呂怡穎，鄭元仙，王繼明，胡騫予，蔡憲杰，陳小龍，余 磊，黃飛燕*，韓天華

（1.昆明學(xué)院，云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，昆明 650214；2.云南省煙草公司臨滄市公司，云南 臨滄 677000；3.上海煙草集團(tuán)有限責(zé)任公司，上海 200082；4.河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，鄭州 450000；5.云南省煙草公司麗江市公司，云南 麗江 674100）

鎘（Cd）是生物體非必需且毒性很強(qiáng)的一種重金屬元素[1]。隨著工業(yè)生產(chǎn)廢物排放，農(nóng)藥化肥濫用，導(dǎo)致農(nóng)田土壤Cd 含量不斷增加。同時(shí)，Cd 因其自身攻擊性強(qiáng)、遷移性快等特性極易進(jìn)入植物體對植物細(xì)胞造成氧化損傷，進(jìn)而影響植株生長發(fā)育[2-3]。煙草作為全球廣泛種植的非糧食經(jīng)濟(jì)作物，是一種易富集Cd 的植物[4]。Cd 通過根系吸收進(jìn)入煙草體內(nèi)，隨著時(shí)間累積大部分Cd 富集在煙葉上，破壞煙葉中煙堿、氮和一些碳水化合物的平衡，嚴(yán)重降低煙葉口感和產(chǎn)量[5-6]。且長期的Cd 攝入會對人體健康帶來巨大威脅[7]。因此，減少煙葉Cd 積累是未來煙草研究的重要方向。

褪黑素（MT），一種小分子吲哚胺類化合物，又稱松果體素。最初被認(rèn)為只存在于人和動物體內(nèi)，后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)在一些植物里也存在且具有廣泛的生物學(xué)功能。它可作為植物生長調(diào)節(jié)劑促進(jìn)細(xì)胞膨大、根發(fā)育，參與開花調(diào)控等[8]，還能作為抗氧化劑增強(qiáng)植物對干旱、鹽、低溫、重金屬等脅迫的抗性[9-12]。現(xiàn)有研究表明，褪黑素可通過提高POD、SOD、CAT 等抗氧化酶活性來減少過氧化氫、MDA的含量，減輕低溫脅迫給植物馬鈴薯幼苗造成的傷害，進(jìn)而提高馬鈴薯幼苗抗低溫脅迫的能力[13]；可增大根冠比，提高根系對水分及養(yǎng)分的吸收能力，緩解干旱脅迫對苦蕎幼苗的傷害[14]；可增強(qiáng)脫氫抗壞血酸還原酶、抗壞血酸過氧化酶及谷胱甘肽還原酶活性，提高可溶性蛋白、可溶性糖含量，進(jìn)而提高小黑麥的滲透調(diào)節(jié)能力和抗氧化能力，以促進(jìn)鹽堿脅迫下小黑麥種子的萌發(fā)和幼苗生長[15]。然而不同濃度褪黑素緩解脅迫能力不盡相同。蔣希瑤等[16]發(fā)現(xiàn)在60 mmol/L 堿脅迫下，噴施200 μmol/L MT處理對植物生長發(fā)育形態(tài)指標(biāo)緩解效果最為顯著，而劉躍威等[17]發(fā)現(xiàn)100 μmol/L MT 緩解寶島蕉幼苗鹽毒害能力最強(qiáng)。本研究旨在探討Cd 脅迫對煙草生長發(fā)育的影響及葉面噴施不同濃度褪黑素對煙草云煙100 中Cd 脅迫的緩解效應(yīng)，以期為煙草抗逆性研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2022 年3 月在昆明學(xué)院云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行，人工氣候培養(yǎng)箱條件為光強(qiáng)6000 lx，28 ℃/24 ℃（12 h晝/12 h 夜），相對濕度75%，照光12 h/d。

1.2 試驗(yàn)材料

供試煙草品種為云煙100，由昆明學(xué)院云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心提供。褪黑素購于上海麥克林生化科技有限公司。氯化鎘購于上海金山亭新化工試劑廠。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

挑選經(jīng)消毒浸種的飽滿煙草種子，放置育苗盤中發(fā)芽，當(dāng)煙苗長至2 片真葉時(shí)，洗凈根部后移入盛有1/2 霍格蘭氏（Hoagland’s）營養(yǎng)液的植物水培盒（長127 mm，寬87 mm，高114 mm；孔徑6.3 mm）中，每盆定植6 株，置于人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)緩苗3 d后，選取長勢大致相同的煙草幼苗進(jìn)行試驗(yàn)處理。

1.3.1 不同濃度Cd 脅迫對煙草幼苗生長發(fā)育的影響 試驗(yàn)采用水培法，設(shè)置5 個(gè)Cd 處理濃度：0（CK）、50、100、150、200 μmol/L。以氯化鎘水合物（CdCl2·2.5 H2O）作為鎘源，加入去離子水溶解成0.1 mol/L 的Cd 溶液備用，試驗(yàn)過程中加入Hoagland’s 營養(yǎng)液中稀釋至目標(biāo)濃度。每個(gè)處理設(shè)置兩個(gè)水培盒，每個(gè)水培盒8000 mL 處理液，6 株幼苗，每3 d 更換1 次處理液，處理14 d 后測定農(nóng)藝性狀和SPAD 值，對地上部鮮煙葉進(jìn)行取樣，測定其生理生化指標(biāo)和Cd 含量。

1.3.2 外源MT 預(yù)處理對Cd 脅迫下煙草幼苗生長發(fā)育的影響 在不同Cd 脅迫試驗(yàn)中觀察到100μmol/L 的Cd 能抑制煙草生長且抑制效果與150、200 μmol/L 無顯著差異，所以褪黑素處理以100μmol/L Cd 脅迫為目標(biāo)濃度設(shè)置6 個(gè)處理：無Cd營養(yǎng)液培養(yǎng)+葉面噴施清水為對照處理（CK）；100μmol/L Cd 脅迫+葉面噴施清水（Cd100）；100μmol/L Cd 脅迫+葉面噴施 10 μmol/L MT（10MT）;100 μmol/L Cd 脅迫+葉面噴施50 μmol/L MT（50MT）；100 μmol/L Cd 脅迫+葉面噴施100μmol/L MT（100MT）；100 μmol/L Cd 脅迫+葉面噴施200 μmol/L MT（200MT）。先用上述不同濃度的MT 處理液噴施煙苗，每盆每次噴施15 mL，噴至正反兩面葉片均勻布滿水滴為宜，連續(xù)噴施3 d 后進(jìn)行Cd 處理；Cd 處理14 d 后測定農(nóng)藝性狀和SPAD值，按照1.3.1 方法取樣測定生理生化指標(biāo)和Cd含量。

1.4 測定項(xiàng)目與方法

1.4.1 煙草農(nóng)藝性狀的測定 煙草幼苗根長、最大葉長、最大葉寬、株高用直尺測定；鮮質(zhì)量用千分之一天平稱量。

1.4.2 SPAD值的測定 于9:30—10:00使用手持葉綠素儀（SPAD-502Plus，Konica Minolta）進(jìn)行測定。

1.4.3 生理生化指標(biāo)測定 丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）、可溶性蛋白（SP）含量和過氧化氫酶（CAT）過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定均按照相關(guān)試劑盒（蘇州科銘生物技術(shù)有限公司）說明書提取并測定。

1.4.4 葉片Cd 含量測定 稱取0.1 g 干燥煙草葉片樣品加入5 mL HNO3，140 ℃消解至透明，將透明溶液用細(xì)菌過濾器過濾至新管并定容至25 mL，混勻備用，同時(shí)做試劑空白。用ICP-MS 測定葉片Cd2+含量（ICAPQ01937, Thermo Fisher Scientific, USA），具體操作方法見文獻(xiàn)[18]。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2019 和SPSS 22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用GraphPad Prism 8.0.2 作圖。并采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan 法進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗(yàn)（p<0.05）。

2 結(jié) 果

2.1 不同Cd 濃度對煙草幼苗生長發(fā)育的影響

2.1.1 對煙草幼苗生長的影響 表1 結(jié)果顯示，不同Cd 處理對煙草幼苗生長的影響程度不同。與對照相比，Cd 脅迫下煙草幼苗根長、鮮質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬、株高顯著下降。且隨著Cd 濃度的增加抑制程度增加，在200 μmol/L Cd 脅迫時(shí)抑制程度最大，其根長、鮮質(zhì)量僅為對照的19.60%、15.86%；最大葉長、最大葉寬和株高為對照的29.01%、50.96%、22.86%。表明Cd 脅迫抑制了煙草的生長，減少了煙草生物量積累。

表1 不同Cd 濃度對煙草幼苗農(nóng)藝性狀的影響Table 1 The effect of different cadmium concentrations on agronomic characters of tobacco seedlings

2.1.2 對煙葉SPAD 值的影響 如圖1 所示，50、100、150、200 μmol/L Cd 顯著降低了煙草SPAD 值，分別為CK 的69.62%、50.30%、45.67%、34.41%。說明Cd 脅迫能顯著減少煙葉葉綠素含量，抑制葉片光合色素的形成。

圖1 不同Cd 脅迫對煙草幼苗SPAD 值的影響Fig. 1 Effects of different cadmium stress on SPAD value of tobacco seedlings

2.1.3 對煙葉MDA 含量的影響 結(jié)果顯示（圖2），Cd 脅迫顯著增加了MDA 含量，50、100、150、200 μmol/L Cd處理的MDA含量分別為CK的1.57、2.47、5.59、5.45 倍。說明Cd 脅迫加劇了煙草幼苗膜脂過氧化。

圖2 不同Cd 脅迫對煙草幼苗MDA 含量的影響Fig. 2 Effects of different cadmium stress on MDA content of tobacco seedlings

2.1.4 對煙葉抗氧化酶的影響 由圖3 可知，Cd脅迫顯著增加了煙葉中SOD、POD 活性，提高了GSH 含量，且隨著Cd 濃度的增加，抗氧化酶活性逐漸增加。與無Cd 處理相比，50、100、150、200 μmol/L Cd 處理下煙葉 SOD 活性增加了10.14%、48.00%、147.78%、397.43%；POD 活性增加了930.05%、1 776.18%、18 823.59%、29 415.60%；GSH 含量增加了151.91%、664.42%、677.41%、1 807.51%。說明Cd 刺激了煙草自身保護(hù)系統(tǒng)，提高了自身抗氧化酶活性從而增加自身抗逆性。

圖3 不同Cd 脅迫對煙草幼苗抗氧化酶的影響Fig. 3 Effects of different cadmium stress on antioxidant enzyme of tobacco seedlings

2.1.5 對煙葉可溶性蛋白含量的影響 圖4 結(jié)果表明，50、100 μmol/L Cd 脅迫下可溶性蛋白含量無顯著性變化，而150、200 μmol/L Cd 脅迫顯著增加了可溶性蛋白含量，較對照處理增長了194.81%、354.65%，表明當(dāng)Cd 濃度增加到一定程度時(shí)，煙草幼苗可積累可溶性蛋白，調(diào)控細(xì)胞滲透壓從而抵御逆境脅迫危害。

圖4 不同Cd 脅迫對煙草幼苗可溶性蛋白含量影響Fig. 4 Effects of different cadmium stress on soluble protein content of tobacco seedlings

2.1.6 對煙葉Cd2+含量的影響 結(jié)果如圖5 所示，與不添加Cd 處理相比，Cd 脅迫（50～200 μmol/L）顯著增加了煙草葉片Cd2+含量且200 μmol/L 處理最高為685.44 mg/kg，較對照處理增加了1 375.39%。說明Cd 脅迫能增加煙葉Cd2+含量，從而影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。

圖5 不同Cd 脅迫對煙草葉片Cd2+含量影響Fig. 5 Effects of different cadmium stress on intracellular cadmium content in leaves of tobacco seedlings

2.2 外源MT 在不同濃度Cd 脅迫下的緩解效應(yīng)

2.2.1 外源MT 對Cd 脅迫下煙草幼苗生長的影響 由表2 結(jié)果表明，隨著MT 濃度的增加，煙苗的鮮質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬及株高均有增加且在200 μmol/L MT時(shí)達(dá)到最大，分別為Cd100的2.32、1.71、1.52、1.78 倍。然而外源MT 對Cd 脅迫下煙草根長無明顯劑量效應(yīng)，在10MT 和50MT 處理下煙草根長僅為單一Cd 處理的83.75%、87.50%，但150，200MT 處理下煙草根長有所增長，為單一Cd處理的100.00%、117.50%。以上結(jié)果表明外源MT能夠促進(jìn)Cd 脅迫下煙草幼苗生長，但不同農(nóng)藝性狀之間存在差異。

表2 外源MT 對Cd 脅迫下煙草幼苗生長的影響Table 2 Effects of exogenous MT on the growth of tobacco seedlings under cadmium stress

2.2.2 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉SPAD 值的影響 圖6 所示，與CK 相比，單施Cd 處理（Cd100）顯著降低了SPAD 值。Cd 脅迫下施加外源MT 能增加煙葉SPAD 值，且隨著MT 濃度的增加呈持續(xù)增長的趨勢。當(dāng)MT 濃度為200 μmol/L 時(shí)，SPAD 值達(dá)到最高，相較于Cd100 增長了87.20%。說明外源MT 能夠緩解100 μmol/L Cd 脅迫對葉綠素的破壞，促進(jìn)葉片光合色素的形成。

圖6 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉SPAD 值的影響Fig. 6 Effect of exogenous MT on SPAD value of tobacco leaves under cadmium stress

2.2.3 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉MDA 含量的影響 由圖7 可知，與CK 相比，Cd100 處理下煙苗葉片MDA 含量顯著上升，而MT 的加入降低了煙苗葉片的MDA 含量，10MT、50MT、100MT、200MT較Cd100 處理MDA 含量分別減少了12.77%、21.31%、34.38%、42.67%。說明褪黑素能降低煙草膜脂過氧化程度，緩解Cd 脅迫對植株的損傷。

圖7 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉MDA 含量的影響Fig. 7 Effect of exogenous MT on MDA content in tobacco under cadmium stress

2.2.4 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉抗氧化酶活性的影響 由圖8 可知，與CK 相比，Cd100 處理下煙苗葉片SOD、POD 活性和GSH 含量顯著上升。而MT 預(yù)處理能進(jìn)一步增加SOD、POD 活性和GSH含量，且隨著MT 濃度的增加而增大，在200 μmol/L時(shí)達(dá)到最大值，較Cd100 增大391.20%、3 305.57%、332.11%。這說明外源MT 能提高煙草抗氧化能力，抵御Cd 脅迫帶來的損傷。

圖8 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉抗氧化酶的影響Fig. 8 Effect of exogenous MT on antioxidant enzymes in tobacco under cadmium stress

2.2.5 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉可溶性蛋白含量的影響 由圖9 可知，與CK 相比，Cd100 處理下可溶性蛋白顯著上升。與單一Cd 脅迫相比，10 和50 μmol/L MT 處理下可溶性蛋白含量變化不大，而100 μmol/L 和200 μmol/L MT 顯著增加了可溶性蛋白含量，為Cd100 處理的157.88%、188.52%。這表明外源MT 能影響煙草可溶性蛋白含量從而增加煙草滲透調(diào)節(jié)能力，抵抗Cd 脅迫。

圖9 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉可溶性蛋白含量的影響Fig. 9 Effect of exogenous MT on soluble protein content in tobacco under cadmium stress

2.2.6 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉胞內(nèi)Cd2+含量的影響 如圖10 所示，與CK 相比，Cd100 處理下葉片Cd2+含量顯著上升。而MT 預(yù)處理有效地降低了煙苗葉片Cd2+含量，10、50、100、200 MT 處理下葉片Cd2+含量分別為395.51、258.33、246.14、217.15 mg/kg，為Cd100 處理的77.53%、50.64%、48.25%、42.56%。表明褪黑素能夠顯著降低煙葉Cd2+含量，從而降低Cd 對煙草的毒害作用。

圖10 外源MT 對Cd 脅迫下煙葉Cd2+含量的影響Fig. 10 Effect of exogenous MT on intracellular cadmium content in tobacco leaves under cadmium stress

3 討 論

Cd 作為一種影響植物生長發(fā)育的非必需重金屬元素，經(jīng)植物吸收后積累在植株體內(nèi)，當(dāng)積累到一定程度時(shí)，會出現(xiàn)各種毒害癥狀，如葉片發(fā)黃，葉片短小、主根和莖稈變短等。羅勇等[19]發(fā)現(xiàn)隨著供Cd 水平的增加，煙苗逐漸矮化、主根變短，葉子發(fā)黃變小，與本研究結(jié)果一致。研究表明外源MT能夠促進(jìn)Cd 脅迫下植株生長，提高植株抗逆性[20]。本研究也表明，Cd 脅迫下煙草幼苗生長受到抑制，葉綠素含量顯著降低，而外源MT（10～200 μmol/L）可不同程度提高煙草幼苗根長、鮮質(zhì)量、最大葉長、最大葉寬、株高及葉綠素含量，這表明MT 能緩解Cd 脅迫帶來的氧化損傷。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)一定濃度的褪黑素可降低煙葉對Cd 的積累，這與黃科文等[21]、張珂等[22]研究結(jié)果一致。這可能是因?yàn)橥屎谒啬苡绊懼仓暄b載轉(zhuǎn)運(yùn)Cd 元素的相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平，其機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

MDA 是膜脂過氧化的最終產(chǎn)物，從膜上產(chǎn)生的位置釋放后，能與蛋白質(zhì)、核酸反應(yīng)使其功能喪失，還可使纖維素分子間的橋鍵松弛，或抑制蛋白質(zhì)的合成。因此，可通過MDA 含量了解膜脂過氧化程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。本研究中，Cd 脅迫顯著增加了煙草體內(nèi)MDA含量，說明Cd脅迫導(dǎo)致植株體內(nèi)活性氧代謝失衡，膜脂過氧化加劇，激發(fā)自身活性氧清除系統(tǒng)，而噴施MT 可顯著的降低MDA 的積累，說明MT 能降低膜脂過氧化程度，這與張珂等[22]研究一致。已有研究表明，MT 作為一種有效的抗氧化劑，能提高脅迫下植株的抗氧化酶活性，如和秋蘭等[13]研究表明不同濃度的MT（50、100、150 μmol/L）預(yù)處理馬鈴薯幼苗后，可提高低溫脅迫的SOD、POD、CAT活性。黃益宗等[23]將水稻幼苗置于砷脅迫下，發(fā)現(xiàn)未使用MT 的幼苗葉片和根的抗氧化酶活性均顯著下降，但施加MT 可有效提高其活性。本研究也發(fā)現(xiàn)Cd 脅迫能增強(qiáng)煙草葉片SOD、POD、GSH 的活性，而外源MT 的加入使這些抗氧化酶活性得到進(jìn)一步提高。

可溶性蛋白是一種重要的營養(yǎng)物質(zhì)，具有可以調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，保護(hù)細(xì)胞膜的功能，可作為植物滲透調(diào)節(jié)能力的表征指標(biāo)。當(dāng)植物遭到重金屬毒害后，組織細(xì)胞會積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御逆境，以保證植物正常的生理活動。如佟莉蓉等[24]發(fā)現(xiàn)Cd脅迫能激發(fā)植物應(yīng)激保護(hù)系統(tǒng)，增加體內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖等含量提高束縛水的含量，保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定從而增加其抗逆性；本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)100 μmol/L Cd 脅迫能增加可溶性蛋白含量，而外源褪黑素能進(jìn)一步增加可溶性蛋白含量，有效緩解了Cd對煙草幼苗細(xì)胞質(zhì)膜的傷害。這與范海霞等[25]和徐寧等[26]研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，Cd 脅迫（50～200 μmol/L）顯著影響煙草幼苗的正常生長和干物質(zhì)的積累，而外源MT（10～200 μmol/L）能夠提高煙苗農(nóng)藝性狀、葉綠素含量、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，降低煙葉Cd2+含量，從而緩解Cd 脅迫對煙草幼苗的傷害，提高植株抵抗Cd 的能力，且以200 μmol/L濃度MT 效果最佳。外源MT 提高煙草抗性的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。