濤 田再民 劉子剛 高志佳 張靜 賀東剛 黃智鴻 蘭鑫

（1 河北北方學(xué)院/河北省農(nóng)產(chǎn)品食品質(zhì)量安全分析檢測重點實驗室，075000，河北張家口；2 河北巡天農(nóng)業(yè)科技有限公司，075000，河北張家口；3 河北兆育種業(yè)集團有限公司，050000，河北石家莊）

玉米是我國重要的糧食作物之一，具有高產(chǎn)、適應(yīng)性廣和營養(yǎng)物質(zhì)豐富等特點，因此玉米高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位[1]。玉米生長發(fā)育過程中經(jīng)常發(fā)生倒伏現(xiàn)象，造成產(chǎn)量大幅下降，據(jù)統(tǒng)計[2-3]，倒伏可造成玉米減產(chǎn)15%～20%，導(dǎo)致我國每年玉米產(chǎn)量損失約100 萬t。玉米倒伏主要包括根倒、莖倒和莖折斷3 種形式。導(dǎo)致玉米倒伏的因素有氣候因素、種植密度、土壤質(zhì)地以及玉米株高、莖稈柔韌性和根系發(fā)達程度等自身遺傳因素[4-6]。

莖稈力學(xué)特征是影響玉米莖稈倒伏的重要因素之一，代表玉米抗倒伏能力的莖稈力學(xué)特征有莖稈拉力、抗推力、穿刺強度和壓碎強度，且與玉米抗倒伏能力呈顯著正相關(guān)[7]。莖稈顯微結(jié)構(gòu)是影響玉米莖稈抗倒伏性能的另一個重要因素，維管束數(shù)目越多、細胞表皮越厚的玉米莖稈強度越好，抗倒性越強。馮素偉等[8]對莖稈顯微結(jié)構(gòu)進行分析發(fā)現(xiàn)，莖稈顯微結(jié)構(gòu)中大維管束數(shù)量越多，玉米的抗倒能力越強。前人對玉米倒伏的研究主要集中在莖稈力學(xué)特征、形態(tài)學(xué)特征以及相應(yīng)的生理生化指標方面，在分子水平對玉米抗倒伏相關(guān)基因的挖掘的研究較少。因此，本研究以高抗倒的京農(nóng)科728、中抗倒的金農(nóng)738 和低抗倒的先玉335 為材料，在玉米抽雄期取第3 節(jié)間莖稈進行轉(zhuǎn)錄學(xué)測序，挖掘與玉米抗倒性相關(guān)的基因，為培育高產(chǎn)和高抗倒伏的玉米品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2019 年在河北省張家口市沙嶺子鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)科學(xué)院（115°05′E，40°6′N）進行，土壤質(zhì)地為壤質(zhì)土。供試玉米品種為京農(nóng)科728（JNK728，高抗倒性，H）、金農(nóng)738（JN738，中抗倒性，M）和先玉335（XY335，低抗倒性，L），試驗采取完全隨機區(qū)組設(shè)計，3 次重復(fù)，行距55cm，株距30cm，種植密度67 500 株/hm2，每個品種12 行，行長10m。在玉米抽雄期，每個小區(qū)取3 株長勢一致的玉米，取第3 節(jié)間莖稈液氮速凍后于-80℃保存待測。

1.2 玉米莖稈樣本總RNA 的提取、文庫構(gòu)建及Illumina 測序

使用康為全能型植物R N A 提取試劑盒（OminiPlant RNA Kit）提取9 個玉米莖稈樣本的總RNA。使用Qubit 2.0 熒光計測定RNA 的濃度，用Agilent 2100 生物分析儀和1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。使用Illumina 公司的TruSeqTM RNA 試劑盒（San Diego）構(gòu)建測序所需cDNA 文庫，用Agilent 2100 生物分析儀檢測文庫質(zhì)量。由武漢邁特維爾生物科技公司完成建庫測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理、比對及表達量評估

使用Illumina HiSeq 高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序，對生成的原始數(shù)據(jù)進行處理，除去低質(zhì)量讀段、含接頭或引物的讀段，利用HISAT2將高質(zhì)量讀段與參考基因組（B73 RefGen_v4）進行序列比對，獲取在參考基因組或基因上的位置信息以及測序樣品特有的序列特征信息。所有下游分析均基于與參考數(shù)據(jù)完美匹配或只有一處不匹配的讀段。采用FPKM（fragments per kilobase per million mapped reads）計算轉(zhuǎn)錄本或基因的表達水平。

1.4 差異表達基因的鑒定與功能注釋

為了鑒定與玉米莖折相關(guān)基因，用DESeq2 分別對3 個品種組間的差異表達進行分析，基因表達差異倍數(shù)在2 倍以上、且FDR＜0.05 確定為差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。為了進一步鑒定DEGs 的功能，使用Blast2GO（ https://www.blast2go.com/ ） 和 KOBAS 2.1.1(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/download.php)進行GO和代謝通路富集分析（FDR ＜0.05）；使用Venny2.1.0 構(gòu)建Venn 圖。

1.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）驗證

為了驗證RNA 測序結(jié)果的準確性，選擇10個DEGs 進行qRT-PCR 驗證。采用Primer 5 對DEGs 進行熒光定量引物設(shè)計。內(nèi)參基因為玉米GAPDH，引物信息見表1。使用Bio-Rad iQ5 熒光定量PCR 儀（Bio-RAD，美國），選用2×Fast Super EvaGreen ?qPCR Mastermix（EverbrightInc.，美國）進行熒光定量分析。反應(yīng)體系為cDNA 模板1μL、前后引物各1μL、ddH2O 7μL、2×AugeGreen TMMaster Mix 10μL。用2-ΔΔCT法[9]計算基因的相對表達量。

表1 熒光定量引物序列Table 1 The primer sequence of RT-qPCR

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果統(tǒng)計與質(zhì)量評估

用HiSeq6000 平臺對9 個玉米莖稈樣本進行雙端測序后共獲得59.26Gb 高質(zhì)量讀段，與玉米參考基因組比對后發(fā)現(xiàn)，84.84%～87.28%的高質(zhì)量讀段比對到參考基因的唯一位置，3.04%～3.58%的有效數(shù)據(jù)比對到參考基因的多個位置，Q30 和GC 含量分別高于93.90%和53.16%（表2）。其次，用主成分分析（PCA）評估樣本之間相關(guān)性，結(jié)果（圖1）表明，生物學(xué)重復(fù)之間高度相關(guān)，每個材料間明確分離。以上結(jié)果證實轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)是可靠的，可用于進一步分析。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測序樣本PCA 分析Fig.1 Principal component analysis of samples used for transcriptome sequencing

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 The summary of RNA-Seq data

2.2 差異表達基因鑒定

為了挖掘玉米抗倒伏相關(guān)基因，對3 個抗倒性不同的玉米材料進行品種間基因差異表達分析。由表3 可知，先玉335 與京農(nóng)科728 比較（L-vs-H）鑒定到差異基因最多，其中4411 個DEGs 上調(diào)表達，3368 個DEGs 下調(diào)表達。先玉335 與京農(nóng)738 比較（L-vs-M）鑒定到5373 個DEGs，包括2896 個DEGs 下調(diào)表達，2477 個DEGs上調(diào)表達。京農(nóng)738 與京農(nóng)科728 比較（M-vs-H）鑒定到4905 個DEGs，2831 個DEGs 下調(diào)表達，2074 個DEGs 上調(diào)表達。3 個比較組共鑒定到10 093 個DEGs，其中2095、769、606 個DEGs分別在L-vs-H、L-vs-M、M-vs-H 分組特異表達，1341 個DEGs 在3 個分組中共同表達（圖2）。

圖2 分組鑒定到的DEGs Venn 圖分析Fig.2 Venn diagram analysis of DEGs observed in comparison groups

表3 差異表達基因統(tǒng)計Table 3 Statistics of differentially expressed genes

2.3 DEGs GO 功能富集分析

為了探究抗倒性不同玉米品種差異表達基因的生物學(xué)功能，對鑒定到的DEGs 進行GO 功能富集分析。由圖3 可知，生物學(xué)過程分類中，L-vs-H分組顯著富集到植物型細胞壁的生物發(fā)生、光合作用、木質(zhì)素合成過程，L-vs-M 分組顯著富集到植物型次生細胞壁的生物發(fā)生，M-vs-H 分組顯著富集到次生代謝過程、細胞壁發(fā)生、苯丙素的代謝過程。分子功能分類中，L-vs-H、M-vs-H 分組顯著富集到血紅素結(jié)合、單加氧酶活性、碳水化合物結(jié)合；L-vs-M 分組顯著富集到葉綠素結(jié)合、四吡咯結(jié)合、糖基轉(zhuǎn)移酶活性。細胞成分分類中，光合體系、光合體系Ⅰ、光合體系Ⅱ在L-vs-H、L-vs-M 分組中顯著富集，非原質(zhì)體在M-vs-H 分組中顯著富集。因此，3 個玉米品種抗倒性不同可能是因為富集到相同GO 條目的DEGs 數(shù)量不同。

圖3 DEGs 的GO 富集分析Fig.3 Gene ontology(GO)enrichment analysis of DEGs

2.4 DEGs 代謝通路富集分析

為了近一步了解DEGs 的功能，對3 個分組鑒定到的DEGs 進行KEGG 代謝通路富集分析。結(jié)果（圖4）表明，L-vs-H 和M-vs-H 分組均富集到6 條代謝通路，L-vs-M 分組富集到5 條代謝通路。其中，苯丙素生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、類黃酮生物合成在L-vs-H 和M-vs-H 分組顯著富集。L-vs-M 分組中，光合作用―天線蛋白、植物―病原體相互作用、次生代謝產(chǎn)物的生物合成顯著富集。

圖4 DEGs 代謝通路富集分析Fig.4 Metabolic pathway enrichment analysis of DEGs

2.5 3 個玉米品種莖稈的顯微結(jié)構(gòu)差異

3 個玉米品種的顯微鏡可視范圍內(nèi)莖稈維管束數(shù)目、單個維管束面積、莖稈表皮細胞厚度如圖5所示。先玉335、金農(nóng)738 和京農(nóng)科728 顯微鏡可視范圍內(nèi)莖稈維管束數(shù)目分別為32、39、44 個（圖5a 和圖6a）；先玉335 單個維管束面積最小，京農(nóng)科728 單個維管束面積最大（圖5b 和圖6b）；莖稈表皮細胞厚度的順序依次為京農(nóng)科728＞金農(nóng)738＞先玉335（圖5c 和圖6c）。由此可知，京農(nóng)科728 的高抗倒性可能與較少的維管束數(shù)目、較大的單個維管束面積以及較厚的莖稈表皮細胞厚度有關(guān)。

圖5 3 個玉米品種莖稈的顯微結(jié)構(gòu)Fig.5 Microstructure of the stems of the three maize varieties

圖6 3 個玉米品種莖稈的顯微結(jié)構(gòu)Fig.6 Microstructures of the stalk of the three maize varieties

2.6 DEGs 的熒光定量驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序的準確性，通過qRT-PCR檢測了10 個已報道與莖稈抗倒相關(guān)或注釋到與莖稈抗倒相關(guān)途徑的DEGs 表達量，結(jié)果（圖7）表明，所有10 個基因的表達水平與RNA-seq 測序的結(jié)果一致，且相關(guān)系數(shù)達到0.9171，因此qRT-PCR的分析結(jié)果證實了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性。

圖7 10 個DEGs 的RNA-seq 測序結(jié)果的qRT-PCR 驗證Fig.7 The qRT-PCR validation of the RNA-seq data for the ten DEGs

3 討論

玉米在我國糧食安全戰(zhàn)略中占有重要地位，隨著玉米種植密度增加，莖稈增高，莖稈倒伏問題日益嚴重，成為限制玉米產(chǎn)量和品質(zhì)的因素之一。作物倒伏指由各種外界因素引發(fā)的植株莖稈由自然直立狀態(tài)到永久錯位的現(xiàn)象，是農(nóng)作物生產(chǎn)中存在的一個普遍性問題。導(dǎo)致作物倒伏的原因主要有遺傳、栽培管理和自然環(huán)境3 個方面，其中由作物基因型決定的遺傳因素是內(nèi)因，也是決定作物自身是否抗倒的最直接、最根本的因素[10]。植物生長處于風(fēng)、雨等自然條件的影響下，當作物的莖稈彈性不足以使彎曲的植株恢復(fù)時容易發(fā)生大面積倒伏。玉米莖稈單位面積內(nèi)維管束數(shù)目和表皮細胞厚度決定了玉米莖稈的抗壓強度，本研究通過比較分析不同玉米品種的維管束數(shù)目和表皮細胞厚度，結(jié)果表明維管束數(shù)目越多，表皮細胞越厚，玉米莖稈抗折強度越高。楊碩等[11]對玉米莖稈顯微結(jié)構(gòu)研究表明，莖稈維管束數(shù)目、大維管束數(shù)目和小維管束數(shù)目在不同環(huán)境下均與莖稈抗倒伏能力呈正相關(guān)。同樣，對水稻的研究[12]發(fā)現(xiàn)，抗倒伏能力越強的水稻，其莖壁厚，大、小維管束數(shù)目多。

莖稈抗倒伏是由多個基因控制的復(fù)雜的數(shù)量性狀，目前對于玉米莖稈抗倒伏相關(guān)基因與代謝通路的研究較少。因此，本研究對3 個抗倒性不同玉米品種進行轉(zhuǎn)錄學(xué)測序，并對DEGs 進行了GO 和KEGG 富集分析，報道了玉米抗倒伏的關(guān)鍵差異表達基因和代謝通路。木質(zhì)素是一類重要的大分子有機物質(zhì)，由類苯丙酸途徑的單體衍生形成，在維持細胞壁結(jié)構(gòu)完整性方面起著關(guān)鍵性作用，莖稈的木質(zhì)素含量越高作物的抗倒性越強[13]。木質(zhì)素合成途徑中，CoA 連接酶（4CL）引導(dǎo)光合代謝產(chǎn)物向木質(zhì)素合成途徑的流動，處于代謝分支點的位置[14]。研究[10]表明，當4CL 活性比原來提升1 倍時，木質(zhì)素含量也會相應(yīng)提高1/4。本研究中苯丙素生物合成、木聚糖生物合成過程、細胞壁生物發(fā)生和植物型次生細胞壁的生物發(fā)生在3 個分組中顯著富集，對大豆莖倒伏的研究[10]表明DEGs 也與這些功能相關(guān)。已報道的與莖倒伏相關(guān)的苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶苯丙氨酸解氨酶、肉桂酸4-羥化酶和連接植物苯丙烷復(fù)合途徑和木質(zhì)素特異生物合成途徑的4CL 顯著差異表達。推測這些顯著富集的通路和差異基因可能與玉米抗倒性相關(guān)，其功能還需進一步驗證。

4 結(jié)論

對3 個抗倒性不同的玉米品種抽雄期莖稈進行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，3 個比較組共鑒定到10 093 個DEGs，其中2095、769、606 個DEGs 分別在L-vs-H、L-vs-M 和M-vs-H 分組特異表達，1341 個DEGs在3 個分組中共同表達。GO 富集分析表明，3 個玉米品種抗倒性不同可能是因為富集到相同GO 條目的DEGs 數(shù)量不同。代謝通路富集分析表明，L-vs-H、M-vs-H 分組顯著富集到苯丙素生物合成、次生代謝產(chǎn)物的生物合成、類黃酮生物合成途徑，而L-vs-M 分組顯著富集到光合作用―天線蛋白、植物―病原體相互作用途徑，注釋到這些途徑的基因為與玉米抗倒伏相關(guān)的關(guān)鍵候選基因。莖稈的顯微結(jié)構(gòu)分析表明，京農(nóng)科728 的抗倒性強可能與莖稈維管束數(shù)目多、單個維管束面積大、莖稈表皮細胞厚有關(guān)。此外，qRT-PCR 驗證了轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果。本研究確定的關(guān)鍵基因和代謝途徑可作為未來定向克隆和下游分析研究的寶貴遺傳資源或選擇目標。