李 英，岳林濤，張永杰，李 納，王怡凡，關慧敏

（1.山西振東五和醫(yī)養(yǎng)堂股份有限公司，山西長治 046000；2.藥食同源功能食品山西省重點實驗室，山西長治 046000）

益生菌是發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱[1]，其無致病性，高度耐受胃酸和膽汁，能黏附于腸黏膜而阻止病原微生物的依附，有利于提高人體免疫力[2]。目前研究的益生菌以雙歧桿菌、乳酸桿菌為主，還包括一些其他共生的細菌[2]。其主要生理功能包括調節(jié)腸道微生物平衡、改善腸上皮細胞屏障功能、調節(jié)免疫應答、促進消化吸收等[1]。本文對制備的益生菌固體飲料復合粉的腸道調節(jié)作用進行功效驗證，為后期產品調整提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用KM小鼠150只，SPF級，雌性，體重17～20 g，購自河南省實驗動物中心，許可證編號為SCXK(豫)2017-0001，批號為20211126，質量合格證編號為NO.410975211100058024。領取后于動物房適應性飼養(yǎng)1周，在此期間可自由飲水、進食，保持充足的日照和透風。環(huán)境保持清潔恒溫，飼養(yǎng)環(huán)境平均溫度、濕度分別為25 ℃、37%，15～20次/h全新風。飼料（批號：21093213）、墊料（批號：21089813），北京科澳協(xié)力飼料有限公司。

1.2 儀器與試劑

益生菌固體飲料（山西振東五和醫(yī)養(yǎng)堂股份有限公司）；大黃（安國市興華中藥材有限公司）；2,4-二硝基氟苯、蓖麻油（麥克林）；丙酮（天津市風船化學）；D-木糖（阿拉丁）；D-木糖測定試劑盒（索萊寶）；a-淀粉酶試劑盒（南京建成）。

酶標儀（伯騰，EPOCH）；耳腫脹打孔器（原陽縣振華教學儀器、YLS-Q4）；電子pH計（賽多利斯科學儀器，PB-10）；高速離心機（安徽中科中佳科學儀器，HC-2518）；電熱恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器，DZKW）；單人雙面垂直送風凈化臺（上海天恒醫(yī)療器械，JHT-315AB）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組及劑量

將150只小鼠隨機為5組，每組30只，5個組別分別為空白組、模型組和3個劑量組。3個劑量組小鼠益生菌固體飲料灌胃劑量分別設置為人體使用劑量的10倍、20倍、30倍，分別記為低（1 g·kg-1）、中（2 g·kg-1）、高（3 g·kg-1）劑量組。小鼠按劑量每天灌胃1次（灌胃量為0.3 mL/10 g bw，空白組灌胃等體積蒸餾水），連續(xù)灌胃28 d后對動物各項指標進行測定。

1.3.2 建立脾虛模型

制作100%大黃水煎液：取大黃藥材適量，加10倍蒸餾水，煮沸后煎煮9 min，過濾，旋轉蒸發(fā)濃縮至相當于生藥材濃度1 g·mL-1，即得100%大黃水煎液，備用。

實驗第4周建立脾虛小鼠模型，空白組給予等體積蒸餾水；模型組及劑量組小鼠灌胃給予100%大黃水煎液（0.1 mL/10 g bw），小鼠按劑量每天灌胃1次。造模組小鼠出現(xiàn)飲食減少、體重減輕、精神不振、畏懼光、喜歡抱團、皮毛雜亂無光澤和大便黏膩等情況，表示小鼠造模成功。造模成功后開始檢測相關數(shù)據(jù)。

1.3.3 實驗操作

（1）D-木糖含量檢測。各組小鼠隨機選取10只，末次給藥1 h后，灌胃5% D-木糖溶液4 mL·kg-1，40 min后眼球取血，3 500 r·min-1離心10 min得血清，依照D-木糖測試盒說明方法測定。

（2）小鼠腸胃實驗及淀粉酶活性檢測。各組小鼠隨機選取10只，末次灌胃后禁食不禁水，24 h后，給小鼠灌服營養(yǎng)性半固體糊（羧甲基纖維素鈉10 g、奶粉16 g、淀粉8 g、糖8 g、活性炭3 g和蒸餾水100 mL）0.8 mL，于灌胃后30 min摘眼球取血后立即開腹，結扎胃賁門和幽門，取出小腸，剝離后直鋪于白紙上，用直尺測量幽門到回盲腸的距離及幽門至黑色半固體糊推進前沿的距離，以黑色半固體糊推進的距離占幽門至回盲部距離的百分率為小腸推進率。剪去黑色半固體糊部分5 cm，放入5mL EP管中保存，待測pH值。取小鼠的胃，用濾紙擦干后稱其全重，再沿胃大彎剪開胃，洗去胃內容物，稱胃凈重。胃全重與胃凈重的差值為胃內殘留物重量，以胃內殘留黑色半固體糊占所灌胃黑色半固體糊的質量百分比為胃內殘留率。將小鼠血液在3 500 r·min-1下離心10 min得血清，依照淀粉酶測試盒說明方法測定淀粉酶活性。

（3）益生菌固體飲料對免疫耳腫脹的影響。各組剩余小鼠10只，用剃毛器清理小鼠腹部皮毛（面積為3 cm×3 cm），將2,4-二硝基氟苯（2,4-Dinitrofluorobenzene，DNCB）溶液涂抹于小鼠腹部（50 μL/只），繼續(xù)給藥4 d后，將20 μL DNCB溶液涂抹于小鼠左耳兩面進行致敏攻擊，攻擊24 h后頸椎脫臼處死小鼠，用直徑8 mm打孔器打下左右兩側同部位的耳片，精密稱重，以左右耳片質量之差為腫脹度。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用（）表示，使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析，用單因素方差分析及T檢驗，P＜0.05代表有統(tǒng)計學差異。

2 結果與分析

由表1可知，模型組與空白組比較，模型組D-木糖含量、淀粉酶活性顯著降低，耳腫脹度顯著上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。劑量組與模型組比較，各劑量組D-木糖含量、高劑量淀粉酶活性顯著升高，各劑量組耳腫脹度均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

表1 小鼠D-木糖、淀粉酶活性、耳腫脹及腸胃檢測結果

大黃水煎液可致小鼠腹瀉，表現(xiàn)為胃部固攝能力減弱、腸道蠕動加快，導致腸道水分吸收減少，胃液下流，腸道pH降低。由表1可知，模型組與空白組比較，模型組腸推進率顯著升高、胃殘留率顯著降低、小腸內容物pH值顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。劑量組與模型組比較，中、高劑量組腸推進率顯著降低，中劑量組胃殘留率顯著升高，中、高劑量組小腸內容物pH值顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

3 結論與討論

木糖是一種常見的五碳糖，不會存在于血液中，服用后由小腸吸收，肝臟不代謝，由腎臟排出，因此口服D-木糖可反映小腸吸收功能狀況[3-4]。α-淀粉酶是腸液中的主要消化酶，由胰腺分泌，在小腸中保持較高的濃度[5]。徐復霖等[6]研究了兩種不同脾虛造模方法對小鼠腸液分泌及淀粉酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)大黃致虛可使淀粉酶活性降低。淀粉酶是一種非常重要的消化酶，淀粉酶如果分泌不足、活性降低，機體的消化功能就會受到影響[3]。小腸是消化管中最長的部分，是消化、吸收的主要部位，D-木糖和淀粉酶活性可反映小腸的消化吸收能力。

腸道菌群是一個相對比較復雜且非?；钴S的微生態(tài)系統(tǒng)，數(shù)量和種類很龐大，與大多數(shù)疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸等聯(lián)系非常緊密，又被稱為控制人體健康的“第二基因組”[7]。腸道的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)是保證腸道菌群穩(wěn)定的外在表現(xiàn)，當腸道菌群平衡被打破，其環(huán)境也會出現(xiàn)變化。測定腸道內容物pH值，可間接觀測腸道菌群穩(wěn)態(tài)。

中醫(yī)的脾是涉及消化吸收、水鹽代謝、能量轉化、血液、免疫及神經內分泌等多系統(tǒng)的綜合功能單位，脾虛證即是這些系統(tǒng)功能降低的綜合表現(xiàn)[8]。故脾虛證是以消化吸收功能低下為主的多器官和多系統(tǒng)功能減弱的綜合病理變化[9]。過量或長期服用苦寒藥（如大黃）會損傷脾胃、耗傷正氣，而產生脾虛[9]。大黃性寒、味苦，主要功效是攻下積滯等；主要藥效活性成分為蒽醌類、蒽酮類等；現(xiàn)代臨床研究表明，大黃瀉下作用是由于蒽醌代謝產生蒽酮，其瀉下作用使得腸道菌群紊亂，大量有益菌屬被排出，腸道內微生態(tài)平衡被打破，短時間內調節(jié)腸道正常蠕動的菌群難以恢復平衡所導致[10]。常見的腸推進及胃殘留實驗，可直觀地觀測腸胃功能變化。

實驗結果表明，益生菌固體飲料可減緩由大黃水煎液灌胃導致的腸胃消化吸收能力下降，提高D-木糖含量和淀粉酶活性；可調節(jié)小鼠胃腸道蠕動能力，降低由大黃刺激性瀉下作用導致的胃腸道異常蠕動；并可恢復腸道pH值，調節(jié)由于大黃作用有益菌屬排出導致的腸道菌群失衡，恢復腸道菌群微生態(tài)平衡；并可降低小鼠耳腫脹度，提高免疫力。綜上所述，益生菌固體飲料具有腸道調節(jié)作用，并可增強免疫力。