吳夢(mèng)露,孫清明,吳嬌嬌,王 凱,楊 旸,楊益眾,蘇宏華

(1.揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009; 2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣州 510640)

0 引 言

【研究意義】昆蟲通常以取食和呼吸等方式吸收環(huán)境中的鎘,并不斷積累,對(duì)自身的生長(zhǎng)發(fā)育和生殖等產(chǎn)生影響,如不同蟲態(tài)存活率的改變、發(fā)育歷期的縮短/延長(zhǎng)、產(chǎn)卵量的刺激/抑制、卵孵化率的提高/降低等[1]。具有類雌激素作用,可擾亂哺乳動(dòng)物的內(nèi)分泌系統(tǒng),從而干擾雌激素和孕激素的分泌,使卵泡的發(fā)育受到影響,而且對(duì)哺乳動(dòng)物的生殖細(xì)胞具有直接的毒害作用,甚至?xí)绊懟虻谋磉_(dá)[2-3]。保幼激素(JH)和蛻皮激素(MH)在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖中發(fā)揮至關(guān)重要的作用,共同調(diào)控昆蟲的變態(tài)發(fā)育[4]。在昆蟲的幼蟲期,JH能夠阻止由MH引起的變態(tài)發(fā)育過(guò)程,從而使幼蟲經(jīng)歷蛻皮后依舊維持幼蟲的形態(tài);在幼蟲的最后一次蛻皮前,JH濃度會(huì)逐漸降低甚至消失,導(dǎo)致昆蟲能夠在MH的作用下完成變態(tài)發(fā)育[5]。【前人研究進(jìn)展】昆蟲體內(nèi)的JH和MH滴度受多種外源因素的影響,如溫度、化學(xué)藥劑、天敵寄生、紫外線照射等。棉鈴蟲HelicoverpaarmigeraHübner在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的紫外線照射后,體內(nèi)的JH滴度明顯降低[6];長(zhǎng)紅獵蝽Rhodniusprolixus在低溫時(shí)體內(nèi)合成JH較多,而在高溫時(shí)合成MH較多[7];煙粉虱BemisiatabaciGennadius在被雙斑恩蚜小蜂EncarsiiabimaculateHeraty et Polaszek寄生后,其高齡若蟲體內(nèi)的JH和MH含量能夠維持在低齡若蟲的水平[8];小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaLinnaeus 3齡初孵幼蟲經(jīng)喜樹堿處理后,體內(nèi)的JH滴度升高,MH滴度下降[9]。【本研究切入點(diǎn)】保幼激素和蛻皮激素在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。關(guān)于重金屬鎘對(duì)昆蟲兩大重要激素-保幼激素和蛻皮激素滴度的影響目前未見報(bào)道。而有關(guān)鎘脅迫對(duì)昆蟲體內(nèi)保幼激素和蛻皮激素滴度影響的研究還少見報(bào)道。甜菜夜蛾SpodopteraexiguaHübner是一種多食性農(nóng)業(yè)害蟲[10],主要危害蔬菜、棉花、花生、煙草、玉米、大豆等35科108屬138種作物,尤以蔬菜受害最重[11]。甜菜夜蛾具有很強(qiáng)的遷飛能力,是目前報(bào)道的鱗翅目夜蛾科昆蟲中遷飛距離最遠(yuǎn)的昆蟲。若使用化學(xué)藥劑,會(huì)使得甜菜夜蛾對(duì)有機(jī)氯、有機(jī)磷、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、苯甲酰胺類及多殺菌素等多種不同作用機(jī)制的農(nóng)藥產(chǎn)生不同程度的抗性[12]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用鎘含量分別為0、0.2、3.2和51.2 mg/kg的人工飼料飼喂甜菜夜蛾初孵幼蟲直至化蛹,研究不同濃度重金屬鎘對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)保幼激素和蛻皮激素的滴度影響,為重金屬污染對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育及種群發(fā)展動(dòng)態(tài)的影響提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

甜菜夜蛾蛹由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供,在LED光照恒溫培養(yǎng)箱中用人工飼料飼養(yǎng)10代后,選擇健康的蟲源作為材料。將甜菜夜蛾成蟲產(chǎn)的卵放置于一次性紙碗(上口徑13 cm,底直徑10 cm,高度7.5 cm)中,待卵孵化后,加入人工飼料,每天更換飼料,待養(yǎng)至3齡后分盒飼養(yǎng),每盒放置15頭,飼養(yǎng)溫度設(shè)定為(26±1)℃,相對(duì)濕度為70%±10%,光周期L//D=14 h//10 h。

1.2 方 法

1.2.1 人工飼料的配制

人工飼料的配方由李騰武等[13]的配制方法改良后得到。稱取100 g大豆粉、100 g玉米粉、50 g麥麩、80 g酵母粉和5 g干酪素,放置于干凈的塑料盒中,混合均勻后放入烘箱中,以120℃烘2 h;烘好后取出,稱取10 g白砂糖倒入其中,再向其中倒入450 mL開水,攪拌均勻備用。將450 mL清水煮開,加入25 g瓊脂,攪拌至瓊脂完全融化,再加入5 g山梨酸、3 g檸檬酸、5 g抗壞血酸、2 g復(fù)合維生素、1 g膽固醇、1 g氯化膽堿和0.5 g紅霉素,攪拌均勻后將之前配好的各飼料成分倒入鍋中充分?jǐn)嚢琛⑴浜玫娘暳涎杆偃〕龅谷胍严镜娘暳虾兄?冷卻至室溫后再放入冰箱保存,以防止腐敗變質(zhì)。

1.2.2 含重金屬鎘的人工飼料配制

步驟基本同上,加入清水時(shí)要減去加入的重金屬溶液的體積。在加入5 g山梨酸、3 g檸檬酸、5 g抗壞血酸、2 g復(fù)合維生素、1 g膽固醇、1 g氯化膽堿和0.5 g紅霉素后攪拌,待攪拌均勻后用移液槍吸取一定量的氯化鎘水溶液(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)加入其中并充分?jǐn)嚢?配制成鎘濃度分別為0.2、3.2和51.2 mg/kg的重金屬鎘人工飼料。

1.2.3 甜菜夜蛾體內(nèi)保幼激素和蛻皮激素滴度的測(cè)定

1.2.3.1 樣本收集

甜菜夜蛾卵孵化后,分別用鎘含量為0、0.2、3.2和51.2 mg/kg的人工飼料飼喂,每日觀察甜菜夜蛾的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)度。收集每個(gè)處理的3齡末和5齡末幼蟲、羽化后的1日齡雌成蟲和雄成蟲各30頭(3次重復(fù),每次重復(fù)10頭),放入液氮中,快速冷凍樣本,置于-20℃冰箱中備用。

1.2.3.2 甜菜夜蛾保幼激素和蛻皮激素的測(cè)定方法

向盛有樣本的離心管中加入試驗(yàn)樣本重量9倍的PBS(pH7.4),用研磨儀將樣本充分研磨,3 000 r/min離心10 min。取上清液保存于新的離心管中。分別取10 μL上清液用于測(cè)定保幼激素和蛻皮激素,其余放入-20℃冰箱中冷凍保存以備它用。

甜菜夜蛾體內(nèi)保幼激素和蛻皮激素含量的測(cè)定分別使用昆蟲保幼激素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(YX-110800I)和昆蟲蛻皮激素酶聯(lián)免疫分析試劑盒(YX-050304I)(橋杜生物科技有限公司,上海),試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELASA)。往預(yù)先包被昆蟲激素捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過(guò)溫浴并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的昆蟲保幼激素(JH)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),以此計(jì)算樣品JH及MH濃度即滴度的大小。操作步驟參見試劑盒使用說(shuō)明。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Excel軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理,試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。利用SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,利用Duncan氏法進(jìn)行多重比較,分析CK與各濃度鎘處理組各齡期保幼激素和蛻皮激素滴度之間的差異性,顯著水平設(shè)置為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 保幼激素和蛻皮激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

研究表明,保幼激素和蛻皮激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線均呈線性關(guān)系,線性回歸方程分別為Y=0.009 7X+0.074 7和Y=0.260 3X+0.086 9,相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.999 1。2條標(biāo)準(zhǔn)曲線均可用于甜菜夜蛾體內(nèi)保幼激素和蛻皮激素滴度的定量分析。

2.2 重金屬鎘處理對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)保幼激素滴度的影響

研究表明,0.2 mg/kg鎘處理組中3齡幼蟲體內(nèi)的保幼激素滴度顯著高于對(duì)照,比對(duì)照組上升18.37%;3.2和51.2 mg/kg鎘處理組中3齡幼蟲體內(nèi)的保幼激素滴度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。0.2 mg/kg鎘處理組中5齡幼蟲體內(nèi)的保幼激素滴度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;3.2和51.2 mg/kg鎘處理組中5齡幼蟲體內(nèi)的保幼激素滴度顯著低于對(duì)照,分別下降18.85%、24.66%。0.2、3.2和51.2 mg/kg鎘處理組中雌成蟲體內(nèi)的保幼激素滴度顯著高于對(duì)照,與對(duì)照組相比分別提高了215.71%、205.55%、249.35%。0.2、3.2和51.2 mg/kg鎘處理組中雄成蟲體內(nèi)的保幼激素滴度顯著高于對(duì)照組,分別提高446.65%、442.90%以及453.08%。0.2 mg/kg鎘處理組中3齡5齡幼蟲體內(nèi)的保幼激素滴度顯著高于3.2和51.2 mg/kg鎘處理組;而雌雄成蟲中0.2、3.2、51.2 mg/kg鎘處理后保幼激素滴度無(wú)顯著差異。表1

表1 不同鎘濃度脅迫下不同發(fā)育階段甜菜夜蛾體內(nèi)保幼激素滴度變化

2.3 重金屬鎘處理對(duì)甜菜夜蛾體內(nèi)蛻皮激素滴度的影響

研究表明,51.2 mg/kg鎘處理組中3齡幼蟲體內(nèi)的蛻皮激素滴度顯著低于對(duì)照,下降了48.14%;0.2、3.2 mg/kg鎘處理組中3齡幼蟲體內(nèi)的蛻皮激素滴度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。0.2 mg/kg鎘處理組中5齡幼蟲體內(nèi)的蛻皮激素滴度顯著高于對(duì)照,升高了140.38%;3.2、51.2 mg/kg鎘處理組中5齡幼蟲體內(nèi)的蛻皮激素滴度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。0.2、3.2、51.2 mg/kg鎘處理組中雌成蟲體內(nèi)的蛻皮激素滴度都顯著低于對(duì)照,與對(duì)照組相比分別下降了19.13%、22.38%和16.32%。0.2、51.2 mg/kg鎘處理組中雄成蟲體內(nèi)蛻皮激素滴度與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異;3.2 mg/kg鎘處理組中雄成蟲體內(nèi)的蛻皮激素滴度顯著低于對(duì)照,下降了29.20%。另外,51.2 mg/kg鎘處理組中3齡、5齡幼蟲體內(nèi)蛻皮激素滴度顯著低于3.2 mg/kg鎘處理組,51.2 mg/kg鎘處理組雄成蟲體內(nèi)的蛻皮激素滴度顯著高于3.2 mg/kg鎘處理組。表2

表2 不同鎘濃度脅迫下不同發(fā)育階段甜菜夜蛾體內(nèi)蛻皮激素滴度變化

3 討 論

3.1鎘對(duì)昆蟲繁殖力(產(chǎn)卵量、卵孵化率等)具有顯著作用[14-16],曹紅妹[17]將含鎘的人工飼料飼養(yǎng)亞洲玉米螟幼蟲,雌蛾的產(chǎn)卵量和卵孵化率明顯下降。胡蒙蒙[18]用51.2 mg/kg濃度鎘處理甜菜夜蛾,發(fā)現(xiàn)單雌產(chǎn)卵量較對(duì)照降低了19.7%。鎘可導(dǎo)致昆蟲繁殖力的下降,主要為產(chǎn)卵量減少、卵孵化率降低、卵巢成熟延遲及卵發(fā)育歷期延長(zhǎng)等[1],而鎘對(duì)昆蟲繁殖力的影響機(jī)制目前還沒(méi)有相對(duì)系統(tǒng)的研究。

3.2目前,鎘對(duì)昆蟲配子發(fā)生的影響機(jī)制研究大多以卵黃原蛋白(Vg)為起點(diǎn),因?yàn)槁腰S原蛋白合成是卵黃發(fā)生的基礎(chǔ),是卵子成熟與胚胎發(fā)育

的關(guān)鍵[19],而卵黃發(fā)生是昆蟲生殖調(diào)控的核心[20],直接影響昆蟲的繁殖力。鎘對(duì)卵黃原蛋白的表達(dá)有顯著影響,采用50～400 mg/L鎘處理乳草長(zhǎng)蝽成蟲,導(dǎo)致其卵巢中的卵黃原蛋白多肽水平降低[21]。

3.3保幼激素可調(diào)控卵黃原蛋白(Vg)合成、卵母細(xì)胞的成熟以及卵母細(xì)胞對(duì)卵黃原的吸收[22-23]。在東亞飛蝗Locustamigratoriamanilensis雌成蟲的研究中發(fā)現(xiàn),利用RNAi技術(shù)干擾JH受體基因Met,可以減少Vg的表達(dá)量,同時(shí)阻止卵巢發(fā)育[24]。

3.4蛻皮激素(MH)是由昆蟲的前胸腺合成并分泌的一種類固醇激素,對(duì)調(diào)節(jié)昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝和生殖等具有重要作用[25]。楊欣[26]研究不同濃度的MH對(duì)家蠶蛻皮影響時(shí)發(fā)現(xiàn),注射低濃度蛻皮激素減少了平均蛻皮時(shí)間,死亡率降低了20%。在昆蟲體內(nèi),蛻皮激素主要以20E形態(tài)存在,龐海玉[27]研究發(fā)現(xiàn),用0.1和0.5 mg/L的20E處理異色瓢蟲Harmoniaaxyridis后能縮短幼蟲的發(fā)育歷期。先前的研究結(jié)果顯示,低濃度鎘(0.2、3.2 mg/kg)處理后甜菜夜蛾幼蟲的發(fā)育歷期縮短,高濃度鎘(51.2 mg/kg)處理后幼蟲的發(fā)育歷期顯著延長(zhǎng)[18]。不同濃度鎘處理甜菜夜蛾后,雌成蟲體內(nèi)保幼激素滴度均顯著提高,而高濃度保幼激素及其類似物對(duì)昆蟲繁殖力具有抑制作用[29-30],JH和MH是昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖的重要調(diào)控因子,重金屬鎘脅迫通過(guò)改變昆蟲體內(nèi)JH和MH的滴度進(jìn)而對(duì)昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育和生殖產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

4.1鎘處理后,甜菜夜蛾的產(chǎn)卵量和卵孵化率將顯著下降。

4.2低濃度鎘(0.2、3.2 mg/kg)處理后可使甜菜夜蛾幼蟲蛻皮激素滴度顯著升高;高濃度鎘(51.2 mg/kg)處理后可使甜菜夜蛾幼蟲蛻皮激素滴度顯著降低。在不同鎘濃度處理后,甜菜夜蛾體內(nèi)保幼激素、蛻皮激素滴度將發(fā)生變化,進(jìn)而對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育、生殖調(diào)控發(fā)揮作用。