高嘉雯 朱旭江 姚世霞 牛鈺婷

【摘 要】目的：建立甘草多糖膠囊中甘草多糖含量測(cè)定的方法。方法：以苯酚和硫酸的加入量、反應(yīng)時(shí)間等為考察因素，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化苯酚-硫酸法測(cè)定甘草多糖含量的顯色條件。并采用紫外分光光度法，以葡萄糖為對(duì)照品，于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定甘草多糖吸光度，計(jì)算總多糖的含量。結(jié)果：甘草總多糖含量測(cè)定的最佳顯色條件為苯酚用量1 mL，硫酸用量5 mL，放置時(shí)間30 min。甘草多糖在0.0621～0.1656 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.0048x+0.0252，r=0.9995；精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性良好；平均加樣回收率為99.5%，RSD＝3.0％（n=9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于甘草多糖膠囊中總多糖的含量測(cè)定。

【關(guān)鍵詞】甘草多糖膠囊；分光光度法；含量測(cè)定

【中圖分類號(hào)】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2023）16-0033-03

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.16.zgmzmjyyzz202316007

Orthogonal Experiment was Used to Optimize the Determination Method of Total

Polysaccharide in Glycyrrhiza Polysaccharide Capsules

GAO Jiawen1 ZHU Xujiang1，2* YAO Shixia2 NIU Yuting2

1.Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2.Gansu Institute for Drug Control，Lanzhou 730070，China

Abstract： Objective To establish a method for the determination of total polysaccharides in Glycyrrhiza polysaccharide capsules.Methods Taking the amount of phenol and sulfuric acid，reaction time and so on as the investigation factors，the orthogonal experimental design was adopted to optimize the color development conditions for the determination of Glycyrrhiza polysaccharide content by phenol-sulfuric acid method.The absorbance of Glycyrrhiza polysaccharide was measured at 490nm by ultraviolet spectrophotometry，and the content of total polysaccharide was calculated.Results The best chromogenic conditions for the determination of total polysaccharide content in Glycyrrhiza uralensis Fisch were as follows： the dosage of phenol was 1 mL，the dosage of sulfuric acid was 5 mL，and the storage time was 30 min.The linear relationship of Glycyrrhiza polysaccharide is good in the concentration range of 0.0621～0.1656 mg·mL-1，and the regression equation is y=0.0048x+0.0252，r=0.9995;Good precision，stability and reproducibility; The average recovery rate is 99.5%，RSD=3.0%（n=9）.Conclusion The method is simple，accurate and reproducible，and can be used for the determination of total polysaccharides in Glycyrrhiza polysaccharide capsules.

Key words：Glycyrrhiza Polysaccharide Capsules; Spectrophotometry; Content Determination

甘草多糖膠囊系經(jīng)水提醇沉法提取甘草中的多糖，加輔料制成的膠囊劑，為甘肅省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑，臨床用于提高免疫力［1-2］。該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中采用3，5-二硝基水楊酸比色法（DNS），單點(diǎn)外標(biāo)法測(cè)定甘草多糖的含量，試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)操作過(guò)程復(fù)雜，試劑配制耗時(shí)，且輔料存在干擾，導(dǎo)致結(jié)果重現(xiàn)性較差。常用的多糖測(cè)定方法有：苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法、DNS法等［3-5］。其中，苯酚-硫酸法操作簡(jiǎn)便，測(cè)定快速，較為常用［6-7］。許多研究［8-10］發(fā)現(xiàn)，苯酚-硫酸法在測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性上均優(yōu)于蒽酮-硫酸法。有研究［11-12］發(fā)現(xiàn)，在同質(zhì)量濃度下，對(duì)比葡萄糖對(duì)照品溶液吸光度，苯酚-硫酸法的吸光度大于蒽酮-硫酸法和DNS法，表明苯酚硫酸法的測(cè)定結(jié)果更靈敏。因此，通過(guò)研究，建立了苯酚-硫酸比色法測(cè)定甘草多糖膠囊的含量，并通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化顯色條件，方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Lambda365紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（PerkinElmer公司）；MS205DU十萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒公司）；ME204電子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；漩渦混合器（IKA VORTEX2）。

1.2 試藥 甘草多糖膠囊（批號(hào)分別為：200402、200403、200301，甘肅省中醫(yī)院提供）；D-無(wú)水葡萄糖（批號(hào)：110833-201707，含量99.9%，中國(guó)食品藥品檢定研究院）蒽酮、苯酚、3，5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、硫酸，均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖對(duì)照品103.49 mg，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取儲(chǔ)備液5 mL，置25 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液制備 取甘草多糖膠囊內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，精密稱取0.1 g，置250 mL量瓶中，加水200 mL，旋渦振蕩器混合5 min，超聲（功率500 W，頻率40 kHz）處理30 min，放冷至室溫，加水至刻度，搖勻，取適量，過(guò)濾，精密量取濾液5 mL，置10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2 最大吸收波長(zhǎng)的測(cè)定 精密吸取0.4 mL“2.1.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，置刻度試管中，加入5%的苯酚溶液1.0 mL，振蕩搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，立即搖勻，冷卻至室溫。以相應(yīng)試劑為空白，在400～700 nm掃描光譜。由圖1結(jié)果可知對(duì)照品溶液在490 nm處有最大吸收，故選擇490 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化顯色條件 通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，苯酚和硫酸的加入量、反應(yīng)時(shí)間均對(duì)結(jié)果有較大影響，因此，采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以吸收度為考察指標(biāo)優(yōu)選最佳顯色條件，并運(yùn)用SPSS 27.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

由表2直觀分析可知，各因素對(duì)綜合評(píng)分影響的順序?yàn)锽＞A＞C；由表3的方差分析可知，濃硫酸用量對(duì)顯色具有顯著意義。綜合直觀分析和方差分析結(jié)果，確定總多糖含量測(cè)定條件的最佳工藝條件為A2B1C3，即苯酚用量為1 mL，硫酸用量為5 mL，放置時(shí)間為30 min。經(jīng)對(duì)同一批樣品制備3批供試品溶液進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果RSD為3.0%（n=3），顯色條件方法可行。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取葡萄糖對(duì)照品溶液0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL、0.8 mL，分別置具塞刻度試管中，加水至1 mL，搖勻，加入5 %苯酚溶液1 mL，搖勻，迅速加入硫酸5 mL，搖勻，放置30 min，加水至10 mL，冰浴冷卻，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法（2020版中國(guó)藥典通則0101），在490 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為方程為：y=0.0048x+0.0252，r=0.9995，表明葡萄糖在0.0621～0.1656 mg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 專屬性考察 按處方比例及制備工藝，制成不含甘草多糖的陰性樣品，按“2.1.2”制成供試品溶液，測(cè)定吸收度。結(jié)果吸收度小于0.001，表明輔料不干擾實(shí)驗(yàn)，有較好的專屬性。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下葡萄糖對(duì)照品溶液0.4 mL，按“2.4”項(xiàng)下方法，重復(fù)測(cè)定吸光度6次，結(jié)果6次吸光度的RSD=0.06%（n=6），表明精密度較好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取甘草多糖膠囊（批號(hào)：200402）粉末約0.1 g，精密稱定，平行6份，按“2.1.2”制成供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度A，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品溶液中葡萄糖的含量（mg/g）。結(jié)果平均含量為345.98 mg/g，RSD=1.88 %（n=6）。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批號(hào)樣品（批號(hào)：200402），精密稱取0.1 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度，每間隔 5 min測(cè)定1次，共測(cè)定6次。結(jié)果平均吸光光度為0.3864，RSD值為1.93 %（n=6）。表明樣品甘草多糖測(cè)定在30 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的甘草多糖膠囊（批號(hào)：200402）9份，每份0.05 g，精密稱定，分別精密加入其樣品多糖含量的50 %、100 %、150 %的對(duì)照品溶液，每個(gè)比例加3份，按“2.1.2”制成供試品溶液。分別精密移取 1 mL，按照測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定其吸光度，測(cè)定平均加樣回收率為99.5%，RSD = 3.0%（n=9），表明回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表4。

2.10 樣品的含量 測(cè)定取3批甘草多糖膠囊各0.1 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算其中多糖含量。結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

苯酚-硫酸法是利用多糖在濃硫酸作用脫水生成糠醛衍生物，糠醛與苯酚生成橙黃色化合物，再以比色法測(cè)定［13］。本試驗(yàn)在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，建立正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考察了苯酚、濃硫酸用量和反應(yīng)時(shí)間3個(gè)因素對(duì)甘草多糖含量測(cè)定的影響。最終確顯色條件為即加入苯酚1 mL，硫酸5 mL，放置時(shí)間為30 min。該方法操作簡(jiǎn)便，試劑易得，能快速準(zhǔn)確測(cè)定甘草多糖的含量。

此外，分別選用超聲法、回流法、水浴保溫法以及直接溶解法等4種方式作為樣品中多糖的提取方法制備供試品溶液，在490 nm處測(cè)定吸光度值，結(jié)果顯示，超聲法測(cè)定結(jié)果較高，且操作簡(jiǎn)便，故選用其作為樣品的制備方法。

通過(guò)方法學(xué)考察，驗(yàn)證了本方法精密度高，重復(fù)性好，穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度均較好。采用苯酚-硫酸法測(cè)定甘草多糖膠囊中多糖的含量，方法可行，操作簡(jiǎn)單，可用于甘草多糖膠囊的質(zhì)量控制，對(duì)指導(dǎo)臨床用藥及制訂制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有一定參考價(jià)值。

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