黃佳玲，劉建華，劉艷梅，蘇燕文

（廣東廚邦食品有限公司，廣東陽江 529500）

醬油釀造主要包含制曲與發(fā)酵兩大過程，制曲過程是醬油釀造的重要環(huán)節(jié)。米曲霉在制曲過程中發(fā)揮著重要作用，其分泌產(chǎn)生的各種酶，為醬油發(fā)酵的原料分解、物質(zhì)轉(zhuǎn)化合成奠定了基礎(chǔ)[1]。醬油制曲過程中蒸料時間、米曲霉接種量、制曲溫度、制曲時間對成曲品質(zhì)指標（蛋白酶比活力、谷氨酰胺酶比活力）均具有影響，其中接種量對蛋白酶比活力的影響最大[2]。醬油制曲用的米曲霉一般是由其母種經(jīng)過3～4代擴大培養(yǎng)而來，統(tǒng)稱為種曲。種曲是醬油生產(chǎn)制曲的種子，種曲制作的主要目的是為醬油生產(chǎn)提供大量種子，即孢子[3]。但不同菌株產(chǎn)孢子能力不同，即使使用相同菌株培養(yǎng)所得的種曲，其孢子數(shù)也有很大不同[4]。實際生產(chǎn)中，為便于生產(chǎn)操作控制落實，制曲過程接入種曲時，往往是以培養(yǎng)種曲用的對應(yīng)干物料的重量計算種曲重量，此時接入的種曲量雖相同，但不同培養(yǎng)工藝培養(yǎng)所得種曲本身的干基孢子數(shù)仍存在較大差異，會導(dǎo)致制曲接入的有效孢子數(shù)差異較大，進而可能會導(dǎo)致不同批次間制曲的質(zhì)量產(chǎn)生較大波動，不利于產(chǎn)品品質(zhì)的穩(wěn)定。因此，需要找到制曲過程中種曲（米曲霉孢子）有效接種量的最優(yōu)控制水平，用以控制生產(chǎn)并提升產(chǎn)品的質(zhì)量與穩(wěn)定性。

本文采用不同米曲霉孢子有效接入量進行醬油制曲與發(fā)酵，跟蹤監(jiān)測不同時間曲料感官、制曲酶活的高低及不同時間發(fā)酵過程中常見理化指標，以期為企業(yè)大生產(chǎn)中的種曲接種量的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種與原料

菌種，廣東廚邦食品有限公司自培米曲霉三角瓶菌種；制曲與發(fā)酵過程所用原材料麩皮、黃豆、小麥、食用鹽，均從市場采購。

1.2 儀器與設(shè)備

IKA RH磁力攪拌器，廣州綠百草科學(xué)儀器有限公司；25×16血球計數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；E100顯微鏡，南京江南永新光學(xué)有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KDC-2C型微量凱式定氮儀，上海纖檢儀器有限公司；Biochrom 30+全自動氨基酸分析儀，英國柏楉有限公司；200 kg種曲機，江蘇華暉環(huán)?？萍加邢薰?；發(fā)酵池，廣東廚邦食品有限公司設(shè)計自制；65 m3發(fā)酵罐，連云港中復(fù)連眾復(fù)合材料集團有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 種曲培養(yǎng)方法

麩皮原料直接均勻按1.0～1.5 cm的厚度裝滿曲盤后，放入種曲機；以180～200 mL·min-1的噴水量補濕25～30 min，同步開啟種曲機風(fēng)機；啟動種曲機的自動滅菌與冷卻功能，自動通入蒸汽升溫至120～125 ℃，保壓滅菌25～30 min對麩皮培養(yǎng)基進行滅菌，而后自動冷卻使培養(yǎng)基的溫度降至35～40 ℃；接入（6±2）‰的三角瓶菌種，并同步開啟種曲機風(fēng)機20～30 min，接種完畢；控制加濕噴頭的噴水量在270～300 mL·min-1對接種后的培養(yǎng)基加濕（120±5） min，同步開啟種曲機風(fēng)機；通過種曲機的自動培養(yǎng)程序進行自動控溫、加濕和通風(fēng)，同時整個培養(yǎng)過程中種曲機風(fēng)機需保持一直開啟。其中，培養(yǎng)溫度為28～36 ℃，通風(fēng)量為5～7 m3·h-1，以180～200 mL·min-1的噴水量間斷性加濕培養(yǎng)至72 h，最終培養(yǎng)獲得成熟種曲[5]。

1.3.2 種曲有效接種量對醬油制曲的影響

將按1.3.1種曲培養(yǎng)方法培養(yǎng)所得的種曲依據(jù)其干基孢子數(shù)折算為60億個/g、80億個/g、100億個/g、120億個/g和140億個/g不同干基孢子數(shù)的種曲（折算方法詳見表1），再統(tǒng)一以3‰（W/W）的接種量將折算后種曲接入制曲原料進行大曲培養(yǎng)。其間，培養(yǎng)至第15～16 h進行第一次翻曲，繼續(xù)培養(yǎng)至第21～24 h進行第二次翻曲，培養(yǎng)至44 h獲得成熟大曲[6]。每組試驗需記錄第一、二次翻曲時曲料與成熟大曲的感官狀態(tài)，并以其感官、大曲中性蛋白酶活為判定依據(jù)，初步確定制曲適宜的種曲有效接種量。

表1 不同干基孢子數(shù)種曲的折算方法

1.3.3 種曲有效接種量對醬油發(fā)酵的影響

將1.3.2試驗中初步確定的制曲適宜的種曲有效接種量對應(yīng)組別的成熟大曲分別與2.2倍20%的鹽水混合制醪，以相同投料量和投料時間分別投入65 m3發(fā)酵罐，參照廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造的常規(guī)工藝進行發(fā)酵。在發(fā)酵至10 d、20 d、30 d、60 d、90 d和120 d，分別取其發(fā)酵液檢測總酸、氨基酸態(tài)氮、全氮、還原糖等常規(guī)指標進行跟進驗證，再結(jié)合1.3.2試驗結(jié)果進一步確認制曲適宜的種曲有效接種量。

1.3.4 在廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝中的應(yīng)用試驗

以成熟大曲的感官、中性蛋白酶活及其90 d發(fā)酵液氨基酸態(tài)氮與全氮為主要指標、90 d發(fā)酵液總酸、還原糖為參考指標，驗證1.3.2與1.3.3共同確認的種曲有效接種量應(yīng)用于廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝中制曲與發(fā)酵的穩(wěn)定性。按照1.3.1種曲培養(yǎng)方法制備種曲，再按照1.3.2的制曲工藝制備成熟大曲（制曲接種量按照1.3.2與1.3.3共同確認的種曲有效接種量執(zhí)行），而后按照1.3.3的發(fā)酵工藝進行發(fā)酵，發(fā)酵至120 d取其發(fā)酵液進行檢測。上述試驗共開展10批次平行試驗，以驗證其在大生產(chǎn)中的穩(wěn)定性。

1.3.5 數(shù)據(jù)測定方法

孢子數(shù)測定參照《孢子數(shù)測定法》（SB/T 10315—1999）[7]；中性蛋白酶活測定參照《蛋白酶活力測定》（SB/T 10317—1999）[8]；總酸含量參照《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》（GB 12456—2021）[9]，采用第三法自動電位滴定法測定；氨基酸態(tài)氮含量測定參照《食品安全國家標準 食品中氨基酸態(tài)氮的測定》（GB 5009.235—2016）[10]；還原糖含量參照《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》（GB 5009.7—2016）[11]，采用直接滴定法測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 種曲有效接種量對醬油制曲的影響

米曲霉的接種量對醬油制曲的質(zhì)量，特別是其關(guān)鍵指標蛋白酶活有一定影響。在大生產(chǎn)中，制曲接入的種曲量相對固定，但當(dāng)種曲的孢子數(shù)不同時，其不同批次有效米曲霉孢子接入量亦不相同，可能會對制曲質(zhì)量產(chǎn)生影響。試驗通過將種曲折算為不同干基孢子數(shù)的種曲，再按統(tǒng)一的接種量制曲（實際接入的有效孢子數(shù)不同），從而驗證確定制曲適宜的種曲有效接種量，試驗結(jié)果見表2。

表2 種曲有效接種量對醬油制曲影響的試驗結(jié)果

由表2可知，隨著制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)的升高，米曲霉的生長速度逐步加快，開始產(chǎn)生孢子的時間亦有所提前，成熟大曲的孢子量明顯上升。當(dāng)制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)達到140億個/g時，米曲霉生長速度最快，在第二次翻曲時曲料的孢子量已到達生產(chǎn)可接受水平的上限，而成熟大曲感官孢子豐滿、孢子量遠超出生產(chǎn)可接受水平；當(dāng)制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)在120億個/g及以下時，成曲孢子量最多為3個+的水平，均處于生產(chǎn)可接受水平。成熟大曲的中性蛋白酶活則整體呈現(xiàn)先快后慢的上升趨勢，在制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)為120億個/g時，成熟大曲中性蛋白酶活達到最大值（2 757 U·g-1）；制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)繼續(xù)提升至140億個/g時，成熟大曲中性蛋白酶活為2 682 U·g-1，略有下降。這可能是因為種曲有效接種量過大，會引起品溫上升相對較快，易結(jié)塊，不利于通風(fēng)供氧，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，影響米曲霉的生長代謝，導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低。結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗，暫定制曲適宜的種曲有效接種量為接種3‰折算為80～120億個/g干基孢子數(shù)的種曲。

2.2 種曲有效接種量對醬油發(fā)酵的影響

分別采用1.3.2試驗中制曲接種量為接種3‰折算后干基孢子數(shù)為80億個/g、100億個/g、120億個/g的種曲培養(yǎng)所得成熟大曲與鹽水混合制醪，而后發(fā)酵曬制，并跟進發(fā)酵過程中不同天數(shù)發(fā)酵液的總酸、氨基酸態(tài)氮、全氮、還原糖等評價發(fā)酵質(zhì)量優(yōu)劣的主要指標。

2.2.1 發(fā)酵過程總酸的動態(tài)變化

由圖1醬油發(fā)酵過程中總酸的動態(tài)變化可以看出，醬油發(fā)酵過程中，不同組別總酸含量均是在發(fā)酵前90 d快速上升，90 d時基本達到最高水平，而后維持在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。120 d總酸含量有小幅下降，可能是因為某些微生物可以將有機酸轉(zhuǎn)化為其他次級代謝產(chǎn)物[12]?？偹崾轻u油品鑒的風(fēng)味物質(zhì)，且與產(chǎn)品貨架期的體態(tài)穩(wěn)定性相關(guān)，總酸過低會導(dǎo)致醬油體態(tài)不穩(wěn)定，析出絮狀雜質(zhì)或晶體，且影響醬油防腐效果；總酸過高會導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)酸，影響其風(fēng)味的柔和性，并掩蓋發(fā)酵醬油本身的醬香味[13]。因此，結(jié)合生產(chǎn)經(jīng)驗，種曲有效接種量優(yōu)選為接種3‰折算為80億個/g、100億個/g干基孢子數(shù)的種曲。

圖1 醬油發(fā)酵過程中總酸的動態(tài)變化

2.2.2 發(fā)酵過程氨基酸態(tài)氮與全氮的動態(tài)變化

全氮是醬油中可溶性含氮化合物的總稱，包括原料溶出的蛋白質(zhì)、發(fā)酵過程蛋白酶解產(chǎn)生的游離氨基酸、多肽氮、微生物自溶釋放的核酸類水解物等，是衡量原料利用率與醬油發(fā)酵品質(zhì)的重要指標之一。氨基酸態(tài)氮則是指以氨基酸形式存在的氮，也是全氮的一部分，更是區(qū)分不同級別醬油的核心指標之一。發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮與全氮的動態(tài)變化分別見圖2、圖3。

圖2 醬油發(fā)酵過程中氨基酸態(tài)氮的動態(tài)變化

圖3 醬油發(fā)酵過程中全氮的動態(tài)變化

由圖2、圖3可以看出，醬油發(fā)酵過程中，不同組別氨基酸態(tài)氮均呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢，60 d后上升幅度逐漸變緩，發(fā)酵至120 d時，3組醬油的氨基酸態(tài)氮含量分別為1.03 g/100 mL、1.07 g/100 mL、1.07 g/100 mL，均達到國標中對特級醬油的要求。3組中，制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)為100億個 /g與120億個/g的組別，其不同發(fā)酵天數(shù)的氨基酸態(tài)氮均高于制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)為80億個/g的組別。3組醬油發(fā)酵液的全氮含量均呈現(xiàn)為在30 d前快速上升，30 d之后緩慢增加/維持相對穩(wěn)定水平的趨勢，最終發(fā)酵結(jié)束時，3組醬油全氮含量分別為1.57 g/100 mL、1.58 g/100 mL、1.58 g/100 mL，3組全氮水平相當(dāng)、無明顯差異。整體來看，制曲接種的折算后種曲干基孢子數(shù)為100億個/g與120億個/g的組別，發(fā)酵過程全氮溶出與氨基酸生成的速率較快，發(fā)酵結(jié)束時氨基酸態(tài)氮相對較高，但對全氮的最終積累無優(yōu)勢。因此，種曲有效接種量優(yōu)選為接種3‰折算為100億個/g、120億個/g干基孢子數(shù)的種曲。

2.2.3 發(fā)酵過程還原糖的動態(tài)變化

在發(fā)酵過程中，淀粉質(zhì)原料在糖化酶、淀粉酶等的作用下被分解為還原糖，醬油的口感、風(fēng)味、色澤等都與還原糖含量密切相關(guān)[14]。發(fā)酵過程中還原糖的動態(tài)變化見圖4。

圖4 醬油發(fā)酵過程中還原糖的動態(tài)變化

由圖4可以看出，醬油發(fā)酵過程中，3組醬油發(fā)酵液還原糖含量均呈現(xiàn)先上升后逐漸降低的趨勢，在發(fā)酵至第20 d時，3組醬油發(fā)酵液的還原糖含量均達到最大值，分別為6.70 g/100 mL、5.67 g/100 mL、5.35 g/100 mL。這主要是發(fā)酵前期淀粉酶等活力尚處于旺盛期，可以快速將淀粉質(zhì)原料水解成葡萄糖、麥芽糖等還原糖，且此時還原糖的消耗速度較低，所以前期還原糖含量快速上升至最高值。20 d之后，隨著發(fā)酵的持續(xù)進行，乳酸菌、酵母菌等微生物逐漸發(fā)展為優(yōu)勢菌群，將前期積累的還原糖進一步分解代謝為酸類、醇類、酯類等次級代謝產(chǎn)物，故而導(dǎo)致還原糖含量下降。發(fā)酵結(jié)束時，3組醬油的還原糖含量分別下降至5.10 g/100 mL、4.33 g/100 mL、3.25 g/100 mL，第3組醬油的還原糖含量最低，這可能是由于第3組的有效接種量最多，接種量過大導(dǎo)致制曲過程對淀粉質(zhì)的消耗過多所致。結(jié)合產(chǎn)品品質(zhì)控制的需求與生產(chǎn)經(jīng)驗，種曲有效接種量優(yōu)選為接種3‰折算為80億個/g、100億個/g干基孢子數(shù)的種曲。

綜合以上理化指標，3組中第2組醬油的各項指標均能達到生產(chǎn)所需的優(yōu)選水平，因此可繼續(xù)以制曲接種3‰折算后干基孢子數(shù)為100億個/g的種曲進行后續(xù)應(yīng)用試驗。

2.3 優(yōu)選種曲有效接種量應(yīng)用試驗

按照2.2中最終確定的優(yōu)選種曲有效接種量在廣式高鹽稀態(tài)醬油釀造工藝中開展應(yīng)用試驗，其試驗結(jié)果見表3。

表3 優(yōu)選種曲有效接種量應(yīng)用試驗結(jié)果

由表3可知，按照制曲接種3‰折算后干基孢子數(shù)為100億個/g的種曲進行醬油制曲與發(fā)酵應(yīng)用試驗，其培養(yǎng)所得成熟大曲的整體感官菌絲豐滿、孢子量適中，均在生產(chǎn)可接受水平內(nèi)，大曲中性蛋白酶活均在2 000 U·g-1以上的較高水平；所得的大曲進行醬油發(fā)酵時，其120 d醬油發(fā)酵液的總酸含量均值為1.79 g/100 mL，氨基酸態(tài)氮含量均值為1.08 g/100 mL，全氮均值為1.59 g/100 mL，還原糖均值為4.45 g/100 mL，各項理化指標均能達到前期試驗的優(yōu)選水平及以上，整體質(zhì)量水平優(yōu)良穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本文考察了不同種曲（米曲霉孢子）有效接種量對醬油制曲與發(fā)酵的影響，結(jié)果表明，隨著種曲有效接種量的提升，在制曲時，成熟大曲的中性蛋白酶活整體呈先上升后穩(wěn)定的趨勢，接種量提升能夠促進米曲霉加快生長，但提升較多會導(dǎo)致制曲過程產(chǎn)孢子時間大大提前，甚至成熟大曲的孢子量超出生產(chǎn)可接受水平，就生產(chǎn)而言，孢子數(shù)過多可能影響工人操作，同時也不便于后期清潔[15]。在試驗范圍內(nèi)，種曲有效接種量相對較低的試驗組，發(fā)酵結(jié)束時，其總酸與還原糖含量相對較高，能夠達到生產(chǎn)較優(yōu)水平；而種曲有效接種量相對較高時，發(fā)酵過程全氮溶出與氨基酸生成的速率較快，特別是發(fā)酵前期，發(fā)酵結(jié)束時氨基酸態(tài)氮的積累量相對較高，但對全氮的最終積累量無優(yōu)勢。綜合來看，種曲有效接種量優(yōu)選為制曲接種3‰折算后干基孢子數(shù)為100億個/g的種曲。使用該種曲有效接種量進行制曲，培養(yǎng)所得大曲的中性蛋白酶活可穩(wěn)定達到2 000 U·g-1以上的較高水平，且不會出現(xiàn)成熟大曲孢子量超出生產(chǎn)可接受水平的問題；進一步制醪發(fā)酵至120 d時，獲得的醬油總酸含量均值為1.79 g/100 mL，氨基酸態(tài)氮含量均值為1.08 g/100 mL，全氮含量均值為1.59 g/100 mL，還原糖含量均值為4.45 g/100 mL，醬油品質(zhì)能夠達到國標中的特級醬油標準，品質(zhì)優(yōu)良。

為了生產(chǎn)便利，設(shè)定制曲原料總質(zhì)量為Z，將種曲有效接種量優(yōu)選為制曲接種3‰折算后干基孢子數(shù)為100億個/g的種曲進行換算，即制曲接種時適宜的種曲使用量W=Z×3‰×100÷S（S為使用的種曲的干基孢子數(shù)）。如此，針對不同培養(yǎng)工藝/不同批次干基孢子數(shù)差異大的種曲，使用時直接套用上述公式計算出對應(yīng)的種曲使用量進行接種，就可以確保制曲接入的種曲量不同，但接入的孢子量相同，從而提升了制曲的質(zhì)量與穩(wěn)定性，為不同培養(yǎng)工藝的種曲與同工藝孢子數(shù)差異較大的不同批次種曲在企業(yè)大生產(chǎn)中的種曲接種量控制提供了一種參考方案。