王丹丹,李 燕,張慶銀,李世東,龐永超,馬琨芝,馬 龍,牛瑞生,鐘增明,齊連芬,師建華

(1.石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院,石家莊 050041;2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,北京 100091;3.高邑縣農(nóng)業(yè)執(zhí)法大隊(duì),河北高邑 051330;4.高邑縣農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,河北高邑 051330,5.北京啟高生物科技有限公司,北京 100000)

0 引 言

【研究意義】番茄是世界范圍內(nèi)栽培面積最廣的蔬菜作物之一[1-4]。連作種植,土壤連作會造成番茄產(chǎn)量下降、品質(zhì)不佳、生長狀況變差、土傳病害嚴(yán)重等。研究不同微生物菌處理對番茄土壤微生物的影響,對改善土壤微生物多樣性、提高產(chǎn)量有實(shí)際意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】馬云華等[5]、孫艷艷等[6]研究表明隨著黃瓜、番茄連作茬次的增加,根際土壤微生物由細(xì)菌型向真菌型過渡;而與細(xì)菌相比,真菌的繁殖不需要活體細(xì)胞提供營養(yǎng),因此,其傳播途徑更廣、速度更快,對植株產(chǎn)生的危害也就更嚴(yán)重[7]。通過改良土壤、調(diào)整土壤微生態(tài)環(huán)境,可以明顯改善土壤連作障礙造成的一系列問題[8]。土壤微生物是土壤中肉眼看不到的細(xì)小生物的總稱,是土壤不可或缺的重要組成部分,土壤微生物群落的組成和多樣性會影響番茄的生長、產(chǎn)量、土傳病害發(fā)生的程度等[9-12]。微生物可提高土壤酶的活性、增加土壤微生物的復(fù)雜性、改善土壤的抗逆能力[13],近年來常被用于改良土壤微生態(tài)環(huán)境及防治土傳病害問題[14,15]。目前,放線菌已在番茄[16]、甜瓜[17]、辣椒、茄子[18]得到應(yīng)用,枯草芽孢桿菌已在番茄[19]、黃瓜[20]、枸杞[21]等上應(yīng)用,哈茨木霉菌已在茄子[22]、馬鈴薯[23]、蘋果[24]上應(yīng)用?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】微生物菌處理對番茄土壤微生物群落影響的研究已有較多報道,但多種微生物菌處理連作番茄土壤對土壤微生物群落多樣性及與番茄生長相關(guān)性的分析較少。需評估不同微生物菌處理對番茄土壤微生物多樣性的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】研究放線菌、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌3種微生物菌劑處理連作栽培番茄土壤微生物多樣性、與番茄生長相關(guān)性,篩選適宜的微生物菌劑,為促進(jìn)土壤生態(tài)修復(fù)、改善番茄根系環(huán)境提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)在石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院趙縣3號溫室進(jìn)行。試驗(yàn)溫室肥力中等,地力均勻,水利條件良好。

供試番茄品種為農(nóng)博粉18109,由石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院提供,穴盤苗由河北省石家莊市高邑鄗豐種苗公司代育。

放線菌(密旋鏈霉菌及婁徹氏鏈霉菌活性孢子)購自陜西博秦生物工程有限公司,有效活菌數(shù)≥20×108/g;枯草芽孢桿菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,北京啟高生物科技有限公司聯(lián)合研發(fā),有效活菌數(shù)≥2.0×108/g;哈茨木霉由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所研制、海南金雨豐生物工程有限公司出品,有效活菌數(shù)≥2.0×108/g;大量元素水溶肥(N-P2O5-K2O為12-6-40)由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)研制、四川愛隆植物營養(yǎng)科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置4個處理,CK對照為常規(guī)施肥(沖施大量元素水溶肥),T1為常規(guī)施肥+放線菌、T2為常規(guī)施肥+枯草芽孢桿菌、T3為常規(guī)施肥+哈茨木霉,3種菌劑施用量依菌劑活性而定,均于定植前撒施于栽培壟內(nèi)。每個處理3次重復(fù),隨機(jī)區(qū)組排列,共12個小區(qū),小區(qū)面積16 m2。行距為大小行90 cm×70 cm,株距40 cm,2021年3月18日定植,單稈整枝,每株留5穗果,2021年7月10日拉秧。

1.2.2 土壤樣品采集

于番茄的拉秧期采集根圍土壤樣品 (根圍2 cm),采用五點(diǎn)取樣法進(jìn)行采樣。將采集的土壤樣品置于無菌自封袋低溫(干冰)保存并運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,然后存儲于-80℃超低溫冰箱保存用于微生物多樣性測定。

1.2.3 測定指標(biāo)

土壤微生物多樣性:可以根據(jù)不同的相似度水平,對所有序列進(jìn)行OTU劃分,每個OTU對應(yīng)于一種代表序列。該方法能提高測序分析的準(zhǔn)確性[25]。將采集的土壤樣品送至深圳微科盟科技集團(tuán)有限公司,采用Illumina MiseqTM測序技術(shù)進(jìn)行測定,對細(xì)菌的16S rRNA基因和真菌 ITS 基因擴(kuò)增及測序,通過Reads拼接、過濾、去嵌合體等數(shù)據(jù)預(yù)處理,對有效數(shù)據(jù)進(jìn)行操作分類單元(OTU)聚類,進(jìn)行物種注釋及豐度分析,并進(jìn)行Alpha多樣性分析、βeta多樣性分析和顯著物種差異分析等。

株高:用卷尺測量植株最下部到最上部的距離。莖粗:游標(biāo)卡尺測量最上面一穗花的下部莖的粗度。葉長、葉寬:直尺測量成熟葉片的最大葉長和葉寬。產(chǎn)量:電子秤稱重測量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Qiime軟件構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹。采用SPSS18.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和方差分析,用Microsoft Excel 2010進(jìn)行繪圖,LEfSe軟件估算相對豐度差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤微生物數(shù)量

研究表明,T3處理的細(xì)菌含量最多,為109.8×107CFU/g,顯著高于對照和T2,T2的細(xì)菌含量最少。T1的真菌含量最高,為48.6×105CFU/g,與對照和T2間無顯著差異,但顯著高于T3。除T2處理外,其他處理的細(xì)菌和真菌比例均大于對照。表1

表1 土壤中的微生物數(shù)量

2.2 OTU聚類分析

研究表明,4個處理的細(xì)菌共有的OTUs為1 410個,CK、T1、T2、T3的OTU分別為2 344、2 430、1 845、2 513個,T1和T3的細(xì)菌種類多于CK,而T2的細(xì)菌種類少于CK,是由于T1和T3的微生物菌里含有糖類、蛋白質(zhì)等易被細(xì)菌利用的物質(zhì)利于細(xì)菌繁殖。真菌共有的OTUs為85個,CK、T1、T2、T3的OTU分別為157、139、98、133個,微生物菌處理的真菌種類均少于對照。圖1

圖1 土壤中細(xì)菌和真菌的OTU分布

2.3 不同微生物菌處理對番茄土壤微生物Alpha多樣性的影響

研究表明,T2處理的Shannon和Simpson指數(shù)均低于對照,T1和T3處理的Shannon和Simpson指數(shù)均高于對照,放線菌和哈茨木霉的施用可以增加土壤微生物的豐富度和均勻度,而枯草芽孢桿菌的施用未增加土壤微生物豐富度和均勻度。放線菌和哈茨木霉的施用均能提高土壤細(xì)菌群落的多樣性。圖2

圖2 細(xì)菌SHANNON (A)和SIMPSON (B)指數(shù)變化

放線菌、枯草芽孢桿菌和哈茨木霉處理后的Shannon和Simpson指數(shù)均高于對照,放線菌、枯草芽孢桿菌和哈茨木霉處理均提高土壤中真菌群落的多樣性。圖3

圖3 真菌Shannon (A)和Simpson (B)指數(shù)變化

2.4 不同微生物菌處理對番茄土壤微生物Beta多樣性的影響

研究表明,對照、放線菌、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉4個處理中3個重復(fù)的微生物菌群均能聚于一個區(qū)域,各個處理明顯分開,不同處理細(xì)菌間存在差異,相同處理間存在較強(qiáng)的一致性。對每個處理3次重復(fù)取均值,T1和T3首先聚為一類,然后和CK聚為一類,最后和T2聚為一類,T1和T3微生物菌處理的細(xì)菌多樣性較為相似,T1、T3與T2微生物菌處理的細(xì)菌多樣性相似性較差。圖4,圖5

圖4 細(xì)菌NMDS分析

圖5 細(xì)菌屬水平聚類熱圖

各個樣本在圖中的分布較為分散,4個處理間的區(qū)分度較差,不同處理之間的真菌多樣性的差異較小。CK和T2首先聚為一類,T1和T3聚為一類,最后兩類聚為一類。T1和T3微生物菌處理的真菌多樣性較為相似。圖6,圖7

圖6 真菌NMDS分析

圖7 真菌屬水平聚類熱圖

2.5 不同微生物菌處理后番茄土壤微生物群落組成

研究表明,細(xì)菌中Unspecified_iii1_15、Unspecified_RB41、Unspecified_Gemm_5、Unspecified_Syntrophobacteraceae、Kaistobacter為優(yōu)勢細(xì)菌屬。圖8B真菌中Fusarium(鐮刀菌屬)、Unspecified_Chaetomiaceae(未分類毛殼菌科)、Unspecified_Pezizales、Unspecified_Hypocreales_fam_Incertae_sedis、Mortierella(被孢霉屬)為優(yōu)勢真菌屬,4個不同處理均是鐮刀菌屬(Fusarium)的相對豐度最高,分別為73.63%、61.53%、69.67%、65.32%,其次均為未分類毛殼菌科,相對豐度分別為17.06%、24.59%、21.68%、25.03%。圖8

圖8 土壤微生物群落在屬水平上的相對豐度

2.6 與環(huán)境因子的RDA分析

研究表明,細(xì)菌和真菌的3個重復(fù)點(diǎn)距離較近,重復(fù)性好,類群組成相似,且P值均小于0.01,微生物群落變異的解釋方差極顯著。主成分1、2對細(xì)菌群落差異的解釋貢獻(xiàn)率值分別為25.95%和23.25%,對細(xì)菌群落差異的解釋貢獻(xiàn)率值分別為28.94%和25.00%。細(xì)菌和真菌的RDA分析中葉寬的箭頭均最短,葉寬與微生物群落分布間的相關(guān)性最小,葉長、株高、莖粗和產(chǎn)量與微生物群落分布間的相關(guān)性高;細(xì)菌分析中葉長和株高間夾角為銳角,葉長和株高間的相關(guān)性高,而兩者與產(chǎn)量間的相關(guān)性低;真菌分析中葉長與葉寬、株高、莖粗間的夾角都為銳角,葉長與這三者間的相關(guān)性高,與產(chǎn)量間的相關(guān)性低。葉長和株高處于CK象限內(nèi),這兩者與CK的相關(guān)性最高,莖粗與T1的相關(guān)性高,產(chǎn)量與T3的相關(guān)性高;真菌分析中,株高同樣與CK的相關(guān)性高,葉長、葉寬、莖粗與T1的相關(guān)性高,產(chǎn)量與T3的相關(guān)性高。圖9

圖9 樣品與環(huán)境因子RDA

3 討 論

3.1微生物菌處理土壤是當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常用的提高土壤有益微生物種群多樣性、復(fù)雜性,抑制病原菌繁殖很有效的一項(xiàng)農(nóng)藝措施[14, 15]。目前,放線菌、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉菌已在多種作物上得到很好的應(yīng)用。放線菌是一類主要呈菌絲狀生長和以孢子繁殖的陸生性較強(qiáng)大的原核生物,放線菌中的鏈霉菌分泌的某些物質(zhì)對叢枝菌根真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長有促進(jìn)作用[26],而叢枝菌根真菌分泌的某些物質(zhì)又能使有益微生物的活性提高,進(jìn)而改善土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性[27, 28]?？莶菅挎邨U菌是土壤生態(tài)系統(tǒng)中較為常見的根際促生細(xì)菌,具有良好的促生、防病及改善土壤微生態(tài)群落的作用[29, 30]。鄧開英等[31]研究表明,木霉屬真菌可以在根區(qū)占領(lǐng)根部空間,改變土壤中微生物群落組成和功能多樣性,可以防治西瓜土傳病害、誘導(dǎo)產(chǎn)生系統(tǒng)抗性、促進(jìn)生長等作用。研究比較了放線菌、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉3種微生物菌處理對番茄栽培土壤中的微生物數(shù)量的影響,結(jié)果顯示哈茨木霉處理的土壤中細(xì)菌含量最高,放線菌處理的土壤中真菌含量最高,T1、T3的細(xì)菌和真菌的比例均大于對照,土壤微生物呈現(xiàn)“細(xì)菌化”。細(xì)菌和真菌是土壤微生物重要組成部分,能促進(jìn)土壤有機(jī)質(zhì)的分解和養(yǎng)分的轉(zhuǎn)化[4],其數(shù)量和比例變化能夠較為敏感地反映土壤環(huán)境改變帶來的影響、決定土壤功能多樣性[32]。施用微生物菌可以使土壤中細(xì)菌含量上升,真菌含量降低,土壤微生物由“真菌型”轉(zhuǎn)變?yōu)椤凹?xì)菌型”,土壤微生態(tài)趨于平衡,控制土傳病害[33]。馬慧媛等[22]、李鳳霞等[34]研究表明微生物菌劑的施用可以增加土壤中細(xì)菌和真菌的數(shù)量,土壤呈現(xiàn)細(xì)菌化狀態(tài),與研究結(jié)果一致。但是微生物數(shù)量指標(biāo)不能很明確的反映不同微生物菌處理直接的差異。

3.2高通量測序技術(shù)能夠準(zhǔn)確測出微生物的序列,在研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和功能多樣性等方面被越來越多地采用[35, 36]。研究結(jié)果表明,T1和T3的細(xì)菌種類多于CK,T1、T2、T3的真菌種類均少于CK;T2處理的細(xì)菌Shannon和Simpson指數(shù)均低于CK,T1和T3處理的細(xì)菌Shannon和Simpson指數(shù)均高于CK,3種微生物菌處理的真菌Shannon和Simpson指數(shù)均高于CK,放線菌和哈茨木霉菌處理后可以提高土壤微生物群落多樣性。細(xì)菌NMDS分析的結(jié)果顯示,對照、放線菌、枯草芽孢桿菌、哈茨木霉4個處理中3個重復(fù)的微生物菌群均能聚于一個區(qū)域,不同處理細(xì)菌間存在差異,相同處理間存在較強(qiáng)的一致性。屬水平上的聚類熱圖分析顯示,T1和T3首先聚為一類,然后和CK聚為一類,最后和T2聚為一類,T1和T3微生物菌處理的細(xì)菌多樣性較為相似。真菌NMDS分析和屬水平聚類熱圖分析結(jié)果說明,T1和T3微生物菌處理的真菌多樣性較為相似。分析發(fā)現(xiàn)細(xì)菌中Unspecified_iii1_15、Unspecified_RB41、Unspecified_Gemm_5、Unspecified_Syntrophobacteraceae、Kaistobacter為優(yōu)勢細(xì)菌屬,除其他(Other)外,CK、T1、T3中Kaistobacter的相對豐度均最高,T2中芽孢桿菌屬的相對豐度最高。真菌中Fusarium(鐮刀菌屬)、Unspecified_Chaetomiaceae(未分類毛殼菌科)、Unspecified_Pezizales、Unspecified_Hypocreales_fam_Incertae_sedis、Mortierella(被孢霉屬)為優(yōu)勢真菌屬,鐮刀菌屬(Fusarium)在4個不同處理中相對豐度最高,鐮刀菌是一種植物病原真菌,廣泛存在于自然界中,鐮刀菌是一種重要的植物病原真菌,可造成番茄、黃瓜、苜蓿等多個器官多個組織的腐爛[37-39]其中,致病性尖孢鐮刀菌侵染引起的植物枯萎病是一種土傳真菌病害,危害嚴(yán)重[40]。

3.3不同微生物菌處理與環(huán)境因子RDA分析結(jié)果表明,細(xì)菌和真菌的微生物群落變異的解釋方差極顯著。細(xì)菌和真菌中葉寬與微生物群落分布間的相關(guān)性均最小,葉長、株高、莖粗和產(chǎn)量與微生物群落分布間的相關(guān)性高;葉長和株高間的相關(guān)性高,而兩者與產(chǎn)量間的相關(guān)性低;真菌分析中葉長與葉寬、株高、莖粗三者間的相關(guān)性高,與產(chǎn)量間的相關(guān)性低。細(xì)菌分析中,葉長和株高與CK的相關(guān)性最高,莖粗與T1的相關(guān)性高,產(chǎn)量與T3的相關(guān)性高;真菌分析中,株高同樣與CK的相關(guān)性高,葉長、葉寬、莖粗與T1的相關(guān)性高,產(chǎn)量與T3的相關(guān)性高。微生物菌劑通過多種作用機(jī)制可促長增產(chǎn)[41],研究結(jié)果與其一致。

4 結(jié) 論

哈茨木霉處理的土壤中細(xì)菌含量最高,放線菌處理的土壤中真菌含量最高,放線菌和哈茨木霉處理的土壤中細(xì)菌和真菌的比例均大于對照,土壤微生物呈現(xiàn)“細(xì)菌化”。放線菌和哈茨木霉微生物菌處理的細(xì)菌和真菌多樣性較為相似。鐮刀菌屬在4個不同處理中相對豐度最高,易引發(fā)番茄發(fā)生枯萎病,危害嚴(yán)重。放線菌和哈茨木霉對番茄土壤微生物的影響相對較大,葉長、葉寬、莖粗與放線菌的相關(guān)性最高,哈茨木霉與產(chǎn)量的相關(guān)性最高。