高利海，陳秋明，鐘燕華

（精益和泰質(zhì)量檢測(cè)股份有限公司，廣東廣州 510700）

葉酸是一種水溶性維生素，又名蝶酰谷氨酸，在自然界主要以蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷氨酸3種成分結(jié)合成母體化合物而存在[1]。葉酸在蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞分裂與生長過程中具有重要作用，缺少時(shí)會(huì)造成紅細(xì)胞中血紅蛋白減少、細(xì)胞發(fā)育停滯，出現(xiàn)巨幼紅細(xì)胞性貧血疾病[2]。

目前，用來檢測(cè)食品中葉酸含量的常用方法有儀器法（如高效液相色譜法）、試劑盒法（酶聯(lián)免疫吸附法）和微生物法等[3-5]。其中，微生物法是國內(nèi)外普遍采用的檢測(cè)方法，也是我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)推薦檢測(cè)方法，但微生物生長影響因素較多，檢測(cè)方法操作煩瑣，容易造成結(jié)果偏差。因此，為提高試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性與可靠性，本文依據(jù)RB/T 151—2016及GB 5009.211—2022等標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估了微生物法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的不確定度分量，進(jìn)而對(duì)其進(jìn)行合成與擴(kuò)展，用來表征葉酸真值含量范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

CPA225D電子天平（精度0.1 mg）、QUINTIX513-1CN電子天平（精度0.01 mg）來源于賽多利斯；GNP-9270恒溫培養(yǎng)箱來源于精宏；Cary60紫外可見分光光度計(jì)來源于安捷倫。

1.3 方法

按《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中葉酸的測(cè)定》（GB 5009.211—2022）規(guī)定的方法檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量來源

根據(jù)《測(cè)量不確定度的要求》（CNASCL01-G003:2021）、《食品微生物定量檢測(cè)的測(cè)量不確定度評(píng)估指南》（RB/T 151—2016）等文件評(píng)定不確定度，確定影響檢測(cè)結(jié)果的主要因素包含重復(fù)性測(cè)量、標(biāo)準(zhǔn)品稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及系列管制備、試樣稱量、試樣溶液配制及系列管制備、儀器偏差及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等幾個(gè)方面。

2.2 各影響因素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

2.2.1 重復(fù)性測(cè)量

按照國標(biāo)方法對(duì)嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量進(jìn)行6次平行測(cè)定，重復(fù)性測(cè)量產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度屬于A類不確定度。重復(fù)性測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 重復(fù)性測(cè)定結(jié)果

根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差為

晞月眼眸如波，朝著青櫻淺淺一漾，溫柔的眼眸中閃過一絲不馴，她柔聲細(xì)語：“妹妹與我都是側(cè)福晉，我怎敢不隨侍在主子娘娘身邊？”她頓一頓，“而且，主子娘娘醒來，未必喜歡看見妹妹?！?/p>

同一個(gè)樣品重復(fù)進(jìn)行2次測(cè)定，結(jié)果取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品稱量

根據(jù)使用的電子天平（精度為0.01 mg）的檢定證書可知，當(dāng)0.01 mg≤m≤5 g時(shí)，允差為±0.5 mg，采用矩形分布，包含因子為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

試驗(yàn)使用減重法稱取20.0 mg葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，稱重2次，1次為去皮空盤質(zhì)量，1次為總質(zhì)量，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.409mg，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(m標(biāo))=0.409/20=0.020 5。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）、《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）查得所使用容量瓶和移液器的最大允許誤差，結(jié)合使用次數(shù)與器具容量，計(jì)算各器具的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（假設(shè)矩形分布，包含因子為），結(jié)果見表2，則標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)系列管制備

根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）查得使用移液器的最大允許誤差，結(jié)合吸取溶液體積，計(jì)算各器具的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（假設(shè)矩形分布，包含因子為），結(jié)果見表3，則標(biāo)準(zhǔn)系列管的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表3 標(biāo)準(zhǔn)系列管制備引入的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成上述2.2.2、2.2.3、2.2.4各因素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.5 試樣稱量

根據(jù)使用的電子天平（精度為0.001 mg）的檢定證書可知，當(dāng)0.02 g≤m≤50 g時(shí)，允差為±0.5 mg，采用矩形分布，包含因子為計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

試驗(yàn)使用減重法稱取0.500 g試樣，稱重2次，1次為去皮空盤質(zhì)量，1次為總質(zhì)量，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為=0.409mg，則相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為urel(m樣)=0.409/500=0.000 818。

2.2.6 試樣溶液配制

根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG646—2006）、《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）查得所使用容量瓶和移液器的最大允許誤差，結(jié)合使用次數(shù)與器具容量，計(jì)算各器具的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（假設(shè)矩形分布，包含因子為），結(jié)果見表4，則試樣溶液配制的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表4 試樣溶液配制引入的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2.7 試樣系列管制備

根據(jù)《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）查得使用移液器的最大允許誤差，結(jié)合移液器吸取體積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度（假設(shè)矩形分布，包含因子為），結(jié)果見表5，則試樣系列管制備的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表5 試樣系列管制備引入的各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

合成上述2.2.5、2.2.6、2.2.7各因素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程y=0.679 8x+0.255 9，截距a=0.255 9，斜率b=0.679 8。測(cè)定次數(shù)為27，測(cè)試點(diǎn)數(shù)據(jù)見表6，則殘差的標(biāo)準(zhǔn)差為

各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的離均差平方和為

式中：Ci為各標(biāo)準(zhǔn)溶液葉酸含量，ng；為各標(biāo)準(zhǔn)溶液葉酸含量平均值，為0.439 ng。

按照GB 5009.211—2022，試樣系列管中分別加入1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL試樣稀釋液，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，即測(cè)定9次，測(cè)得吸光值，葉酸含量見表7。

表7 試樣管葉酸含量

計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.2.9 紫外可見分光光度計(jì)

根據(jù)儀器校準(zhǔn)證書可知，包含因子k=2，置信概率95%，擴(kuò)展不確定度為0.2%，則計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel(S5)=0.002/2=0.001。

2.3 各影響因素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成、擴(kuò)展及表示

2.3.1 各影響因素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量合成、擴(kuò)展

各影響因素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表8所示，則合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

表8 各影響因素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量

當(dāng)包含因子k=2，置信概率95%，計(jì)算其相對(duì)擴(kuò)展不確定度Urel=0.039×2=0.078 6。

2.3.2 測(cè)量不確定度表示

按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定方法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量，均值為66.1 μg/100 g，擴(kuò)展不確定度為U95=0.078 6×66.1 μg/100 g=5.2 μg/100 g，包含因子k=2，置信概率95%。

3 結(jié)論

通過分析和評(píng)估測(cè)定嬰幼兒配方乳粉中葉酸含量的不確定度分量可知，影響較大的因素是重復(fù)性測(cè)量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，其中標(biāo)準(zhǔn)溶液配制影響較大是標(biāo)準(zhǔn)品稱量與標(biāo)準(zhǔn)系列管制備，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為0.020 5和0.017 6，標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.023。因此試驗(yàn)過程中要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，規(guī)范實(shí)驗(yàn)操作流程，加強(qiáng)人員培訓(xùn)，從而獲得更好重復(fù)性，同時(shí)盡量使用高精密度電子天平稱量標(biāo)準(zhǔn)品，購買正規(guī)廠家玻璃器皿，定期計(jì)量和維護(hù)，對(duì)檢測(cè)儀器要定期校準(zhǔn)，以確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。