徐昭,張瑞芝,王佳楠,王峰, 2, 3, 4,李丹蕾, 3*

(1. 東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,黑龍江省外來林木病蟲害監(jiān)測與防控重點實驗室,哈爾濱 150040;2.林木遺傳育種全國重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)),哈爾濱 150040;3.森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點實驗室(東北林業(yè)大學(xué)),哈爾濱 150040;4. 沈陽工學(xué)院,遼寧省危險性林業(yè)有害生物防控重點實驗室,沈陽 110001)

0 引言

松樹萎蔫病(pine wilt disease,PWD),亦稱松材線蟲病,是由松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)引起的毀滅性病害,目前已成為我國針葉林的重要威脅[1-2]。我國是目前松材線蟲病流行最嚴(yán)重的國家[3]。2022年,我國病死樹數(shù)量達1 040.48萬株[4]。2023年,我國有701個縣級行政區(qū)發(fā)生松材線蟲(國家林業(yè)和草原局2023年第7號公告)。近年來,松材線蟲正不斷向北擴張,經(jīng)低溫馴化,其低溫適應(yīng)性提高[5- 6],能夠在東北低溫地區(qū)存活[7],且已經(jīng)在東北局域引發(fā)毀滅性災(zāi)害[8]。松材線蟲能夠自然侵染紅松(Pinuskoraiensis)[9],其入侵對東北林區(qū)頂級生態(tài)群落的重要組成樹種紅松構(gòu)成重大威脅[10]。紅松在東北地區(qū)生態(tài)環(huán)境建設(shè)和經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮著重要作用,是主要的生態(tài)樹種和先鋒樹種,并具有優(yōu)良的木材性能和經(jīng)濟價值[11]。因此亟須明確松材線蟲與紅松的互作機制,從而為保護紅松資源尋求新的解決策略。

植物的防御反應(yīng)主要包括病原相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity,PTI)和效應(yīng)因子誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity,ETI)[12]。植物次生代謝產(chǎn)物是植物免疫過程中產(chǎn)生的重要化合物,其主要包括酚類物質(zhì)、萜類物質(zhì)以及生物堿類等[13- 14]。萜類物質(zhì)是植物免疫反應(yīng)中常見的化合物,松屬植物的松脂中包含大量單萜、倍半萜及二萜類物質(zhì)。α-松油醇是一種存在于松脂中的單萜類化合物,具有抑菌[15]和殺蟲活性[16]的同時,又能夠減輕病情。在植物中,萜烯類物質(zhì)的合成主要有2個途徑,2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸酯途徑(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway,MEP)與甲戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA),MEP主要合成單萜和二萜,而MVA主要合成倍半萜[17]。有研究揭示單萜合酶家族(monoTPS)和倍半萜合酶家族(sesquiTPS)[18-19],都具有能合成產(chǎn)生具有獨特芳香氣味的單萜醇,例如α-松油醇與芳樟醇。另外,松油醇合酶能夠與香葉基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)反應(yīng)催化生成單萜類物質(zhì)α-松油醇,松油醇合酶基因通過這一過程對MEP途徑進行調(diào)控[20]。

雖然目前尚未發(fā)現(xiàn)對外來入侵的松材線蟲具有抗病性(能抑制松材線蟲完成生活史)的紅松,但林業(yè)生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)有大量松材線蟲侵染后呈現(xiàn)“越年枯死”癥狀的紅松,這些紅松具有一定程度的耐病性(tolerance)[21]。耐病性是植物對病害的高忍耐程度,例如一些寄主植物在受到病原侵染后并不表現(xiàn)明顯病變,或有明顯病變但仍保持較高產(chǎn)量[22]。有研究表明,不同家系紅松對松材線蟲耐病性不同,在分離的蟲量和紅松癥狀上存在差異,這與不同家系紅松的植保素含量不同有關(guān)[21]。另有研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌(Fusariumsolani)侵染后,高粱(Sorghumbicolor)損傷減輕,耐病性提高與α-松油醇的接種前處理有關(guān)。該過程可能是通過提高抗氧化酶活性、酚類和黃酮類物質(zhì)含量而實現(xiàn)的[23]。因此,對紅松家系間耐病性差異進行研究,對α-松油醇合酶基因Pk-αts在紅松與松材線蟲互作中的作用進行驗證,進一步揭示耐病紅松的耐病機理,也為紅松耐病性鑒定提供靶標(biāo)基因,為選育耐病紅松提供理論基礎(chǔ)。

1 研究方法

1.1 供試材料及松材線蟲接種

供試松材線蟲FSBx分離自中國遼寧罹病紅松,挑取單條雌蟲于灰葡萄孢(Botrytiscinerea)上25 ℃避光培養(yǎng)擴繁備用。供試的20個家系紅松來源見表1。用剝皮套管法接種紅松3 a生枝條,數(shù)量為5 000條/株[24]。拍照記錄紅松癥狀變化,利用k-means聚類算法,計算紅色針葉在圖像中的比例,根據(jù)紅色針葉所占比例計算感病指數(shù)(disease index,DI,式中為DI)。根據(jù)感病指數(shù)計算相對耐病指數(shù)(relative tolerance index,RTI,式中為RTI),計算公式如下。

表1 20個紅松家系來源Tab.1 Sources of 20 P. koraiensis families

(1)

(2)

式中:r為紅色針葉面積, cm2;a為全部針葉面積, cm2;DImax為最高一級的感病指數(shù)。

根據(jù)RTI確定不同家系紅松的相對耐病指數(shù),分為耐病紅松(0.8

本研究涉及的松材線蟲活體試驗均在疫區(qū)試驗室完成,試驗完成后涉及松材線蟲的試驗材料和器皿均按相關(guān)法規(guī)要求完成無害化處理。

1.2 紅松核糖核酸(RNA)提取及轉(zhuǎn)錄組分析

試驗處理以相對耐病指數(shù)最高與最低2個單株枝條(家系5號與家系10號)進行RNA提取送測。以接種12 h后紅松枝條為接種組(T,耐病紅松接種組命名為T1,高感紅松接種組命名為T2),去離子水(ddH2O)處理模擬接種的紅松枝條為對照組(CK,耐病紅松對照組命名為CK1,高感紅松對照組命名為CK2),經(jīng)液氮研磨后CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨法)提取4組紅松樣品的總RNA。DNase I(RNase-free)37 ℃處理去除RNA中殘留的DNA,酚∶氯仿∶異戊醇質(zhì)量比25∶24∶1抽提后ddH2O(DEPC二乙基焦碳酸酯處理)溶解送華大基因(Beijing genomics institute,BGI)進行轉(zhuǎn)錄組測序。表達量數(shù)據(jù)均一化處理后,用log2(T1/CK1)和log2(T2/CK2)表示基因表達水平。其中,log2(T/CK)≥1定義為表達量上調(diào)的基因,log2(T/CK)≤-1定義為表達量下調(diào)的基因,-1

為了進一步驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),使用RT-qPCR測量了5號與10號紅松隨機6個基因的表達量,使用Premier 5設(shè)計引物,引物序列見表2。取8 μL提取的RNA(≈1 μg)反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。以第一鏈cDNA為模板,使用GoTaq 2-Step RT-PCR System Kit和Stratagene Mx3000P Qpcr系統(tǒng)進行RT-qPCR。95 ℃預(yù)變性2 min后,95 ℃變性15 s,60 ℃退火延伸1 min,60、95 ℃下測定溶解曲線。使用18srRNA作為內(nèi)參基因?qū)T-qPCR結(jié)果進行了標(biāo)準(zhǔn)化處理(log2[fold-change]),每個反應(yīng)涉及3次獨立重復(fù)測試。使用相對定量法計算數(shù)據(jù)[26],驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。轉(zhuǎn)錄組及RT-qPCR等試驗數(shù)據(jù)分析及繪圖用R語言ggplot2包完成。

表2 引物表Tab.2 Premiers

1.3 基因克隆及生物信息學(xué)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果篩選到紅松α-松油醇合酶基因Pk-αts,并設(shè)計PCR擴增引物(表2)。提取紅松RNA,應(yīng)用Promega AMV反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)進行第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄。以第一鏈cDNA為模板,進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

應(yīng)用ORF Finder(open reading frame finder)對測序結(jié)果進行在線ORF分析,推導(dǎo)出Pk-αts基因編碼的氨基酸序列,根據(jù)氨基酸序列進行BLASTP多序列比對并下載NCBI數(shù)據(jù)庫中收錄的同源序列。應(yīng)用Clustal W進行多序列比對,并用Mega 7.0.14根據(jù)BIC(貝葉斯信息準(zhǔn)則)值確定最適模型,構(gòu)建鄰接樹(neighbor joining tree,NJT)。應(yīng)用自展檢驗(bootstrap test)估計所構(gòu)建系統(tǒng)樹的可靠性,重復(fù)次數(shù)為1 000。

1.4 Pk-αts表達量與紅松耐病指數(shù)相關(guān)性分析

選取10個家系(5、9、6、1號耐病家系,15和16號感病家系以及17、2、12、10號高感家系,共計10個紅松家系)用于Pk-αts表達量測定。分別提取線蟲接種后12 h接種點上下3 cm枝條的接種組及對照組RNA,取8 μL RNA(≈1 μg)反轉(zhuǎn)錄第一鏈cDNA。設(shè)計引物(表2),以第一鏈cDNA為模板,進行RT-qPCR擴增,實驗操作和數(shù)據(jù)分析方法同1.1.2。

分析Pk-αts表達量與不同家系紅松耐病指數(shù)的相關(guān)性。使用軟件SPSS 26計算,應(yīng)用Pearson檢驗。使用Python 3.10繪制數(shù)據(jù)表格及圖片,應(yīng)用Pandas庫讀取和處理表格數(shù)據(jù),NumPy庫進行擬合和計算系數(shù),Matplotlib庫繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 松材線蟲接種后紅松癥狀

接種線蟲20 d后20個紅松家系針葉顏色發(fā)生不同程度的變化,如圖1所示。接種松材線蟲20 d后20個家系紅松耐病性不同。1、3、5、6、9、14號家系耐病(6個),相對耐病指數(shù)分別為0.82、0.91、1、0.84、0.88、0.86。4、7、8、11、15、16、19、20號家系感病(8個),相對耐病指數(shù)分別為0.54、0.32、0.66、0.37、0.48、0.37、0.41、0.52。2、10、12、13、17、18號家系高感(6個),相對耐病指數(shù)分別為0.15、0、0.01、0.07、0.15和0.13。接種線蟲20 d后,耐病紅松僅數(shù)根針葉褪綠或變黃,平均相對耐病指數(shù)為0.88,其松材線蟲的平均分離量為666條/株。高感紅松表現(xiàn)出局部松針變紅,平均相對耐病指數(shù)為0.09,高感紅松中松材線蟲平均分離量為1 228條/株。其中5號家系(RTI=1)和10號家系紅松(RTI=0)用于轉(zhuǎn)錄組測序。

圖1 20個紅松家系接種松材線蟲20 d癥狀圖Fig.1 Symptoms of 20 P. koraiensis families on the 20 d after inoculation

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)分析

轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)得到的Unigene平均長度為1 140 bp,堿基GC含量為43.62%(圖2)。鑒定到耐病紅松DEG(差異基因)共計13 975個,包括上調(diào)表達基因6 660個,下調(diào)表達基因7 315個(圖2 (a1))。高感紅松鑒定到18 469個DEG,其中上調(diào)表達基因8 547個,下調(diào)表達基因9 922個(圖2 (a2))。耐病紅松上調(diào)且高感紅松非上調(diào)表達的基因(無變化或差異下調(diào))共1 770個(圖2(b))。取前22條代謝通路進行富集分析,得到富集分析柱狀圖(圖2 (c))。由圖2(c)可以看出,維持植物正常生命活動的相關(guān)通路均有顯著變化;植物免疫相關(guān)通路呈現(xiàn)顯著差異,次生代謝產(chǎn)物發(fā)生顯著變化。圖2(c)圈紅部分顯示,Biosynthesis of various plant secondary通路有23個基因富集,其中1條次級代謝產(chǎn)物合成基因互作網(wǎng)絡(luò)以α-松油醇合酶基因(Pk-αts)為代謝通路節(jié)點。

(c):1.糖酵解和糖異生;2.植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo);3.淀粉和蔗糖代謝;4.谷胱甘肽代謝;5.花生四烯酸代謝;6.亞麻酸代謝;7.類黃酮生物合成;8.AMPK信號通路;9.酪氨酸代謝;10.氰氨酸代謝;11.mTOR信號通路;12.ABC轉(zhuǎn)運蛋白;13.各種植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成;14.HIF-1信號通路;15.Apelin信號通路;16.晝夜節(jié)律;17.脂肪細胞因子信號通路;18.P53信號通路;19.卟啉代謝;20.玉米素生物合成;21.黃酮和黃酮醇的生物合成;22.維生素的消化和吸收。(c):1.glycolysis and gluconeogenesis; 2.plant hormone signal transduction; 3.starch and sucrose metabolism; 4.glutathione metabolism; 5.arachidonic acid metabolism; 6.linolenic acid metabolism; 7.flavonoid biosynthesis; 8.AMPK signaling pathway; 9.tyrosine metabolism; 10.cyanoamino acid metabolism; 11.mTOR signaling pathway; 12.ABC transporters; 13.biosynthesis of various plant secondary metabolites; 14.HIF-1 signaling pathway; 15.apelin signaling pathway; 16.circadian rhythm; 17.adipocytokine signaling pathway; 18.p53 signaling pathway; 19.porphyrin metabolism; 20.zeatin biosynthesis; 21.flavone and flavonol biosynthesis; 22.vitamin digestion and absorption.圖2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析Fig.2 Transcriptomic analysis

隨機6個基因的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和RT-qPCR驗證結(jié)果如圖2(d)所示。2組數(shù)據(jù)中,耐病與高感紅松基因表達量與表達趨勢基本相同,說明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠。

2.3 基因克隆及生物信息學(xué)分析

圖3為基因克隆和生物信息學(xué)分析,基因克隆得到Pk-αts長度為1 230 bp(圖3 (a))。該基因編碼蛋白質(zhì)由409個氨基酸構(gòu)成,等電點為5.55,相對分子質(zhì)量為47.60 ku,具有Terpene_cyclase_plant_C1(CDD號:cd00684,E-Value=1.27e-159)、PLN02592(CDD號:pfam01397,E-Value=5.43e-62)和Terpene_synth(CDD號:cd00684,E-Value=3.53e-57)結(jié)構(gòu)域(圖3(b)),含有植物單萜烯合成酶的保守基序DDxxD基序和RRx8W基序(圖3(c)),符合單萜烯合成酶結(jié)構(gòu)特征。Pk-αts與α-松油醇合酶基因同源性最高。以歐洲赤松(P.sylvestris)為內(nèi)參,擬南芥(Arabidopsisthaliana)為外參構(gòu)建進化樹(圖3(d)),Pk-αTS與歐洲赤松αTS聚為一支,與外參擬南芥αTS存在差異,親緣關(guān)系較遠。

圖3 基因克隆及生物信息學(xué)分析Fig.3 Gene cloning and bioinformatics analysis

2.4 Pk-αts表達量與紅松相對耐病指數(shù)相關(guān)性分析

10個家系紅松接種后耐病指數(shù)如圖4 (a)所示,隨機選擇4個耐病家系(1、5、6、9號)、2個感病家系(15、16號)與4個高感家系(2、10、12、17號),耐病紅松的平均相對耐病指數(shù)為0.88,感病紅松的平均相對耐病指數(shù)為0.42,高感紅松的平均相對耐病指數(shù)為0.08。RT-qPCR檢測耐病、感病和高感紅松表達量,如圖4 (b)所示,結(jié)果顯示Pk-αts基因在耐病紅松中上調(diào)表達(平均表達量為1.39),在感病和高感紅松中無變化或下調(diào)表達。

圖4 Pk-αts基因表達量與紅松相對耐病指數(shù)相關(guān)性分析Fig.4 Correlation analysis between Pk-αts gene expression and relative tolerance index of P. koraiensis

相關(guān)性分析得到的擬合曲線如圖4(c)所示,不同家系紅松相對耐病指數(shù)與Pk-αts基因表達量呈現(xiàn)顯著性正相關(guān)(P<0.01,皮爾遜系數(shù)為0.911)。

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明不同家系紅松對松材線蟲耐病性不同,Pk-αts表達也不同,二者具時空同步性并呈線性顯著正相關(guān),說明Pk-αts是影響紅松耐病性的關(guān)鍵基因,Pk-αts基因高表達提高了紅松對松材線蟲耐病性。Pk-αts基因可作為紅松耐病性檢測的候選靶標(biāo),應(yīng)用于耐病紅松選育。

植物的次生代謝產(chǎn)物在植物中一般不直接參與生長發(fā)育和生殖相關(guān)的生命活動,且次生代謝產(chǎn)物與初生代謝產(chǎn)物不同,往往由于植物不同的部位、種屬和發(fā)育時期而不同[27]。在植物的生長發(fā)育過程中,當(dāng)病原微生物損害植物生長發(fā)育時,次生代謝產(chǎn)物則作為抵抗這些病害的角色被發(fā)現(xiàn)[28],本研究同樣對紅松抵抗松材線蟲的過程進行探索,通過轉(zhuǎn)錄組篩選,鎖定次生代謝通路中的關(guān)鍵基因Pk-αts。

α-松油醇本身是一種萜類物質(zhì),而萜類也是植物中數(shù)量最多的一類次生代謝產(chǎn)物,結(jié)構(gòu)則以異戊二烯五碳為根本,衍生出各類有機化合物,包括酮、醛、酯、羧酸和苷類萜烯等[29-30]。萜烯合成酶在萜烯生成階段發(fā)揮重要作用,在直接前體物質(zhì)GPP、法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)和香葉基香葉基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)合成后,萜烯合成酶催化以上前體物質(zhì)生成單萜烯、倍半萜烯和二萜烯等[31]。研究表明,除具抑菌活性外[32],單萜、倍半萜類物質(zhì)還能夠減輕氧化應(yīng)激,降低活性氧水平,減輕細胞損傷[33-34],反之抑制單萜、倍半萜類物質(zhì)生物合成會增加氧化損傷[35]。α-松油醇是一種單萜類化合物,除具抑菌[36]、殺蟲功能,還具抗氧化作用,其合成由α-松油醇合成酶催化完成。在本研究中,Pk-αts基因表達上調(diào)減輕了紅松發(fā)病癥狀,有助于提高紅松耐病性,可能是由于Pk-αts的表達促進了α-松油醇的合成,α-松油醇通過抗氧化過程降低了耐病紅松的細胞損傷,該過程涉及的分子機制仍需進一步研究。耐病紅松的優(yōu)良特質(zhì)除減少自身損傷外,還應(yīng)對松材線蟲具有一定抑制作用。本研究Pk-αts的終產(chǎn)物α-松油醇對其他病蟲害的殺傷毒性已有相關(guān)報道,對松材線蟲是否有影響可進一步研究。