程凱凱，孫卉鎂，曹 付，雷 曉，徐傳濤，劉 蘇，李茂業(yè)*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036；2.四川省煙草公司瀘州市公司，四川 瀘州 646600）

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，在煙草種植過程中，常會(huì)受到土棲害蟲的為害[1]。小地老虎（Agrotis ipsilon）是為害煙草最為嚴(yán)重的土棲害蟲之一，其幼蟲常將煙苗咬斷，造成缺苗斷垅[2-3]?；瘜W(xué)防治是控制小地老虎為害的主要方法[4-5]。但化學(xué)殺蟲劑的高頻率使用，不但污染煙田環(huán)境，降低煙葉品質(zhì)，而且會(huì)誘導(dǎo)小地老虎產(chǎn)生抗藥性[6]。因此，亟需尋找針對小地老虎的新型綠色防控措施。

昆蟲病原真菌是一類能夠通過體壁侵染昆蟲并導(dǎo)致昆蟲死亡的真菌，在煙田害蟲的綜合防治中具有成本低、無環(huán)境污染以及害蟲不產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)[7-9]。球孢白僵菌（Beauveriabassiana）是應(yīng)用最為廣泛的昆蟲病原真菌之一，該菌對黃地老虎和蠐螬等多種土棲害蟲具有良好的防治效果[10-13]。但截至目前，有關(guān)小地老虎高毒力球孢白僵菌的報(bào)道仍然較少，限制了球孢白僵菌在小地老虎防治中的應(yīng)用。為獲得對小地老虎具有高致病力的球孢白僵菌菌株，本論文研究了9 株球孢白僵菌的生物學(xué)特性及對小地老虎幼蟲的致病力，以期為小地老虎的生物防治提供前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株、蟲源和試劑

菌株：9 株球孢白僵菌均為本實(shí)驗(yàn)室保存，菌株寄主及采集地信息見表1。

表1 供試球孢白僵菌菌株信息Table 1 Information of the tested Beauveria bassiana strains

蟲源：小地老虎于2021 年采集自四川省瀘州市敘永縣煙田，在本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)多代。小地老虎幼蟲飼喂小白菜，待其化蛹后，將蛹單頭放置于玻璃指形管中，羽化的成蟲飼喂10%（V/V）蜂蜜水。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃、相對濕度（RH）（75±5）%、光周期16 h/d。

試劑：SDAY 培養(yǎng)基（葡萄糖40 g、酵母浸出粉10 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1000 mL，高溫高壓滅菌）；吐溫-80（化學(xué)純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 菌株生物學(xué)性狀觀測

將冰箱中保存的菌株取出，用接種針挑取少量孢子接種到SDAY 培養(yǎng)基上，在（25±1）℃、（90±5）%RH、全黑暗條件下培養(yǎng)15 d。用滅菌的打孔器（孔徑6 mm）在菌落邊緣打取1 個(gè)菌碟，接種于新的SDAY 培養(yǎng)平板中央，倒置于（25±1）℃、RH（90±5）%、全黑暗條件下培養(yǎng)。接種后第12 天用十字交叉法測量菌落直徑。隨后用孔徑6 mm 的打孔器在菌落邊緣處打取菌碟4 個(gè)（十字交叉線的縱橫方向各2 個(gè)），置于滅菌的玻璃試管中，加入10 mL 0.05%（V/V）吐溫-80 水溶液，渦旋振蕩10 min，用擦鏡紙濾去菌絲，獲得孢子懸浮液。取10 μL 孢子懸浮液滴至血球計(jì)數(shù)板上，統(tǒng)計(jì)孢子數(shù)量，計(jì)算產(chǎn)孢量。將孢子懸浮液稀釋至1×106孢子/mL，吸取15 μL 滴在預(yù)先涂有一薄層SDAY 固體培養(yǎng)基的載玻片上，置于（25±1）℃、（90±5）% RH、全黑暗條件下培養(yǎng)18 h 后在光學(xué)顯微鏡下觀察5 個(gè)不同視野，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的孢子數(shù)量（芽管長度超過孢子直徑的1/2 視為萌發(fā)），計(jì)算孢子萌發(fā)率。以上試驗(yàn)均設(shè)5 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 高致病力菌株篩選

將供試菌株接種于 SDAY 培養(yǎng)平板，在（25±1）℃、（90±5）% RH、全黑暗條件下培養(yǎng)15 d。將菌絲和孢子刮下，置于0.05%（V/V）吐溫-80水溶液中，渦旋振蕩10 min，用擦鏡紙濾去菌絲，得到孢子懸浮液，并將其濃度稀釋為2×107孢子/mL。采用浸漬法[14]測定各菌株對小地老虎2 齡幼蟲的致病力：將試蟲浸入各菌株孢子懸浮液2 s 后取出，用濾紙吸去試蟲體表多余液體，移入培養(yǎng)皿中（每皿1 頭試蟲），放入（25±1）℃、（75±5）% RH、光周期16 h/d 人工氣候箱中，逐日記錄死亡蟲數(shù)，連續(xù)記錄8 d，計(jì)算致死中時(shí)間（median lethal time，LT50）。每處理設(shè)3 次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)30 頭試蟲，以0.05%（V/V）吐溫-80 水溶液處理為對照。

1.4 Bb324 菌株致死中濃度測定

將致病力最高的Bb324 菌株配制為2×104、2×105、2×106、2×107和2×108孢子/mL 共5 個(gè)濃度的孢子懸浮液，采用浸漬法（同1.3 節(jié)），測定其侵染小地老虎2 齡幼蟲造成的死亡率，計(jì)算致死中濃度（median lethal concentration，LC50）。每處理設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)30 頭試蟲，對照組為0.05%（V/V）吐溫-80 水溶液。

1.5 Bb324 侵染過程與試蟲癥狀觀察

將Bb324 菌株配制為2×108孢子/mL的懸浮液，用浸漬法（同1.3 節(jié)）侵染小地老虎2 齡幼蟲，用體視鏡每日觀測試蟲癥狀。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用WPS Office 2019 版軟件計(jì)算孢子萌發(fā)率和試蟲校正死亡率；使用DPS v9.05 軟件擬合回歸方程并計(jì)算LT50和LC50；采用Duncan 氏新復(fù)極差法分析不同處理組間的差異顯著性。計(jì)算公式為：

2 結(jié) 果

2.1 菌株形態(tài)和培養(yǎng)性狀

9 株供試球孢白僵菌的菌落和孢子粉均為白色或乳白色，在SDAY 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)主要有2種類型：粉狀菌落和疏松狀菌落（圖1）。粉狀菌落（如Bbz2 和Bb324）特點(diǎn)為菌絲較少、產(chǎn)孢早且產(chǎn)孢量大；而疏松狀菌落（如Bb03 和Bb12）特點(diǎn)為菌絲較多但產(chǎn)孢量較少。

圖1 供試球孢白僵菌菌株在SDAY 培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)Fig. 1 Colony morphology of the tested Beauveria bassiana strains on SDAY medium

由表2 可見，9 株球孢白僵菌在SDAY 培養(yǎng)基上的菌落直徑（F8,18=41.39，p<0.05）、產(chǎn)孢量（F8,27=58.00，p<0.05）和萌發(fā)率（F8,18=2.72，p<0.05）均存在顯著差異。其中Bb22 菌落生長最快，15 d菌落直徑為（53.00±1.73）mm；產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率最高的是Bbz2 菌株，其次為Bb324 菌株。

表2 供試球孢白僵菌菌株在SDAY 培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀Table 2 Cultural characteristics of the tested Beauveria bassiana strains on SDAY medium

2.2 供試菌株對小地老虎的致病力

將各菌株配制為2×107孢子/mL 的懸浮液，接種小地老虎2 齡幼蟲，計(jì)算試蟲死亡率，結(jié)果見圖2。從圖2 可以看出，9 株球孢白僵菌對小地老虎幼蟲均具有致病力，在接菌后3～6 d 試蟲死亡率快速上升，隨后趨于平穩(wěn)。接種8 d 后，不同菌株對小地老虎幼蟲的校正死亡率存在顯著差異（F9,20=17.39，p<0.0001；表3）。其中以Bb324 菌株致病力最強(qiáng)，其侵染試蟲導(dǎo)致的校正死亡率為70.37%，顯著高于其他各菌株造成的死亡率。此外，Bb324菌株的LT50最短，為4.40 d。致病力最弱的菌株為Bb22，其接種8 d 后試蟲校正死亡率最低，且LT50也最長（表3）。

圖2 不同球孢白僵菌菌株處理后小地老虎2 齡幼蟲的死亡率Fig. 2 Mortality of the second-instar larvae of Agrotis ipsilon infected by different Beauveria bassiana strains

表3 不同球孢白僵菌菌株對小地老虎2 齡幼蟲的致病力Table 3 Pathogenicity of different Beauveria bassiana strains against the second-instar larvae of Agrotis ipsilon

2.3 Bb324 菌株LC50 及其侵染試蟲癥狀

配制Bb324 菌株不同濃度孢子懸浮液，對小地老虎幼蟲進(jìn)行生物測定，結(jié)果見圖3。由圖中結(jié)果可知，隨著Bb324 孢子懸浮液濃度的增加，試蟲死亡率逐漸上升。2×108孢子/mL 處理組在接種后8 d導(dǎo)致的死亡率最高，為75.00%；2×107孢子/mL 處理組次之，死亡率為73.33%。而2×106、2×105和2×104孢子/mL 效果較差。表4 為計(jì)算得到的Bb324菌株的LC50，在接菌后8 d，該菌株LC50為2.92×107孢子/mL，顯著小于接菌后4 d 和6 d 的LC50。

圖3 不同濃度Bb324 孢子懸浮液處理后小地老虎2 齡幼蟲的死亡率Fig. 3 Mortality of different concentrations of Bb324 conidial suspension against the second-instar larvae of Agrotis ipsilon

表4 不同處理時(shí)間Bb324 菌株的致死中濃度Table 4 Median lethal concentration of Bb324 against the second-instar larvae of Agrotis ipsilon at different times

小地老虎幼蟲感染Bb324 后的癥狀如圖4 所示。感染2 d 后，試蟲身體彎曲，活動(dòng)減弱；感染3 d后，試蟲蟲體蜷縮并死亡，足部、背部和頭部均有白色菌絲長出；4 d 后蟲體干癟縮小，體表布滿菌絲，并有孢子產(chǎn)生；5 d 后體表的菌絲產(chǎn)生大量白色分生孢子。

圖4 Bb324 菌株侵染小地老虎2 齡幼蟲不同時(shí)期的癥狀Fig. 4 Symptoms of the second-instar larvae of Agrotis ipsilon after inoculation with Bb324 at different time

3 討 論

研究了9 株球孢白僵菌的生長速率、產(chǎn)孢量、孢子萌發(fā)率及對煙田小地老虎2 齡幼蟲的致病力，最終篩選出了一株具有較高致病力的Bb324 菌株。雖然目前國內(nèi)外已有少量利用球孢白僵菌防治小地老虎的報(bào)道[15-16]，但由于球孢白僵菌不同菌株之間的生物學(xué)特性以及對靶標(biāo)害蟲的致病力存在差異[17]，所以篩選小地老虎高致病性球孢白僵菌菌株仍然非常必要。本研究獲得的Bb324 菌株為煙田小地老虎的生物防治提供了新資源。

前人研究表明，球孢白僵菌的生物學(xué)性狀（如生長速率、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率等）與其對靶標(biāo)害蟲的致病力之間具有相關(guān)性[14,18]。因此在高致病力球孢白僵菌篩選中，菌株是否具有優(yōu)良的生物學(xué)性狀，是一項(xiàng)重要的考察指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，Bb324雖然生長速率并非最快，但其產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率較高，且對小地老虎的致病力最高。因此，Bb324具有良好的生物學(xué)特性，這些特性非常有利于在田間環(huán)境中高效侵染小地老虎。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，雖然Bb22 在供試9 株真菌中生長速度最快，但其對小地老虎的致病性卻最弱，這一現(xiàn)象可能與該菌株的寄主專化性有關(guān)[19]。

在試驗(yàn)中觀察到Bb324菌株侵染小地老虎幼蟲后，試蟲活力減弱，蟲體干癟縮小。這可能是由于菌絲在試蟲體內(nèi)大量增殖，破壞蟲體組織，消耗試蟲營養(yǎng)所致[20]。進(jìn)一步觀察到Bb324 菌株在小地老虎幼蟲體內(nèi)增殖一定時(shí)間后，從體壁薄弱處穿出，試蟲體表出現(xiàn)大量菌絲并產(chǎn)生大量孢子。這些新生的孢子可作為侵染源，持續(xù)控制煙田土壤中的其他小地老虎。此外，前人研究發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌除了侵染靶標(biāo)昆蟲之外，可能對同一生境中的其他種類昆蟲也具有致病效果。如莊寶龍等[10]從暗黑鰓金龜僵蟲上分離的球孢白僵菌對亞洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）和二化螟（Chilosuppressalis）等害蟲也具有很強(qiáng)的致病力；鄺灼彬等[21]報(bào)道分離自小猿葉甲的球孢白僵菌能夠侵染煙粉虱（Bemisia tabaci）、小菜蛾（Plutellaxylostella）和黃曲條跳甲（Phyllotretastriolata）。因此，本研究所篩選的Bb324 菌株可能也具有侵染蠐螬等其他煙田土棲害蟲的能力。在后續(xù)研究中，將通過試驗(yàn)對這一推測進(jìn)行證實(shí)。

需要說明的是，本研究是在室內(nèi)控制條件下進(jìn)行的，Bb324 菌株在田間環(huán)境的應(yīng)用效果還需要進(jìn)行大田防效評價(jià)。另一方面，本研究只評判了Bb324菌株對小地老虎2 齡幼蟲的致病力，今后將關(guān)注該菌株對小地老虎不同齡期幼蟲、蛹和成蟲的侵染力，為小地老虎的綠色防控提供理論指導(dǎo)。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，9 株球孢白僵菌菌株具有不同的生物學(xué)性狀，其中Bb324 菌株侵染小地老虎造成的死亡率最高，LT50也最短，并且該菌株在小地老虎僵蟲上產(chǎn)生大量孢子，可能具有持續(xù)侵染效果。本研究為開發(fā)基于Bb324菌株的小地老虎生物防治技術(shù)提供了依據(jù)。