喬亮智，周祿英，杜開峰*

(1.四川大學 化學工程學院，四川 成都 610065；2.四川聚豪錦悅農(nóng)林科技有限公司，四川 達州 635000)

黃酮類化合物是植物生長過程中一種重要的次生代謝產(chǎn)物，其大多具有2-苯基色原酮的基本骨架[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學研究證明，黃酮類化合物具有抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、抗菌抗病毒[4]、抗血栓[5]等多種功效。為了滿足生產(chǎn)和研究的需要，高效的黃酮提取分離技術(shù)成為產(chǎn)學界研究的重點和熱點。黃酮類化合物的一般提取分離流程分為兩個階段，即上游粗提取過程和下游精制純化過程。常用粗提取過程技術(shù)主要是在外場，如微波、超聲波等強化下的水提取、有機溶劑提取以及超臨界流體萃取法[6-9]；精制純化方法主要有沉淀法[10]、超濾法[11]、色譜法[12]等。隨著對黃酮類化合物需求的不斷增加，黃酮類化合物上游粗提取過程技術(shù)飛速發(fā)展，生產(chǎn)規(guī)模顯著增加，百公斤以上的提取工藝已被普遍采用，提取時間縮短至分鐘級，提取率普遍超過100 mg·g-1[1,13-14]。然而，與上游高產(chǎn)率不匹配的是，下游精制純化過程相對滯后。主要原因在于上游大體積溶劑的使用以及高濃度黃酮提取液限制了下游純化效率。因此，開發(fā)高效的下游精制純化技術(shù)成為緩解上下游提取過程矛盾、提高黃酮類化合物生產(chǎn)效率的重要研究課題。

色譜法分離選擇性高，分離條件溫和，操作簡單且易于連續(xù)生產(chǎn)，已成為大規(guī)模精制純化黃酮類化合物重要的一個分離純化手段[12,15-16]。色譜介質(zhì)的物理化學性質(zhì)直接影響分離純化效率，理想的色譜介質(zhì)具有高容量、高流速的特點。為了提高黃酮類化合物色譜的純化性能，實現(xiàn)高效化生產(chǎn)，研究者們開發(fā)了多孔樹脂[17-18]、有機聚合物[19]、氧化石墨烯[20]、無機納米顆粒[21]等多種色譜介質(zhì)。其中，以環(huán)糊精為代表的一類環(huán)狀超分子化合物因其獨特的“內(nèi)疏水，外親水”空腔結(jié)構(gòu)得到了產(chǎn)學界的廣泛關注[22-24]。環(huán)糊精分子中與C2、C3和 C6相連的—OH都位于外側(cè)，構(gòu)成親水表面，每個葡萄糖殘基中的糖苷氧原子和氫原子構(gòu)成了疏水的內(nèi)腔?；谶@種獨特的結(jié)構(gòu)，環(huán)糊精分子可以根據(jù)尺寸、形狀、極性等性質(zhì)的差異對黃酮類化合物選擇性結(jié)合，實現(xiàn)特異性分離。Zhang等[22]發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物在β-環(huán)糊精（β-CD）吸附純化后，純度由粗提液的50.00%提高至94.38%，總黃酮濃度達到505.7 mg/g。Feng等[23]比較了β-CD、γ-CD及其衍生物對黃酮類化合物的吸附能力，結(jié)果顯示磺酰醚化β-CD具有最高的黃酮吸附容量。然而，這種直接使用環(huán)糊精粉末吸附的方法使得脫附和回收過程復雜，粉末狀的β-CD易導致材料在吸附過程中損失；同時，較小的尺寸也會導致色譜柱背壓較大，洗脫液流動緩慢，吸附的黃酮分子難以洗脫，不能重復利用。為了方便回收和上柱，Zhao等[24]采用油水乳化法制備了β-CD微球/碳化鎢復合微球，并考察其吸附熱力學和動力學性質(zhì)。然而，由于黃酮類化合物分子量普遍較大，提取液黏度較高，導致黃酮在微球孔內(nèi)擴散阻力大，吸附速率緩慢，吸附僅僅可以發(fā)生在微球表面的環(huán)糊精分子空腔內(nèi)，微球內(nèi)部的環(huán)糊精空腔并未充分利用，吸附容量低。

針對以上問題，本文提出一種基于乳化法的表面活性劑膠束溶脹策略構(gòu)建大孔β-CD微球，用于黃酮類化合物高效分離純化。一方面，β-CD微球形貌相比于粉末形貌，易于脫附和實現(xiàn)重復利用，而且規(guī)整均一的形貌有利于在色譜分離過程中形成平推流，有益于分離純度的提高；另一方面，大孔的構(gòu)建不僅可以降低黃酮類化合物在微球內(nèi)的擴散阻力，提高吸附速率，也可以提高微球內(nèi)部環(huán)糊精空腔的利用率，提高吸附容量，從而實現(xiàn)黃酮類化合物的高效分離。本文以蘆丁為模型黃酮化合物，考察大孔結(jié)構(gòu)的形成以及其對β-CD微球滲透性、吸附熱力學、吸附動力學性能的影響，揭示孔尺寸對蘆丁分離純化效果的影響規(guī)律，為黃酮類化合物高效分離介質(zhì)的開發(fā)和應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

β-CD（99%）和蘆丁（生物級，95%）購自上海源葉生物科技有限公司；26號白礦油（化妝品級）購自摩杰佐石油化工（上海）有限公司；異辛烷（分析級）、乙醇（95%）、叔丁醇（分析級）、司班85（分析級）、吐溫60（分析級）、二甲亞砜（分析級）和環(huán)氧氯丙烷（分析級）購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2 β-CD微球的制備

基于Nussstein[25]報道的油水乳化法，通過引入表面活性劑膠束，制備LCDM。在80 ℃下，將10 g β-CD溶于20 g質(zhì)量濃度為25 %的氫氧化鈉溶液中，并將8 mL環(huán)氧氯丙烷逐滴加入此溶液中，反應60 min，得到金黃色透明的β-CD寡聚物溶液；將溫度降低至55 ℃，加入一定量的表面活性劑司班85，混合30 min，形成β-CD/司班85表面活性劑膠束混合液；取10 mL β-CD/司班85混合液加入到由80 mL 26號白礦油和20 mL異辛烷組成的油相中，加入2.5 mL 吐溫60，在55 ℃下乳化3 h。隨后，靜置離心，采用體積濃度為50%乙醇溶液清洗獲得大孔β-CD微球，命名為LCDMx，x（mL）代表表面活性劑司班85使用量。實驗制備了4種LCDM，分別為LCDM3.0、LCDM6.0、LCDM9.0、LCDM12.0。為了對比，制備小孔β-CD微球，命名為SCDM，制備過程中除未使用司班85，其余步驟與制備LCDM相同。

1.3 吸附實驗

采用批次搖瓶法測量微球吸附熱力學性質(zhì)。將0.05 g抽濾后的β-CD微球加入到20 mL不同濃度（0.005～0.050 mg/mL）的蘆丁溶液中。將此溶液置于恒溫搖床中，在25 ℃和170 r/min的轉(zhuǎn)速下吸附3 h，采用Alpha-1860紫外分光光度計在355 nm處測量吸附后的蘆丁濃度。采用Langmuir吸附平衡模型擬合，表達式如下：

式中：q為平衡濃度下的吸附劑蘆丁吸附量，mg·mL-1；qm為吸附劑蘆丁吸附容量，mg·mL-1；Kd為吸附平衡解離常數(shù)；c為平衡蘆丁濃度，mg·mL-1。

采用作者團隊自建的在線測量裝置考察吸附動力學[26]。將0.2 g抽濾后的β-CD微球加入到200 mL 0.05 mg·mL-1的蘆丁溶液中；然后在25 ℃和170 r/min轉(zhuǎn)速下攪拌。采用漢邦NU-300 UV/VIS紫外檢測器在355 nm處實時監(jiān)測溶液中蘆丁的濃度變化。

1.4 材料表征

所有測試β-CD微球依次被乙醇和叔丁醇以20%體積濃度梯度置換；用叔丁醇完全置換微球后，將其用液氮冷凍，而后置于凍干機（FD-1A-50，博醫(yī)康Biocool）中干燥。采用掃描電子顯微鏡（JSM 7610F，JEOL）觀察微球的微觀形貌；將樣品表面噴金，在5 kV的加速電壓下觀察樣品微觀形貌。采用全自動比壓汞儀（9 500 AutoРoreⅣ，Micromeritic）測試樣品的孔隙率和比表面積，在 0.1～61 000 Рa壓力下，汞的表面張力取0.485 N·m-1，汞與樣品接觸角為130°；連續(xù)性進汞模式操作，通過改變注入壓力，得到壓力與注汞體積的關系曲線，應用Washburn 方程，得到壓力與孔徑特征的關系曲線[27]。采用AKTA Explorer 100 system（Amersham Biosciences）測試樣品的滲透性，將樣品裝入HR 5/10柱中，通過改變移動相流速，記錄不同流速下的樣品柱背壓。采用Nano Measurer 1.2 software光學顯微鏡測量樣品的微球粒徑，獲得樣品平均粒徑和粒徑分布。采用附溫比重瓶法測量樣品的濕密度[26]。

1.5 數(shù)據(jù)重復性

吸附實驗重復3次，取平均值，平均值誤差低于10%。

2 結(jié)果與討論

2.1 大孔 β-CD微球的制備

溶液中，表面活性劑的濃度超過臨界膠束濃度時，表面活性劑將聚集成為表面活性劑膠束[28]。在膠束中，表面活性劑疏水端朝內(nèi)，親水端朝外。利用這種性質(zhì)，提出基于乳化法的表面活性劑膠束溶脹策略制備LCDM，如圖1所示。圖1中：向β-CD溶液加入超過臨界膠束濃度的表面活性劑，形成β-CD/表面活性劑膠束混合液，并進一步乳化；在乳化過程中，由于表面活性劑膠束內(nèi)部的疏水作用，外部油相被吸入β-CD液滴內(nèi)部，形成油相通道；隨著β-CD被固化交聯(lián)，油相通道轉(zhuǎn)變?yōu)榇罂捉Y(jié)構(gòu)；大孔結(jié)構(gòu)的構(gòu)建不僅提供了寬闊的傳質(zhì)通道，加快了吸附速率，同時也縮短了吸附質(zhì)與微球內(nèi)部環(huán)糊精空腔的距離，提高了吸附位點利用率和吸附容量。

圖1 LCDM制備示意圖Fig.1 Schematic preparation diagram of LCDM

2.2 β-CD微球物理性質(zhì)

采用光學顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察LCDM6.0與SCDM的形貌結(jié)構(gòu)，如圖2所示。由圖2可見：兩種微球具有明顯不同的光學性質(zhì)，相比于SCDM，LCDM6.0表現(xiàn)出明顯的光散射現(xiàn)象，說明LCDM6.0具有與SCDM不同的孔結(jié)構(gòu)；SEM圖顯示LCDM6.0具有明顯的大孔結(jié)構(gòu)，孔徑達到1～2 μm，SCDM則表現(xiàn)出相對光滑平整的無孔表面。這種結(jié)構(gòu)差異印證了兩者不同的光學現(xiàn)象，大孔造成光在孔道中多次折射形成散射，導致LCDM呈現(xiàn)光散射現(xiàn)象。

圖2 LCDM6.0與SCDM的光學顯微鏡圖和SEM圖Fig.2 Optical micrographs and SEM images of LCDM6.0 and SCDM

比較不同表面活性劑用量下的β-CD微球在平均孔徑、孔隙率、比表面積、平均粒徑4個方面的差異，結(jié)果見表1。由表1可知：隨著表面活性劑膠束濃度的增大，β-CD微球的平均孔徑從SCDM的7.34 nm增加至孔LCDM12.0的178.01 nm，孔隙率從40.12%增加至82.95%，證明了大孔結(jié)構(gòu)的形成是由表面活性劑膠束的引入造成的；增加司班85的使用量，則無法形成微球。β-CD微球的比表面積隨表面活性劑膠束濃度增加呈現(xiàn)下降趨勢，孔隙率則顯示出增長趨勢。這主要是由于比表面積主要由微介孔決定，而大孔結(jié)構(gòu)的形成消耗了大量微介孔，導致比表面積隨孔徑增大而下降[29]。5種β-CD微球的粒徑范圍都在（105±4）μm范圍內(nèi)，沒有明顯差異。同時，這5種β-CD微球的濕密度保持在（1.03±0.02）mg·mL-1，證明大孔結(jié)構(gòu)的引入不會影響微球粒徑和濕密度。

表1 5種 β-CD微球的物理性質(zhì)Tab.1 Physical properties of the five β-CD microspheres

2.3 孔徑對 β-CD微球滲透性的影響

5種β-CD微球所形成的固定床在不同流速下的背壓變化如圖3所示。由圖3可知，在相同流速下，相較SCDM，LCDM3.0、LCDM6.0和LCDM9.0表現(xiàn)出明顯更低的背壓，且隨著孔徑的增大，背壓進一步降低。采用Darcy模型計算介質(zhì)的滲透系數(shù)K（m2），表達式如式（2）所示[30]：

圖3 背壓-流速曲線和K值Fig.3 Back pressures as a function of flow velocity and K values

式中：μ為移動相黏度，Рa·s；u為移動相空塔流速，m·s-1；L為固定床長度，m；ΔP為固定床壓降，Рa。SCDM、LCDM3.0、LCDM6.0和LCDM9.0的K值分別為0.92×10-11、1.15×10-11、1.33×10-11、1.57×10-11m2，其中，LCDM9.0的K值相比SCDM增加了70.65%。這是由于大孔提供了寬闊的傳質(zhì)通道，降低了移動相在孔內(nèi)的傳質(zhì)阻力，提高了微球的滲透性[31]。隨著孔徑的進一步增大，LCDM12.0背壓曲線表現(xiàn)出不同于其他3種LCDM隨流速線性增長的趨勢，在流速超過2 mL·min-1時，LCDM12.0背壓隨流速呈指數(shù)式增長。這種劇烈增加的背壓是由于過多大孔結(jié)構(gòu)的形成損害了LCDM12.0的機械強度，導致LCDM12.0在流速狀態(tài)下結(jié)構(gòu)塌陷，孔道堵塞，背壓急劇上升。因此，在實際應用中，應選擇合適孔結(jié)構(gòu)的β-CD微球作為純化介質(zhì)，既具有高的滲透性，保證分離純化效率，同時也具有一定耐壓強度，避免因微球結(jié)構(gòu)塌陷而導致的分離純化性能下降。

2.4 吸附熱力學

以蘆丁作為黃酮類化合物的模型代表，考察β-CD微球?qū)τ谔J丁的吸附性能，采用Langmuir模型擬合吸附曲線。考慮到所有吸附熱力學曲線并沒有達到平衡，通過Langmuir模型擬合獲得的吸附容量qm不能代表介質(zhì)對蘆丁的真實吸附容量[32]。因此，采用蘆丁平衡濃度為0.03 mg/mL處的吸附密度來表示介質(zhì)對蘆丁的吸附能力。5種β-CD微球Langmuir擬合曲線和參數(shù)分別如圖4（a）及表2所示。將表2中平衡參數(shù)代入Langmuir方程，計算獲得微球在0.03 mg/mL平衡濃度下的吸附密度如圖4（b）所示。由圖4（b）可見，相比于小孔SCDM，大孔LCDM3.0和LCDM6.0對蘆丁有更高的吸附密度，其中，LCDM6.0的蘆丁吸附密度達到29.62 mg·mL-1，是SCDM吸附密度（8.66 mg·mL-1）的3.42倍。這是由于大孔結(jié)構(gòu)縮短了蘆丁到吸附位點的傳質(zhì)距離，提高了微/介孔吸附位點的利用率，因此具有較高的吸附容量。隨著孔徑的進一步增大，蘆丁吸附量呈現(xiàn)出下降趨勢，其中，LSCM12.0的蘆丁吸附量僅有5.31 mg·mL-1，甚至低于SCDM。造成此現(xiàn)象的原因在于過多大孔結(jié)構(gòu)的構(gòu)建消耗了大量微介孔，導致了吸附位點損失，因此表現(xiàn)出較低的吸附容量。

表2 蘆丁吸附的Langmuir方程擬合參數(shù)Tab.2 Langmuir parameters of rutin adsorption

圖4 5種 β-CD微球的吸附熱力學曲線和吸附密度Fig.4 Adsorption thermodynamic curves and adsorption densities of five β-CD microspheres

提取液的pH是影響黃酮類化合物提取率的重要因素之一。以LCDM6.0為例，考察蘆丁溶液pH值對于LCDM6.0吸附容量的影響，如圖5所示。由圖5可知：在酸性條件下，LCDM6.0蘆丁吸附容量受pH值影響較小，保持高于29 mg/mL的吸附容量；當蘆丁溶液pH值增加至溶液為堿性，LCDM6.0的蘆丁吸附容量呈現(xiàn)出斷崖式下降，最低至6.43 mg·mL-1（pH=11.1）。Shuang等[33]報道蘆丁在堿性條件下，酚羥基容易去質(zhì)子而離子化，離子化后的蘆丁疏水性明顯下降，導致蘆丁與環(huán)糊精的包結(jié)平衡常數(shù)下降。降低的包結(jié)常數(shù)可能是造成蘆丁在堿性條件下吸附容量下降的原因之一。此外，堿性的環(huán)境也可能導致β-CD中的C2—OH離子化而發(fā)生構(gòu)象變化，造成蘆丁與β-CD空腔匹配度降低[24]。

圖5 pH對LCDM6.0蘆丁吸附容量的影響Fig.5 pH effect on the adsorption capacity of LCDM6.0 for rutin

2.5 吸附動力學

蘆丁在這5種β-CD微球介質(zhì)中的吸附動力學曲線如圖6所示。

圖6 5種β-CD微球的吸附動力學曲線Fig.6 Uptake kinetic curves of the five β-CD microspheres

由圖6可見：LCDM3.0、LCDM6.0和LCDM9.0表現(xiàn)出比SCDM更快的吸附速率；LCDM12.0在吸附初期表現(xiàn)出最快的吸附速率，然而受限于低的吸附容量，當吸附時間超過4 min時，達到吸附飽和。利用孔擴散模型擬合吸附動力學曲線，求解蘆丁在孔內(nèi)的有效擴散系數(shù)，表達式如下[34]：

式中：De為有效擴散系數(shù)，m2·s-1；cp為孔道中的蘆丁濃度，mg·mL-1；q為溶液中的蘆丁濃度，mg·mL-1；t為吸附時間，min；εp為介質(zhì)孔隙率；r為沿半徑方向的徑向長度，m。由于吸附體系始終處于一個攪拌狀態(tài)，因此液膜擴散阻力可忽略，式（3）可簡寫為：

式中：F為吸附劑與蘆丁溶液體積之比；R為色譜介質(zhì)半徑，m；c0為溶液中蘆丁初始濃度，mg·mL-1；c為平衡蘆丁濃度，mg·mL-1。式（3）～（4）的初始和邊界條件為：

采用正交配置法在空間上離散模型，配置點數(shù)為19，得到對時間的常微分方程組，采用Matlab R2021a內(nèi)置求解器ode15s求解。采用25 ℃時蘆丁的自由溶液擴散系數(shù)D0（3.73×10-10m2/s）對De無量綱化處理，結(jié)果見表3；蘆丁在微球內(nèi)的吸附濃度輪廓如圖7所示，圖7中，Rp為介質(zhì)半徑。由表3可知：隨著孔徑的增大，蘆丁的De/D0值也隨之增加。其中，LCDM12.0的De/D0值達到1.29，相比于SCDM（0.12）提高了10.75倍。Zhao等[24]制備了1種β-CD微球/碳化鎢復合微球，蘆丁在該微球內(nèi)的De/D0值僅有0.1×10-11m2·s-1，接近于SCDM，但遠低于LCDM，證明了大孔結(jié)構(gòu)可以有效促進蘆丁在微球內(nèi)部的傳質(zhì)。此外，由圖7可知，所有β-CD微球?qū)μJ丁都表現(xiàn)出較強的優(yōu)惠吸附，并且隨著孔徑的增大，吸附前沿也變得更加陡峭，證明了蘆丁在大孔內(nèi)的傳質(zhì)速率隨孔徑增加而增加。

表3 蘆丁在5種 β-CD微球內(nèi)的 De/D0值Tab.3 De/D0 values of ratin in the five β-CD microspheres

圖7 5種 β-CD微球的吸附濃度輪廓圖Fig.7 Intraparticle concentration profile of the five β-CD microspheres

3 結(jié) 論

采用表面活性劑溶脹策略成功制備大孔β-CD微球，平均孔徑為20～200 nm，孔徑隨表面活性劑用量的增加而增加。大孔的構(gòu)建顯著提升了微球的滲透性，在相同流速下，大孔β-CD微球具有更低的背壓，其中，LCDM9.0的滲透性相比SCDM增加了70.65%。在蘆丁吸附實驗中，LCDM6.0表現(xiàn)出最大的吸附容量，在0.03 mg·mL-1的蘆丁濃度下，吸附密度達到29.62 mg·mL-1，是SCDM吸附密度（8.66 mg·mL-1）的3.42倍。LCDM的蘆丁吸附容量受溶液pH影響較大，在堿性條件下，由于蘆丁的離子化以及β-CD構(gòu)象的改變，蘆丁與β-CD空腔適配程度降低，導致低吸附容量。此外，相比于SCDM，蘆丁在LCDM內(nèi)表現(xiàn)出明顯更快的擴散系數(shù)，其中，LCDM12.0的無量綱化有效孔擴散系數(shù)（De/D0）達到1.29，是SCDM有效擴散系數(shù)的10.75倍。以上結(jié)果證明了大孔的構(gòu)建不僅提高了吸附容量，也加快了吸附速率，LCDM是一種有價值的黃酮類化合物分離純化介質(zhì)。