韋 盈，李 川，符郁馥，林志藩，郭曉宇，康 蕊*

（1.海南省食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，海南海口 570314；2.國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（熱帶果蔬質(zhì)量與安全），海南?？?570314；3.海南大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南?？?570228）

芒果，系多年生熱帶、亞熱帶水果，是僅次于香蕉的世界第二大熱帶水果[1]。芒果果實(shí)含有豐富的糖、維生素、蛋白質(zhì)、粗纖維和微量元素，其果肉細(xì)膩可口，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，深受人們喜愛[2]。我國(guó)芒果主要產(chǎn)區(qū)分布于海南、廣西、云南、廣東、四川、福建和臺(tái)灣等省區(qū)[3-4]。目前芒果產(chǎn)業(yè)已經(jīng)成為我國(guó)熱帶和亞熱帶地區(qū)支柱產(chǎn)業(yè)之一，在推進(jìn)農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化調(diào)整、農(nóng)民增收、擴(kuò)大出口和滿足人們的生活需求等方面發(fā)揮著重要作用。

果蔬中農(nóng)藥殘留超標(biāo)是消費(fèi)者最關(guān)注的食品安全問題。馬晨等[5]對(duì)海南芒果中農(nóng)藥殘留情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)芒果中不合格率較高的農(nóng)藥殘留分別是吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺，不合格率分別為21.91%、19.1%、2.81%。目前農(nóng)藥的檢測(cè)方法主要是實(shí)驗(yàn)室儀器法，該方法不僅需要高精端儀器和專業(yè)人員，而且操作復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，很難控制在銷售期內(nèi)完成檢驗(yàn)，無(wú)法有效保證食品安全。因此，利用快速檢測(cè)技術(shù)對(duì)市場(chǎng)上芒果進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測(cè)很有必要。

農(nóng)藥殘留常見的快速檢測(cè)方法是酶抑制率法和拉曼光譜法。酶抑制率法主要用于檢測(cè)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥，由于酶易受色素、植物次生物質(zhì)影響，其適用的種類有限，準(zhǔn)確度也不夠高[6]。拉曼光譜法因需要建立數(shù)據(jù)庫(kù)，且選擇的基底有限，不能被廣泛應(yīng)用。膠體金免疫層析技術(shù)是一種以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，抗原抗體特異性競(jìng)爭(zhēng)的新型檢測(cè)技術(shù)。由于其具備快速、操作簡(jiǎn)單、成本低、無(wú)需貴重設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各檢測(cè)領(lǐng)域。隨著各種農(nóng)藥抗體的成功制備，近幾年該技術(shù)越來越多地被運(yùn)用到農(nóng)藥殘留檢測(cè)中[7]。膠體金免疫層析技術(shù)與酶抑制率法相比，具有靈敏度高、抗干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，可用于單一種類農(nóng)藥殘留的檢測(cè)分析。

吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉是芒果中風(fēng)險(xiǎn)較高的項(xiàng)目，目前沒有同時(shí)檢測(cè)這幾種農(nóng)藥殘留的快速檢測(cè)方法，芒果基質(zhì)的適用性也缺少相應(yīng)研究。本研究旨在對(duì)膠體金免疫層析法同時(shí)檢測(cè)芒果中吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺的快速檢測(cè)技術(shù)開展應(yīng)用研究，以期為芒果質(zhì)量安全監(jiān)管和生產(chǎn)者安全自檢工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

芒果來源于海南省?？谑小|方市、昌江縣果園、農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)和超市；吡唑醚菌酯殘留檢測(cè)試紙條、噻蟲胺殘留檢測(cè)試紙條、吡蟲啉殘留檢測(cè)試紙條和提取液，中檢國(guó)研（北京）科技有限公司；檸檬酸鈉二水合物、檸檬酸鈉二鈉鹽倍半水合物、氯化鈉和無(wú)水硫酸鎂（分析純），廣州化學(xué)試劑廠；甲酸（色譜級(jí)），甲醇、乙腈（質(zhì)譜級(jí)），默克公司；實(shí)驗(yàn)室用水由miili-Q A10超純水機(jī)制備。

對(duì)照品：吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉、苯醚甲環(huán)唑、滅蠅胺、啶蟲脒、丙溴磷、毒死蜱和克百威，純度為99.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TQ-S超高效液相-質(zhì)譜串聯(lián)儀，美國(guó)沃特世公司；XS205、XS204分析天平，美國(guó)梅特勒公司；Centrifuge 5804離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；MS3微量振蕩器，德國(guó)IKA公司；10 μL、200 μL、1 mL、5 mL移液槍，德國(guó)BRAND公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)原理

本方法采用膠體金免疫層析原理。樣品中的吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉等農(nóng)藥經(jīng)提取后與膠體金標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，抑制抗體和試紙條中檢測(cè)線（T線）上抗原的結(jié)合，從而產(chǎn)生檢測(cè)線顏色深淺的變化[8]。通過比較檢測(cè)線（T線）與控制線（C線）顏色變化，對(duì)樣品中吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉進(jìn)行定性判定。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)方法

取新鮮芒果擦去泥土，剪碎成小于1 cm見方的碎片。稱?。?.00±0.05）g樣品至15 mL離心管中，再加入5 mL提取液，蓋上蓋子，渦旋儀渦動(dòng)或手動(dòng)上下振蕩1 min，靜置2 min，得樣品液。從原包裝袋中取出試紙條。用一次性微型吸管吸取樣品提取液，垂直緩慢滴加3滴（約100 μL）于加樣孔（S孔）中。滴加后立即計(jì)時(shí)，10 min后，判定結(jié)果。

1.3.3 結(jié)果判定

本方法采用目測(cè)方式，通過比較檢測(cè)線（T線）與控制線（C線）顏色，定性判定樣品中是否含有待測(cè)物。如圖1所示，T線與C線顯色相同或T線顯色深于C線，表示樣品中未檢出待測(cè)物或待測(cè)物濃度低于檢測(cè)限，判為陰性（-）；T線顯色淺于C線，或者T線消失，表示樣品中有待測(cè)物檢出，判為陽(yáng)性（+）；C線不顯色，表示試紙條已失效或前處理操作不正確，判為無(wú)效[8]。

圖1 結(jié)果判定示意圖（比色法）

1.3.4 評(píng)價(jià)方法

每個(gè)項(xiàng)目取芒果空白基質(zhì)60份，設(shè)置空白樣品、檢出限1倍、檢出限2倍3個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平20例進(jìn)行驗(yàn)證評(píng)價(jià)，對(duì)建立的快速檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度、特異性、假陰性率、假陽(yáng)性率以及與參比方法一致性的分析，評(píng)價(jià)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。

1.3.5 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)

取芒果空白樣品18份，分為3組，使用苯醚甲環(huán)唑、丙溴磷、滅蠅胺、毒死蜱、啶蟲脒和克百威有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)，使每組每個(gè)樣品的干擾物濃度分別為5 mg·kg-1，吡唑醚菌酯殘留檢測(cè)試紙條、噻蟲胺殘留檢測(cè)試紙條、吡蟲啉殘留檢測(cè)試紙條各測(cè)試一組樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 制樣方式優(yōu)化

取新鮮芒果分成2份，一份剪碎成小于1 cm見方的碎片，另一份用組織搗碎機(jī)勻漿，稱取2 g樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。制樣方式不同，膠體金卡呈現(xiàn)的顯色效果不同。芒果被均質(zhì)后樣品內(nèi)容物釋放，對(duì)顯色造成一定的干擾，不利于結(jié)果的判定，且試驗(yàn)過程中容易堵塞加樣孔。故本研究采用剪碎成小于1 cm見方的碎片為制樣方式。

2.2 提取時(shí)間優(yōu)化

設(shè)置提取時(shí)間為1 min、2 min、5 min、10 min、30 min、60 min和120 min，稱取2 g樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，提取時(shí)間對(duì)陰性樣品幾乎無(wú)影響；對(duì)于陽(yáng)性樣品，提取時(shí)間為1 min、2 min、5 min、10 min和30 min時(shí)，目標(biāo)物均可被很好地提取，30 min后隨著提取時(shí)間增加，受環(huán)境影響目標(biāo)物有所降解，陽(yáng)性變?nèi)?。綜合考慮樣品提取時(shí)間以2～5 min為最佳，超過30 min未測(cè)定應(yīng)重新取樣進(jìn)行處理。

2.3 免疫反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化

設(shè)置免疫反應(yīng)時(shí)間為1 min、2 min、5 min、8 min、10 min、15 min和30 min，稱取2 g樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。免疫反應(yīng)2 min時(shí)，樣品可從樣品孔沿NC膜（硝酸纖維素膜）層析至試紙條頂端，此時(shí)T線、C線初步顯色，但顯色不明顯；2～5 min時(shí)，T線、C線繼續(xù)增強(qiáng)，5 min時(shí)可以判讀結(jié)果；5～8 min時(shí)，T線、C線顯色繼續(xù)增強(qiáng)，變化速度有所減慢；8～10 min時(shí)，T線、C線顏色不再增強(qiáng)。綜合考慮，免疫反應(yīng)時(shí)間以10 min為最佳。

2.4 檢出限

《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763—2021）中規(guī)定吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺在芒果中的最大殘留限量分別為0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1，故本快檢方法設(shè)置吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺檢出限分別為0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1。取芒果基質(zhì)空白試樣，分別添加一系列吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，在未稀釋的情況下吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺檢出濃度水平分別為0.050 mg·kg-1、0.100 mg·kg-1、0.005 mg·kg-1，與設(shè)置的檢出限0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1相比，吡唑醚菌酯無(wú)需稀釋，可直接測(cè)定；吡蟲啉、噻蟲胺試紙條較靈敏，需稀釋后測(cè)定，稀釋倍數(shù)分別為2和8。

2.5 評(píng)價(jià)結(jié)果

根據(jù)樣品制備信息和快篩檢測(cè)結(jié)果，3個(gè)項(xiàng)目評(píng)價(jià)結(jié)果如下。①吡蟲啉、噻蟲胺兩個(gè)項(xiàng)目假陰性率、假陽(yáng)性率均為0%，靈敏度、特異性、相對(duì)準(zhǔn)確度均為100%，表明該方法在設(shè)置的檢出限處檢得出、檢得準(zhǔn)。②吡唑醚菌酯40個(gè)陽(yáng)性樣品中被檢出2個(gè)陰性結(jié)果，且2個(gè)陰性結(jié)果均出現(xiàn)在1倍檢出限樣品中，其靈敏度、特異性、假陰性率、假陽(yáng)性率、相對(duì)準(zhǔn)確度分別為95%、100%、5%、0%、96.7%，說明吡唑醚菌酯與吡蟲啉、噻蟲胺相比靈敏度還需進(jìn)一步提高。③3個(gè)項(xiàng)目均滿足靈敏度≥95%、特異性≥85%、假陰性率≤5%、假陽(yáng)性率≤15%的要求，建立的快速檢測(cè)方法具有一定的可行性。

2.6 交叉實(shí)驗(yàn)

使用本方法檢測(cè)含有5 mg·kg-1苯醚甲環(huán)唑、丙溴磷、滅蠅胺、毒死蜱、啶蟲脒和克百威的樣品，結(jié)果如表1。吡唑醚菌酯檢測(cè)試紙條、吡蟲啉檢測(cè)試紙條、噻蟲胺檢測(cè)試紙條對(duì)其他農(nóng)藥均呈現(xiàn)陰性，方法特異性好。

表1 交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品測(cè)試及一致性分析

從市場(chǎng)上采集40份芒果樣品，同時(shí)按照參比方法《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 植物性食品中331種農(nóng)藥及其代謝物殘留量的測(cè)定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》（GB 23200.121—2021）和本研究所建立的快檢方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)試，比對(duì)數(shù)據(jù)見表2。膠體金試紙條檢出噻蟲胺4批陽(yáng)性，分別為澳芒1批次、貴妃芒2批次、蘋果芒1批次；吡唑醚菌酯1批次陽(yáng)性，為雞蛋芒；吡蟲啉未檢出陽(yáng)性。膠體金試紙條檢測(cè)結(jié)果與參比方法檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，建立的快檢方法準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)論

本研究基于膠體金免疫層析技術(shù)原理，針對(duì)芒果中風(fēng)險(xiǎn)較高的吡唑醚菌酯、噻蟲胺、吡蟲啉3種農(nóng)藥殘留建立了一種同時(shí)檢測(cè)的快速檢測(cè)方法。該方法吡唑醚菌酯、吡蟲啉、噻蟲胺檢出限分別為0.05 mg·kg-1、0.20 mg·kg-1、0.04 mg·kg-1，符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的要求，且操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確度高，成本低，適合缺乏實(shí)驗(yàn)條件的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、進(jìn)出口港口對(duì)大量樣本進(jìn)行快速篩查，大大提高芒果的檢測(cè)效率以及發(fā)現(xiàn)問題的能力，為食品安全的科學(xué)監(jiān)管提供了有力的技術(shù)支撐。