劉 蕾，肖志鵬，周向平，肖艷松，蔡海林，李玲玲，梅斯釔，劉天波*，唐前君*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410128；2.中國(guó)煙草總公司湖南省公司，長(zhǎng)沙 410004）

煙草普通花葉病毒病（Tobacco mosaic virus，TMV）是危害煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的主要病害，每年因TMV 造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)1 億美元[1]。

目前防治煙草普通花葉病毒病的主要方法是化學(xué)防治，但生產(chǎn)中有效的抗植物病毒制劑較少，防治效果不佳，田間防效大多在50%以下[2]?；瘜W(xué)農(nóng)藥的過(guò)度使用帶來(lái)的抗藥性加劇、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染等一系列問(wèn)題受到人們普遍關(guān)注，生物防治越來(lái)越被重視[2]。利用微生物防治煙草普通花葉病毒病的研究越來(lái)越多，主要集中在生防細(xì)菌，如假單胞菌[3]、芽孢桿菌[4]以及黏質(zhì)沙雷菌等[5]。TMV能夠在土壤中存活較長(zhǎng)時(shí)間，土壤中的TMV 是重要侵染源之一，因此，從土壤中分離土著微生物防治TMV 受到研究者們的重視。岳研[6]從土壤中分離篩選到8 株對(duì)TMV 枯斑具有抑制效果的芽孢桿菌，劉濤[7]從煙草根際土壤中分離的8 株產(chǎn)鐵載體細(xì)菌能顯著抑制TMV 的發(fā)生。同時(shí)，生防菌能通過(guò)分泌次生代謝產(chǎn)物和誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性實(shí)現(xiàn)生物防治，如貝萊斯芽孢桿菌能產(chǎn)生表面活性素[8]和鐵載體[7]等次生代謝產(chǎn)物來(lái)誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗性。

本研究從煙草根際土壤中分離得到菌株BZ3，對(duì)其進(jìn)行鑒定，評(píng)價(jià)生防效果，并通過(guò)全基因組測(cè)序及基因功能分析生防菌分泌次生代謝產(chǎn)物的潛力，以期為煙草普通花葉病毒病的防控積累更多的生物資源，為后期的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 PDA 培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，去離子水定容至1 L，pH 調(diào)至7.0；LB 培養(yǎng)基：NaCl 10 g，胰蛋白胨 10 g，酵母提取物5 g，去離子水定容至1 L，pH 調(diào)至7.0（固體培養(yǎng)基則再加入15 g/L 瓊脂粉）。

1.1.2 土壤樣品 采自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草基地?zé)煵萜胀ɑㄈ~病毒病發(fā)病地區(qū)中健康植株的根際土壤。

1.1.3 毒源及煙草 供試毒源TMV 保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)實(shí)習(xí)基地溫室內(nèi)。試驗(yàn)煙草為栽培煙草云煙87 和心葉煙，在育苗基質(zhì)中培育至6 片真葉左右，備用。

1.1.4 病原菌 煙草赤星病菌（Alternaria alternata）、煙草黑脛病菌（Phytophthoranicotianae）、煙草靶斑病菌（Rhizoctoniasolani）、辣椒疫霉病菌（Phytophthoracapsica）、辣椒白絹病菌（Sclerotium rolfsii）和水稻紋枯病菌（Rhizoctoniasolani），保存于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 生防菌株的分離純化及活性檢測(cè)

1.2.1 菌株分離 采用稀釋分離法[9]從煙草根際土壤分離菌株，并將形態(tài)特征差異明顯的單菌落劃線純化3 次后，取單菌落移至5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)14 h，將50%甘油和菌液以體積比1∶1 混合，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株抑制活性篩選 分離得到的菌株于LB平板上劃線活化3 次，挑取單菌落接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 培養(yǎng)60 h（OD600約為2.0），10 000 r/min、4 ℃離心20 min，取上清液經(jīng)0.22 μm 針孔式無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾得到無(wú)菌發(fā)酵液。

稱(chēng)取1 g TMV 感病葉片，在研缽中加入適量石英砂研磨成勻漿，加0.2 mol/L 磷酸緩沖液定容至100 mL 制得TMV 接種液。參照林中正等[10]半葉枯斑法對(duì)菌株進(jìn)行活性測(cè)定，左半邊葉片接種LB 液體培養(yǎng)基與TMV 接種液1∶1 混合液為對(duì)照，右半邊葉片接種菌株無(wú)菌發(fā)酵液與TMV 接種液1∶1 混合液。每個(gè)菌株接種3 株煙株，每株接種3 片葉片。接種0.5 h 后，用無(wú)菌水將葉片表面的石英砂輕輕沖掉，并在早晚各噴無(wú)菌水一次。3 d 后統(tǒng)計(jì)枯斑數(shù)量，參照趙譽(yù)強(qiáng)等[11]方法計(jì)算抑制率。

抑制率（%）=（對(duì)照組枯斑數(shù)-處理組枯斑數(shù)）/對(duì)照組枯斑數(shù)×100%

1.3 生防菌株鑒定

1.3.1 形態(tài)學(xué)鑒定 參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。將篩選到的抑制效果最好的菌株BZ3 用劃線分離法接種到LB 平板，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察單菌落的形態(tài)特征，并進(jìn)行革蘭氏染色，干燥后顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.3.2 生理生化鑒定 參考《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[13]進(jìn)行生理生化鑒定，每個(gè)處理重復(fù)3 次，并設(shè)置空白對(duì)照。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（購(gòu)自北京全式金生物公司）方法提取細(xì)菌基因組。以基因組DNA 為模板，參考王雯麗[14]和Wang 等[15]菌株鑒定中使用的引物對(duì)27F/1492R和BS-F/BS-R 擴(kuò)增16S rRNA 和DNA 促旋酶B 亞基基因（DNA gyrase B subunit gene,gyrB）片段。擴(kuò)增程序參考Wang 等[15]的方法，將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序。利用Mega X構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)合16S rRNA 和gyrB序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)確定菌株分類(lèi)地位。

1.4 菌株BZ3 對(duì)TMV 的防效試驗(yàn)

1.4.1 溫室盆栽試驗(yàn) 設(shè)置4 個(gè)處理，分別為BZ3菌株發(fā)酵液（2.0×109cfu/mL）、20%鹽酸嗎啉胍可濕性粉劑、10%超敏蛋白微顆粒劑，無(wú)菌水為對(duì)照，農(nóng)藥的施用量均為商品推薦最佳用量，每個(gè)處理3次重復(fù)。選擇長(zhǎng)勢(shì)大小基本一致的6 葉期健康煙苗移栽到花盆，移栽時(shí)采用灌根方式處理1 次，每株5 mL。移栽7 d 后噴施處理葉片，每隔7 d 噴施1次，噴施3 次后，采用摩擦接種的方式將TMV 接種于煙草上。接種TMV 30 d 后調(diào)查發(fā)病率及病情指數(shù)，參照趙譽(yù)強(qiáng)等[11]方法計(jì)算發(fā)病率、病情指數(shù)和防治效果。

1.4.2 田間試驗(yàn) 在TMV 發(fā)病較重的龍山縣茨巖鎮(zhèn)試驗(yàn)基地，采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)30 株煙，重復(fù)3 次。處理設(shè)置、接種TMV 處理及調(diào)查統(tǒng)計(jì)方法同1.4.1。

1.5 菌株BZ3 抑菌譜測(cè)定

利用實(shí)驗(yàn)室保存的6 種病原菌對(duì)菌株BZ3 進(jìn)行廣譜抑菌能力測(cè)定。按照1.2 方法獲得菌株BZ3 的無(wú)菌發(fā)酵液，在100 mL PDA 培養(yǎng)基中加入20 mL無(wú)菌發(fā)酵液，混合均勻制成平板。將6 種病原菌分別接種于上述PDA 平板中央，以不加無(wú)菌發(fā)酵液的PDA 平板為對(duì)照，每個(gè)處理3 次重復(fù)。30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 后，測(cè)量菌落直徑，并計(jì)算抑菌率。

抑菌率(%)=（對(duì)照平板菌落直徑-處理平板菌落直徑）/對(duì)照平板菌落直徑×100

1.6 全基因組測(cè)序和功能預(yù)測(cè)

提取菌株BZ3 基因組DNA，送武漢未來(lái)組生物科技有限公司進(jìn)行全基因組測(cè)序。利用Nanopore 對(duì)菌株BZ3 基因組DNA 進(jìn)行建庫(kù)、測(cè)序。測(cè)序得到的原始reads 經(jīng)過(guò)質(zhì)控篩選、去接頭后，利用NextDenovo 進(jìn)行基因組組裝、環(huán)化，得到菌株BZ3 基因組完整序列。

利用Prodigal 2.6.3[16]預(yù)測(cè)編碼序列，利用blastx算法將基因組數(shù)據(jù)與NCBI 非冗余（NR）、COG（Clusters of Orthologous Groups）等數(shù)據(jù)庫(kù)比較，并進(jìn)行基因功能注釋分析。利用tRNAscan-SE[17]、RNAmmer[18]和antiSMASH 2.0 等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)tRNA、rRNA 以及次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與可視化分析

采用Excel 2016 和SPSS 23.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析，通過(guò)GraphPad Prism 9 和ChiPlot 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)和基因功能注釋結(jié)果進(jìn)行可視化分析；利用Proksee 進(jìn)行全基因組圖譜的繪制。

2 結(jié) 果

2.1 生防菌株的分離及其活性鑒定

從根際土壤中共分離得到菌株61 株，半葉枯斑法篩選獲得對(duì)TMV有抑制活性菌株5株（表1），其中抑制效果最好為菌株BZ3（圖1），抑制率達(dá)95.12%。

圖1 菌株BZ3 對(duì)TMV 的抑制作用Fig. 1 Antagonistic effects of strain BZ3 on TMV

表1 生防菌株對(duì)TMV 的抑制作用Table 1 The inhibitory effect of biocontrol strains on TMV

2.2 生防菌株鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 菌株BZ3 在LB 平板上初期為透明水漬狀、較為粘稠，約培養(yǎng)16 h 后為不規(guī)則的白色不透明菌落，表面有凸起褶皺，呈放射狀（圖2a）。革蘭氏染色為陽(yáng)性，菌體有鞭毛和莢膜，內(nèi)生芽孢，芽孢長(zhǎng)橢圓形，在掃描電鏡下為短桿狀，大小為（0.7～1.2） μm×（1.4～2.50）) μm（圖2b-e）。

圖2 菌株BZ3 的菌落形態(tài)(a)、革蘭氏染色(b)、莢膜染色(c)、芽孢染色(d)及電鏡觀察形態(tài)(e)Fig. 2 Colony morphology (a), gram staining (b), capsule staining (d), spore staining (e) and electron microscope observation(e)of the BZ3 strain

2.2.2 生理生化鑒定 生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。淀粉水解、革蘭氏染色、甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化和V.P試驗(yàn)呈陽(yáng)性，其他則呈陰性。

表2 菌株BZ3 的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of bacterial strain BZ3

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定 菌株BZ3 的16S rRNA 和gyrB基因序列提交至國(guó)家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心，分別獲得序列號(hào)NMDCN00016NQ和NMDCN00016NR。根據(jù)16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3），菌株 BZ3 沒(méi)有獨(dú)立分支，與枯草芽孢桿菌（OL824905.1）、解淀粉芽孢桿菌(KJ009435.1)和貝萊斯芽孢桿菌(CP026039.1)的親緣關(guān)系接近，同源性72%?；趃yrB基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4），菌株BZ3 的gyrB基因序列與貝萊斯芽孢桿菌BY6(NC CP051011.1)和LPL061(NC CP042271.1)在一個(gè)分支上，同源性100%。因此，根據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，將菌株BZ3 鑒定為貝萊斯芽孢桿菌（Bacillusvelezensis）。

圖3 基于16S rDNA 序列的菌株BZ3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree of strain BZ3 based on 16S rDNA sequence

圖4 基于gyrB 基因序列的菌株BZ3 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of strain BZ3 based on gyrB gene sequence

2.3 菌株BZ3 對(duì)TMV 的防治效果

菌株BZ3 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)TMV 有較好的防治效果，盆栽和田間的防效分別為58.97%和72.07%（表3），該防效明顯高于鹽酸嗎啉胍可濕性粉劑和超敏蛋白微顆粒劑。

表3 菌株BZ3 對(duì)TMV 的防治效果Table 3 Effects of strain BZ3 on TMV

2.4 抑菌譜測(cè)定

菌株BZ3 具有廣譜抗性，對(duì)水稻紋枯病菌、煙草靶斑病菌和煙草黑脛病菌等6 種病原菌均有拮抗作用，抑制率達(dá)到38%～100%（圖5）。

圖5 菌株BZ3 對(duì)供試病原菌的拮抗作用Fig. 5 Antagonistic effects of strain BZ3 on pathogens

2.5 全基因組測(cè)序和功能預(yù)測(cè)

2.5.1 全基因組測(cè)序分析 菌株BZ3 全基因組測(cè)序結(jié)果顯示基因組含4 條congtig，contig N50 為2 542 938 bp，GC 含量為46.5%，無(wú)不確定堿基，拼接結(jié)果完整性較好，基因組覆蓋度大于99.62%，包含3975 個(gè)蛋白編碼序列（CDSs）、146 個(gè)rRNA、39 個(gè)tRNA，以及47 個(gè)其他非編碼RNA。COG 結(jié)果分析顯示，BZ3 基因組中有72.51%的基因功能得到了注釋?zhuān)S度最大的是參與氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)代謝的基因，有343 個(gè)基因被COG 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋為未知功能基因（圖6）。

圖6 貝萊斯芽孢桿菌BZ3 的基因組圈圖Fig. 6 Circular genome map of Bacillus velezensis BZ3

2.5.2 次生代謝產(chǎn)物基因簇分析 通過(guò)antisSMASH 預(yù)測(cè)，菌株BZ3 基因組中含有18 個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)的基因簇，其中包括3 種通過(guò)非核糖體合成酶（NRPSs）合成的脂肽類(lèi)活性物質(zhì)即表面活性素（surfactin）、豐原素（fengycin）和鐵載體（bacillibactin），4 種通過(guò)聚酮合成酶（PKS）合成的聚酮類(lèi)化合物即大環(huán)素內(nèi)酯H（macrolactin H）、桿菌素（bacillaene）、地非西丁（difficidin）和丁苷菌素A/B（Butirosin A/B），以及一些未知功能的化合物。

表4 次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇注釋分析Table 4 Annotation analysis of secondary metabolite synthesis gene clusters

3 討 論

TMV 具有很強(qiáng)的抗逆性，在土壤、病葉殘?bào)w和烘烤過(guò)的煙草病葉中均能存活數(shù)年。TMV 的初侵染主要來(lái)源于土壤和田間病殘?bào)w的TMV 病毒粒子[19]，從土壤中篩選生防菌株防治TMV 受到越來(lái)越多研究者們關(guān)注。吳惠惠等[20]和郭叢等[21]從煙田土壤中篩選出對(duì)TMV 有顯著拮抗活性的熒光假單胞菌株CZ（Pseudomonasfluorescens）和惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）A3。本研究從煙草根際土壤中篩選得到貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BZ3，可以抑制TMV，具有防治TMV的潛在應(yīng)用價(jià)值。

貝萊斯芽孢桿菌是一種重要的生防菌，對(duì)TMV有較好的防效，且具有廣譜抗性。申莉莉等[4]從土壤中分離的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）by33 對(duì)TMV 的體外鈍化作用高達(dá)85.35%；厲彥芳等[22]篩選的側(cè)孢短芽孢桿菌（Brevibacilluslaterosporus）B8 菌株發(fā)酵液對(duì)TMV的抑制率為87.52%。本研究篩選的貝萊斯芽孢桿菌BZ3 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)TMV 的抑制率高達(dá)95.12%，高于解淀粉芽孢桿菌by33[4]和側(cè)孢短芽孢桿菌B8[22]。此外，菌株BZ3 發(fā)酵液對(duì)TMV 的田間防效高達(dá)72.07%，高于王盼等[23]研究的YNLP-2 菌株的田間防效，且其防治效果顯著高于生產(chǎn)上的常用藥劑鹽酸嗎啉胍和超敏蛋白。此外，菌株BZ3 具有防治真菌和細(xì)菌病害的廣譜生防潛能，其無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌、煙草靶斑病菌、煙草赤星病菌和辣椒白絹病菌等多種病菌具有優(yōu)良的拮抗效果，抑制率達(dá)83%～100%，具有廣闊的應(yīng)用前景。

貝萊斯芽孢桿菌能夠分泌脂肽類(lèi)和聚酮類(lèi)等抗生素，具有殺滅病原菌、提高植物抗性和阻礙植物病原菌對(duì)植物的侵染等作用。Long 等[24]研究發(fā)現(xiàn)表面活性素在一定濃度下，可以侵入囊泡生物（如病毒、細(xì)菌和真菌）的外層脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，并使其結(jié)構(gòu)瓦解，從而達(dá)到滅殺病原微生物的目的。劉濤等[7]發(fā)現(xiàn)鐵載體對(duì)煙草具有促生作用，能夠顯著提高煙株的抗病毒能力。Jin 等[8]和謝菁菁[25]發(fā)現(xiàn)純化的表面活性素在煙草細(xì)胞懸浮液中可觸發(fā)防御反應(yīng)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來(lái)抵抗TMV。厲彥芳等[26]研究表明側(cè)孢短芽孢桿菌產(chǎn)生的BLB8 蛋白能破壞TMV 的粒子形態(tài)，推測(cè)是芽孢桿菌產(chǎn)生了某種類(lèi)似于BLB8 蛋白的活性物質(zhì)，使TMV 結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而失去侵染能力。本研究對(duì)BZ3 全基因組測(cè)序和基因功能分析發(fā)現(xiàn)，其基因組中含有18個(gè)次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因簇，其中包括了表面活性素、豐原素、大環(huán)素內(nèi)酯和鐵載體等多種具有抑菌活性的物質(zhì)，推測(cè)菌株BZ3 產(chǎn)生了表面活性素等活性物質(zhì)，同時(shí)觸發(fā)了植物防御反應(yīng)，減弱了TMV 的侵染能力，從而對(duì)TMV 有優(yōu)良的生防效果。貝萊斯芽孢桿菌BZ3 含有多種抑菌活性的次生代謝產(chǎn)物基因簇，但本研究未對(duì)活性物質(zhì)進(jìn)一步分離純化，下一步將結(jié)合代謝組學(xué)和核磁共振等技術(shù)，進(jìn)一步分離純化和鑒定，并深入研究其抗病機(jī)理，為生防菌的開(kāi)發(fā)提供理論支撐。

4 結(jié) 論

本研究從煙草根際土壤篩選獲得對(duì)TMV 具有抑制作用的生防菌株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）BZ3，對(duì)TMV 的防效較好，抑菌譜較廣，基因組中含有多種抑菌抗病毒活性的次生代謝產(chǎn)物基因簇，具有較好的應(yīng)用前景。