張立國,郭春貴,常立春,郭新磊,張 濤,武 劍,梁建麗,高 杰,王曉武

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學園藝學院/新疆特色園藝作物種質(zhì)資源與高效生產(chǎn)實驗室,烏魯木齊 830052;2.中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所,北京 100081;3.贛州農(nóng)業(yè)學校,江西贛州 341000)

0 引 言

【研究意義】白菜(BrassicarapaL.)是十字花科蕓薹屬中重要的作物之一[1],其中大白菜(B.rapassp.pekinensis)是重要的蔬菜作物[2]。十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)所引起的一種土傳病害,其病原菌侵染行為只針對十字花科作物[3]。相較于其他防治方法,抗病育種成為當前最為經(jīng)濟有效的防治手段[4]。分子標記輔助育種是通過分子標記對植株基因型直接進行選擇,可排除其他因素的干擾。不同類型的抗病材料則可為抗病育種提供多種抗病基因。穩(wěn)定可靠且能適用于高通量檢測的分子標記與具備多種抗病基因的育種材料是抗病育種的先決條件?！厩叭搜芯窟M展】目前在B.rapa基因組中已定位27個抗根腫病基因位點,絕大多數(shù)抗病位基因來源于歐洲蕪菁(B.rapassp.rapifera)。27個抗病基因位點分布在5條染色體上。其中A03染色體包含14個抗病基因位點,這些抗病基因位點在A03染色體上大致分為2個基因簇,分別位于15.5-16.3Mb與25.2-25.9Mb區(qū)域內(nèi)。15.5-16.3Mb區(qū)域內(nèi)4個抗病位點(BraA.CR.c[5]、Crr3[6]、CRd[7]、PbBa3.2[8])緊密相連;25.2-25.9Mb區(qū)域含有7個抗病位點(Rcr2[9]、BraA.CR.a[5]、Rcr1[10]、Rcr4[11]、CRb[12]、CRa[13]、CRq[14])。A08染色體包含8個抗病基因位點(BraA.CR.b[5]、Crr1a[15]、CRs[16]、PbBa8.1[8]、qBrCR38-2[17]、Rcr3[18]、Rcr9[11]、Rcr9wa[18]);A01染色體包含2個抗病基因位點(pbBa1.1[8]、Crr2[15]);A02染色體包含2個抗病基因位點(CRc[19]、Rcr8[11]);A07染色體包含1個抗病基因位點(QBrCR38-1[17]);其中CRa、CRb、CRd、Crr1a抗病基因已被克隆。競爭性等位基因特異PCR(Kompetitive Allele Specific PCR),簡稱KASP,是一種針對SNP開發(fā)的分子標記檢測方法?？蓪χ付ㄎ恢玫腟NP與Indel進行檢測。KASP標記具有高通量、低成本、分型結(jié)果準確等優(yōu)點。Allen等設(shè)計1190對KASP引物在41份普通小麥中進行基因分型,結(jié)果1 138對引物具有多態(tài)性,標記開發(fā)的有效率達到了96%[20]?？锩偷萚21]開發(fā)了26個KASP標記用于品種純度的快速檢測,為SNP標記技術(shù)在棉花品種鑒定及指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建等方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c】根腫病抗病基因已被報道,但與之相關(guān)的分子標記卻無法滿足對大規(guī)模資源群體進行快速檢測的要求。需篩選出攜帶多種抗根腫病基因的資源材料?！緮M解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)已報道白菜根腫病抗性基因,開發(fā)出具備抗根腫病基因特異性的KASP標記。利用KASP標記在白菜資源材料中快速鑒定出攜帶抗根腫病基因的資源材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

標記測試材料:2019年10底將白菜材料播種至中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所南區(qū)日光溫室(E 116°33′,N 39°96′)。播種材料包含12份商用白菜品種,17份抗根腫病資源品種。其余材料由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所分子遺傳育種實驗室提供,包括11份蕪菁、11份大白菜、11份小白菜。北京新三號為感病對照品種。其中商用白菜品種與抗根腫病資源品種每份播2粒種子,取樣時從不同植株分別取樣。

資源群體材料:共使用白菜資源材料862份,2018年種植在北京順義農(nóng)場(E 116°88′,N 40°17′),取葉片作為樣品保存在-20℃冰箱內(nèi)。材料均由中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所分子遺傳育種實驗室提供。表1

表1 862份白菜資源材料種類與數(shù)量

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取

利用磁珠法提取基因組DNA。使用NanoDrop1000(Thermo,USA)對提取的DNA質(zhì)量進行檢測。將樣品DNA濃度稀釋至10～20 ng/μL,-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 KASP標記開發(fā)

已報道的抗根腫病基因CRa、CRb、CRd、Crr1a的DNA序列與感病白菜參考基因組Chiffu v3.0進行比對,獲得SNP位點。KASP標記引物設(shè)計利用DNAMAN與Primer3軟件。

KASP反應(yīng)在384微孔板中進行。DNA、引物混合物、KASP master mix均由Matrix Arrayer(瀚辰光翼)加至384微孔板內(nèi)。反應(yīng)體系包括DNA模板1 μL,濃度為10～20 ng/μL;KASP master mix(1x)0.11 μL;引物混合物(10 μmol/L)0.89 μL,兩條正向特異競爭性引物與一條反向通用引物比例為1∶1∶2.5。

KASP標記的PCR反應(yīng)共需4個階段,第1階段95℃變性持續(xù)10 min;第2階段95℃持續(xù)變性20s,61℃退火45s,共10個循環(huán)(每次循環(huán)降低0.6℃);第3階段95℃變性20s,55℃退火45s,共37個循環(huán),該過程由Matrix Cycler(瀚辰光翼)水浴PCR儀完成。最終利用Matrix Scanner(瀚辰光翼)讀取樣品熒光信號值,根據(jù)不同的熒光信號來判斷樣品基因型。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗根腫病KASP標記篩選結(jié)果

研究表明,四個不同抗病基因中的SNP位點設(shè)計出42個KASP標記,其中6個KASP標記在測試群體中具有較好的多態(tài)性且重復性良好。表2,表3,圖1,圖2

注:藍色為已定位QTL抗根腫病位點;紅色為已定位顯性抗根腫病位點;綠色為開發(fā)的KASP標記;黑色為修飾位點

圖2 KASP標記分型結(jié)果

表2 已克隆抗根腫病基因KASP引物序列

表3 引物一致率

2.2 種質(zhì)資源內(nèi)抗根腫病基因分布

研究表明,862份材料中包含多種白菜類作物,利用6個KASP標記從中鑒定出含有抗病基因型材料105份,其中標記CRa-3.1檢測出61份為抗病基因型(含有CRa);標記CRBrG3-8檢測出44份為抗病基因型(含有CRb);標記Crr1a-10檢測出7份為純合抗病基因型(含有Crr1a);標記CRd-2G檢測出53份為抗病基因型;標記CRd-3檢測出26份為抗病基因型;標記CRd-4檢測出15份為抗病基因型。CRd-2G、CRd-3、CRd-4都來自CRd基因,當材料中3個CRd標記均為抗病基因型時,材料含有CRd基因,此類材料10份。表4,圖3

表4 862份白菜資源材料中抗感基因型數(shù)量

蕪菁與油用白菜是根腫病抗病基因的主要來源,攜帶4種抗病基因的材料中,該類型材料在CRb中占比最低,為59.09%;10份攜帶CRd抗病基因的材料均為蕪菁與油用白菜類型,占比100%。105份抗病基因型材料中,74份為蕪菁與油用白菜類型,占比70.48%。分布最為廣泛的抗病基因為CRa,占所有抗病材料的58.09%。

單份材料中可同時攜帶多個抗病基因。16份材料同時攜帶2個或2個以上的抗病基因,其中包含12份蕪菁、3份油用白菜與1份Grelos。材料中抗病基因分布為1份材料(SY18Q0717)同時含有CRa、CRb、CRd3個抗病基因;1份材料(SY18Q0980)同時含有CRd、Crr1a兩個抗病基因;4份材料(SY18Q0769、SY18Q0699、SY18Q0664、SY18Q0994)同時含有CRa、CRd2個抗病基因;10份材料(SY18Q0869、SY18Q0821、SY18Q0848、SY18Q0779、SY18Q0972、SY18Q0984、SY18Q0948、SY18Q0985、SY18Q0668、SY18Q0913)同時含有CRa、CRb2個抗病基因。6份材料只含有Crr1a抗病基因;46份材料只含有CRa抗病基因;33份材料只含有CRb抗病基因;4份材料只含有CRd抗病基因。在自然群體中,大多數(shù)抗根腫病基因型材料中只含有單個抗病基因。表5,圖4

圖4 資源材料中抗病基因分布

表5 多基因抗病材料類型與抗病基因分布

3 討 論

3.14個顯性抗根腫病基因(CRd、CRb、CRa、Crr1a)[7,12-13,15]已被成功克隆并驗證功能,根腫病作為危害十字花科作物的主要病害,十字花科作物生產(chǎn)均受其影響[22]。早期對于抗根腫病基因的相關(guān)研究認為抗根腫病這一性狀是由單顯性基因控制[23]。更多抗根腫病基因在不同材料中被定位,不同根腫病生理小種與抗病基因之間存在對應(yīng)關(guān)系。根腫病生理小種不斷變異分化,其致病性各不相同,導致單基因抗根腫病材料的抗病能力逐漸減弱、退化甚至喪失[24]。在同一植株中聚集多個抗病基因的聚合育種成為未來抗根腫病育種的主要方向[25]。

3.2研究對測試材料德高CR117的標記檢測結(jié)果表明其不含CRa、CRb、CRd、Crr1a基因,與前人研究一致[26-27];6個標記檢測感病對照(北京新3號)均為易感基因型;CRa抗病基因來自歐洲蕪菁(ECD02)[13],測試材料中兩份ECD02均攜帶CRa純合抗病基因。研究開發(fā)的KASP標記能對指定抗根腫病基因進行特異性鑒定且分型結(jié)果準確。

3.3研究共鑒定出105份含有抗根腫病基因的資源材料,蕪菁與油用白菜是主要類型;Grelos與意大利菜心同屬于歐洲材料類型,也可能含有抗根腫病基因,16份攜帶多抗病基因材料由12份蕪菁、3份油用白菜與1份Grelos組成,該結(jié)果與絕大部分根腫病抗病基因來源于歐洲蕪菁這一觀點[5-6,8,11,13,15-19]相符合。在少量大白菜材料中鑒定出CRa或CRb抗病基因,可能是由于在現(xiàn)代育種中,通過人工轉(zhuǎn)育將蕪菁抗根腫病基因?qū)氪蟀撞藘?nèi)所造成的。105份攜帶抗病基因的材料可作為后續(xù)抗病育種的親本,為大白菜抗根腫病育種提供豐富的材料與抗病基因來源。

3.4研究中用于KASP標記開發(fā)的DNA序列均來自前人已發(fā)表數(shù)據(jù),利用其成功開發(fā)出可鑒定抗根腫病基因的KASP標記。ECD歐洲根腫病生理小種鑒定系統(tǒng)(European Clubroot Differential Series)是世界上通用的生理小種鑒別系統(tǒng)之一[28],其中鑒別材料ECD01～ECD04均為蕪菁且各自攜帶有不同的抗根腫病基因,其中ECD04材料全基因組測序數(shù)據(jù)已于2021年發(fā)表[29],該材料對多種根腫病生理小種具備抗性;包含多個不同的抗根腫病基因[8,26]。在后續(xù)研究中,可以此數(shù)據(jù)為基礎(chǔ),利用其抗根腫病基因內(nèi)的變異位點設(shè)計分子標記。

4 結(jié) 論

開發(fā)出6個可在自然群體材料中準確鑒定抗根腫病基因的特異性KASP標記。862份白菜資源材料中,105份攜帶有抗根腫病基因,其中蕪菁與油用白菜為主要類型,共計74份,占比70.48%。CRa抗病基因分布數(shù)量最多,共計61份材料攜帶有CRa抗病基因,占所有抗病材料的58.09%?？垢[病基因在自然材料體內(nèi)多以單個基因形式存在,89份材料只攜帶單個抗根腫病基因,體內(nèi)同時聚集2個或2個以上抗根腫病基因的材料共計16份。