宋冰梅,姜 巖,陳 鑫,3,張 宇,程宛楠,潘洪生

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生物資源和基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,烏魯木齊 830046;2.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/國(guó)家植物保護(hù)庫(kù)爾勒觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站,烏魯木齊 830091;3.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/棉花教育部工程研究中心,烏魯木齊 830052;4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

0 引 言

【研究意義】2021年新疆棉花種植面積占全國(guó)的82.8%[1]。轉(zhuǎn)Bt(Bacillusthuringiensis)基因棉花商業(yè)化種植[2],相對(duì)于非轉(zhuǎn)基因棉花其具有抗蟲(chóng)、增產(chǎn)、減少化學(xué)農(nóng)藥使用量等優(yōu)勢(shì)[2-3],且增加單位面積棉花產(chǎn)量[4]。棉纖維長(zhǎng)度是影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素,Bn-csRRM2(RNA recognition motif 2 ofBrassicanapus)過(guò)表達(dá)能夠抑制棉花細(xì)胞周期進(jìn)程,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞大小使其纖維長(zhǎng)度顯著高于親本對(duì)照[5]。2012年中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所將Bn-csRRM2轉(zhuǎn)入我國(guó)主栽棉花中棉所12號(hào)(CCRI-12)中獲得轉(zhuǎn)Bn-csRRM2基因高產(chǎn)棉花HN9311[6],其鈴重、總鈴數(shù)、籽棉產(chǎn)量、皮棉產(chǎn)量均顯著高于中棉所12號(hào)的[7]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】鹽堿脅迫影響著全球約10×108hm2的干旱和半干旱地區(qū),也是影響農(nóng)作物產(chǎn)量的重要因素之一[8],每年造成農(nóng)作物產(chǎn)量的損失達(dá)273×108美元[9]。新疆土地鹽堿化程度較重,鹽漬化土壤面積為2181.4×104hm2,占全國(guó)鹽漬土面積的22.01%,其中鹽堿化的耕地達(dá)122.88×104hm2[10]。棉花植株對(duì)鹽堿脅迫具有一定的抵抗能力,但土壤中鹽堿的積累仍然會(huì)減少其對(duì)水分和養(yǎng)分的吸收[11]。在鹽堿脅迫下棉花的根長(zhǎng)、株高、種子萌發(fā)和果實(shí)發(fā)育等直接指標(biāo)會(huì)顯著下降[12],其生長(zhǎng)發(fā)育受到較大影響[13]。土壤鹽漬化能夠?qū)е旅藁óa(chǎn)量降低50%～60%[14],其程度與棉田出苗率和產(chǎn)量顯著負(fù)相關(guān)[15]。如若0～100 cm土層(根區(qū))脫鹽率為24.93%,棉花成活率便能從1.48%提高到42.04%,產(chǎn)量從72.43 kg/hm2增加到3 075.90 kg/hm2[15]。【本研究切入點(diǎn)】不同棉花品種的耐鹽堿性差異較大且耐鹽堿脅迫能力與生長(zhǎng)發(fā)育階段密切相關(guān)[16-18]。萌發(fā)期和苗期是棉花生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期[19],兩個(gè)時(shí)期的棉花對(duì)鹽堿脅迫最為敏感[20]。Bn-csRRM2基因?qū)儆谕鈦?lái)基因,被轉(zhuǎn)入棉花后會(huì)打破其固有的生長(zhǎng)發(fā)育與新陳代謝模式。因此,在鹽堿脅迫下HN9311與親本對(duì)照相比,其生長(zhǎng)發(fā)育狀態(tài)及耐鹽堿性都有可能發(fā)生改變。目前,關(guān)于轉(zhuǎn)Bn-csRRM2高產(chǎn)棉花HN9311的研究主要集中在其對(duì)棉田微生物[21]、昆蟲(chóng)等生物群落的影響[6,22],關(guān)于鹽堿脅迫對(duì)其萌發(fā)期和苗期的影響尚未見(jiàn)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】研究以轉(zhuǎn)Bn-csRRM2基因高產(chǎn)棉花HN9311和中棉所12號(hào)(親本對(duì)照)為研究對(duì)象,以直接指標(biāo)和相對(duì)指標(biāo)作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),研究鹽脅迫和堿脅迫對(duì)其萌發(fā)期和苗期生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其耐鹽與耐堿性,以期為新型轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)棉花的商業(yè)化種植提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)所用NaCl和NaHCO3均購(gòu)自天津博迪化工有限公司,Hoagland's營(yíng)養(yǎng)液參照付媛媛等[23]配方自行配制;新型轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)棉花HN9311和中棉所12號(hào)均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供。

1.2 方 法

1.2.1 萌發(fā)期耐鹽性和耐堿性評(píng)價(jià)

試驗(yàn)在國(guó)家植物保護(hù)庫(kù)庫(kù)爾勒觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站(新疆巴州庫(kù)爾勒市和什力克鄉(xiāng)庫(kù)勒村,41°45′00″N,85°48′60″E)進(jìn)行,試驗(yàn)方法參照張國(guó)偉等[24]并改進(jìn)。挑選100粒飽滿的棉花種子,用150 mmol/L的NaCl溶液或70 mmol/L的NaHCO3溶液浸泡12 h(分別以去離子水作為對(duì)照),待其吸足水分后放置于鋪有2層定性濾紙的發(fā)芽盒(19 cm × 13 cm × 5 cm)內(nèi),隨后加入20 mL浸泡時(shí)所用溶液,每處理組重復(fù)4次。發(fā)芽盒上覆蓋保鮮膜保濕,1～4 d將其分別放置于溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度50%和無(wú)光照的人工氣候箱內(nèi)催芽,第5 d后開(kāi)始每天以400～600 μmol/(m2·s)光照14 h,每天10:00補(bǔ)充蒸餾水以保持濾紙濕潤(rùn),第3～7 d統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù),并在第7 d每個(gè)重復(fù)選取4個(gè)芽苗測(cè)定其下胚軸長(zhǎng)、根長(zhǎng)和鮮質(zhì)量。

1.2.2 苗期耐鹽性和耐堿性評(píng)價(jià)

試驗(yàn)在溫度(25±1)℃、相對(duì)濕度50%、光照頻率14L∶10D和光強(qiáng)400～600 μmol/(m2·s)的人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。在底部具孔的營(yíng)養(yǎng)缽(高12 cm、直徑10 cm)中放入一定重量蛭石(基質(zhì)含水量35%)并播入3粒飽滿且無(wú)裂口的棉花種子(播種深度一致),出苗后每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽留1株長(zhǎng)勢(shì)一致的棉苗,將其置于30 cm×15 cm的托盤中。每盤放置12株,盤中注入1 L含有NaCl(150 mmol/L)或NaHCO3(70 mmol/L)的Hoagland's營(yíng)養(yǎng)液,分別以不含有NaCl或NaHCO3的Hoagland's營(yíng)養(yǎng)液作為對(duì)照(CK)。試驗(yàn)期間每個(gè)托盤每天10:00補(bǔ)充去離子水,每隔5 d補(bǔ)充1次營(yíng)養(yǎng)液,每個(gè)處理重復(fù)4次。于處理第21 d(大約5葉期)時(shí)每個(gè)重復(fù)選取4株測(cè)定其真葉數(shù)、株高、根長(zhǎng)、根鮮重量和地上部鮮重量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

測(cè)量直接指標(biāo),計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率和活力指數(shù)以評(píng)價(jià)鹽脅迫和堿脅迫對(duì)HN9311萌發(fā)期和苗期生長(zhǎng)發(fā)育的影響;計(jì)算相對(duì)指標(biāo)、相對(duì)鹽/堿害率,評(píng)價(jià)HN9311萌發(fā)期和苗期耐鹽/堿脅迫能力。

鮮重量=地上部鮮重量+根鮮重量;

根冠比=根鮮重量/地上部鮮重量;

發(fā)芽勢(shì)=第3d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%;

發(fā)芽率=7d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%;

發(fā)芽指數(shù)=ΣGt/Dt(式中,Gt為時(shí)間t的發(fā)芽數(shù),Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù));

活力指數(shù)=S×發(fā)芽指數(shù)(式中,S為芽苗的鮮質(zhì)量);

相對(duì)指標(biāo)=實(shí)驗(yàn)組測(cè)定值/對(duì)照組測(cè)定值;

相對(duì)鹽/堿害率=(對(duì)照組發(fā)芽率-實(shí)驗(yàn)組發(fā)芽率)/對(duì)照組發(fā)芽率×100%。

采用Microsoft Excel 2021、SPSS 20和Origin 2022進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、分析和圖表制作。鹽/堿脅迫下HN9311萌發(fā)期和苗期直接指標(biāo)均符合正態(tài)分布(峰度和偏度系數(shù)法)和方差齊性(One-way ANOVA檢驗(yàn)),采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行多重比較;鹽/堿脅迫下HN9311萌發(fā)期和苗期相對(duì)指標(biāo)和相對(duì)鹽/堿害率均符合正態(tài)分布,采用參數(shù)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法檢驗(yàn),僅苗期鹽脅迫下相對(duì)株高不符合正態(tài)分布通過(guò)非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽/堿脅迫對(duì)HN9311萌發(fā)期和苗期直接指標(biāo)的影響

研究表明,對(duì)照組(0 mmol/L NaCl與0 mmol/LNaHCO3)之間HN9311直接指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。鹽脅迫和堿脅迫下HN9311鮮重量(F=55.49,df=3,15,P<0.001)、下胚軸長(zhǎng)(F=5.80,df=3,15,P=0.011)、根長(zhǎng)(F=951.82,df=3,15,P<0.001)、發(fā)芽勢(shì)(F=1216.05,df=3,15,P<0.001)、發(fā)芽率(F=662.00,df=3,15,P<0.001)、發(fā)芽指數(shù)(F=3807.30,df=3,15,P<0.001)和活力指數(shù)(F=305.67,df=3,15,P<0.001)均顯著下降。鹽脅迫下HN9311發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)的下降程度均顯著高于堿脅迫,堿脅迫下根長(zhǎng)的下降程度顯著高于鹽脅迫。表1

表1 鹽/堿脅迫下新型轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)棉花HN9311萌發(fā)期直接指標(biāo)變化

對(duì)照組(0 mmol/L NaCl與0 mmol/L NaHCO3)之間HN9311直接指標(biāo)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。鹽脅迫和堿脅迫下HN9311根冠比顯著增強(qiáng)(F=110.40,df=3,15,P<0.001),株高(F=70.06,df=3,15,P<0.001)、根長(zhǎng)(F=125.58,df=3,15,P<0.001)、根鮮重(F=126.04,df=3,15,P<0.001)、地上部鮮重(F=524.84,df=3,15,P<0.001)和鮮重量(F=456.49,df=3,15,P<0.001)均顯著下降,真葉數(shù)(F=12.02,df=3,15,P=0.001)僅在堿脅迫下顯著下降。除根冠比以外,堿脅迫下所有直接指標(biāo)下降程度均顯著高于鹽脅迫。鹽/堿脅迫對(duì)HN9311萌發(fā)期和苗期的生長(zhǎng)具有顯著的抑制作用,苗期對(duì)堿脅迫比鹽脅迫更為敏感。表2

表2 鹽/堿脅迫下新型轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)棉花HN9311苗期直接指標(biāo)變化

2.2 鹽/堿脅迫對(duì)HN9311萌發(fā)期和苗期相對(duì)指標(biāo)的影響

研究表明,鹽脅迫下HN9311萌發(fā)期相對(duì)鮮重量(T=3.45,df=6,P=0.014)、相對(duì)發(fā)芽勢(shì)(T=12.88,df=6,P<0.001)、相對(duì)發(fā)芽率(T=4.12,df=6,P=0.006)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(T=11.00,df=6,P<0.001)和相對(duì)活力指數(shù)(T=8.05,df=6,P=0.001)均顯著低于中棉所12號(hào);堿脅迫下HN9311相對(duì)下胚軸長(zhǎng)(T=5.63,df=6,P=0.004)、相對(duì)發(fā)芽指數(shù)(T=3.46,df=6,P=0.013)均顯著高于中棉所12號(hào),相對(duì)鮮重量(T=9.82,df=6,P<0.001)顯著低于中棉所12號(hào)。鹽脅迫下HN9311苗期相對(duì)根鮮重(T=7.73,df=6,P<0.001)、相對(duì)地上部鮮重(T=3.55,df=6,P=0.012)和相對(duì)鮮重量(T=5.14,df=6,P=0.002)顯著低于中棉所12號(hào);堿脅迫下HN9311相對(duì)根冠比(T=12.80,df=6,P<0.001)顯著高于中棉所12號(hào),相對(duì)株高(T=3.60,df=6,P=0.023)、相對(duì)根鮮重(T=13.82,df=6,P=0.004)、相對(duì)地上部鮮重(T=16.75,df=6,P<0.001)和相對(duì)鮮重量(T=16.47,df=6,P<0.001)均顯著低于中棉所12號(hào)。HN9311萌發(fā)期耐鹽脅迫能力和苗期耐鹽/堿脅迫能力均低于中棉所12號(hào)。表3,表4

表3 鹽/堿脅迫下新型轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)棉花HN9311萌發(fā)期相對(duì)指標(biāo)變化

表4 鹽/堿脅迫下新型轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)棉花HN9311苗期相對(duì)指標(biāo)變化

2.3 鹽/堿脅迫對(duì)HN9311相對(duì)鹽/堿害率影響

研究表明,HN9311相對(duì)鹽/堿害率分別為27.0%、21.0%,中棉所12號(hào)分別為22.75%、23.00%,其中HN9311相對(duì)鹽害率顯著高于中棉所12號(hào)的(T=3.47,df=6,P=0.013),其相對(duì)堿害率與中棉所12號(hào)的無(wú)顯著性差異(P>0.05),HN9311萌發(fā)期耐鹽脅迫能力低于中棉所12號(hào)的。圖1

注:*、ns分別代表HN9311與中棉所12號(hào)相對(duì)鹽害率具有(P<0.05)或不具有(P>0.05)顯著性差異(獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)法檢驗(yàn))

3 討 論

3.1通過(guò)直接和間接鑒定法[19]研究了鹽/堿脅迫對(duì)HN9311萌發(fā)期和苗期生長(zhǎng)發(fā)育的影響并對(duì)其耐鹽/堿脅迫能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)。研究表明,與中棉所12號(hào)相比,除真葉數(shù)和根冠比以外,HN9311萌發(fā)期和苗期各項(xiàng)直接指標(biāo)均顯著下降,苗期對(duì)堿脅迫比鹽脅迫更為敏感,并且HN9311萌發(fā)期耐鹽脅迫能力和苗期耐鹽/堿脅迫能力均低于中棉所12號(hào)的。

3.2植物的鹽堿應(yīng)激反應(yīng)是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程,涉及到轉(zhuǎn)錄和代謝等方面[25-26]。因此通常利用植物生長(zhǎng)過(guò)程中的生理指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)鹽堿脅迫下植物生長(zhǎng)發(fā)育的復(fù)雜情況以及其耐鹽堿脅迫能力[3,27-28],其中鮮重量、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、根長(zhǎng)、下胚軸長(zhǎng)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)是評(píng)價(jià)萌發(fā)期棉花生長(zhǎng)狀態(tài)的重要直接指標(biāo),其數(shù)值大小與萌發(fā)期棉花生長(zhǎng)發(fā)育情況以及耐鹽堿脅迫能力正相關(guān)[29-31]。研究發(fā)現(xiàn),在鹽/堿脅迫下HN9311萌發(fā)期所有直接指標(biāo)均顯著下降,其種子質(zhì)量被顯著抑制且萌發(fā)期的生長(zhǎng)發(fā)育受到較大影響。

3.3真葉數(shù)、株高、根長(zhǎng)、根鮮重、地上部鮮重、鮮重量和根冠比指標(biāo)的結(jié)合,從根質(zhì)量到地上部質(zhì)量全面的反映了棉花苗期生長(zhǎng)發(fā)育情況,其數(shù)值的變化被廣泛用于評(píng)價(jià)鹽堿脅迫對(duì)棉花苗期生長(zhǎng)發(fā)育的影響程度[32-33]。其中根是植物與鹽漬化土壤第一個(gè)直接接觸的器官,直接受到鹽堿脅迫的危害,其生長(zhǎng)、形態(tài)都受到影響[34]。植物面對(duì)鹽堿脅迫形成了一定的適應(yīng)機(jī)制,如通過(guò)減少地上部的生物量、減少水分和營(yíng)養(yǎng)消耗等。因此植物地上部比地下部對(duì)鹽堿脅迫更為敏感[35],在一定鹽堿濃度范圍內(nèi)根冠比的大小與受鹽堿脅迫程度以及植物耐鹽堿脅迫能力負(fù)相關(guān)[16,36]。在研究鹽堿脅迫濃度下,根冠比顯著高于對(duì)照組,HN9311通過(guò)增大根冠比來(lái)保證逆境情況下水分與營(yíng)養(yǎng)的需求;除真葉數(shù)和根冠比以外,其余直接指標(biāo)在鹽脅迫和堿脅迫情況下均顯著低于對(duì)照組,鹽/堿脅迫對(duì)HN9311苗期的生長(zhǎng)發(fā)育也有顯著的影響。NaHCO3較NaCl能夠提供額外的pH脅迫[37-39],在含Na+離子濃度相同情況下,堿性土壤對(duì)植物的脅迫程度大于鹽性土壤。通過(guò)比較鹽/堿脅迫下各項(xiàng)直接指標(biāo)下降程度,得到苗期堿脅迫對(duì)棉花生長(zhǎng)的抑制程度大于鹽脅迫的結(jié)論,與蘇孟杞[40]研究一致。

3.4相對(duì)指標(biāo)可以消除棉花品種導(dǎo)致的種間直接指標(biāo)的差異,其數(shù)值大小可以評(píng)價(jià)不同品種棉花之間耐鹽堿脅迫能力差異[19,41]。研究發(fā)現(xiàn),在同樣的鹽脅迫和堿脅迫條件下,除萌發(fā)期堿脅迫下相對(duì)下胚軸長(zhǎng)和相對(duì)發(fā)芽指數(shù),以及苗期堿脅迫下相對(duì)根冠比以外,HN9311萌發(fā)期和苗期所有相對(duì)指標(biāo)均顯著小于或等于中棉所12號(hào),并且相對(duì)根冠比同樣與耐鹽堿脅迫能力負(fù)相關(guān),外來(lái)Bn-RRM2基因影響了棉花耐鹽/堿性,使其萌發(fā)期耐鹽脅迫能力和苗期耐鹽/堿脅迫能力均低于親本對(duì)照的。目前,分子層面上鹽堿脅迫對(duì)棉花生長(zhǎng)發(fā)育的影響尚未被全面闡述[18],Bn-RRM2基因?qū)γ藁望}堿脅迫能力的影響也有待于探索。相對(duì)鹽/堿害率可評(píng)價(jià)鹽/堿脅迫下植株被危害的等級(jí)[42],其數(shù)值越大棉花生長(zhǎng)發(fā)育被抑制程度越大[20,43]。HN9311萌發(fā)期相對(duì)鹽/堿害率分別為27.00%、21.00%,中棉所12號(hào)分別為22.75%、23.00%,在試驗(yàn)鹽/堿濃度下兩者受鹽/堿脅迫程度不大。由于HN9311相對(duì)鹽害率數(shù)值顯著大于中棉所12號(hào),HN9311萌發(fā)期耐鹽脅迫能力顯著小于中棉所12號(hào)。

3.5在適宜鹽堿濃度下植物會(huì)加快萌發(fā),當(dāng)濃度超過(guò)閾值時(shí)鹽堿會(huì)抑制其生長(zhǎng)[44]。棉花耐鹽閾值為77 mmol/L NaCl,采用150 mmol/L NaCl來(lái)鑒定棉花耐鹽性[44-46],研究鹽脅迫條件設(shè)定為150 mmol/L NaCl。鹽漬土形成的原因是多種因素共同作用的結(jié)果[47],其形成因素不穩(wěn)定導(dǎo)致新疆各地區(qū)土壤中的鹽堿離子濃度差異較大[48],并且NaCl和NaHCO3是新疆鹽漬土壤中兩種并存的典型化合物[49]。單一濃度和單獨(dú)的鹽/堿脅迫設(shè)定不能全面反映土壤中的鹽堿對(duì)HN9311生長(zhǎng)發(fā)育的影響,以后可設(shè)計(jì)多個(gè)濃度梯度并且增加NaCl+NaHCO3復(fù)合試驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步完善研究結(jié)果。研究為室內(nèi)試驗(yàn)相較于田間試驗(yàn)環(huán)境較為穩(wěn)定,在田間試驗(yàn)過(guò)程中HN9311的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到多個(gè)因素如雨水、溫度等的影響,中棉所12號(hào)為鹽敏感品種[50-51],HN9311同樣為鹽敏感品種。鹽/堿脅迫對(duì)HN9311產(chǎn)量的影響可能較大,有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

與中棉所12號(hào)相比,除真葉數(shù)和根冠比以外,HN9311萌發(fā)期和苗期各項(xiàng)直接指標(biāo)均顯著下降,鹽/堿脅迫對(duì)HN9311生長(zhǎng)發(fā)育均具有顯著的抑制作用并且其苗期對(duì)堿脅迫比鹽脅迫更為敏感。HN9311萌發(fā)期相對(duì)鹽/堿害率分別為27.00%、21.00%,中棉所12號(hào)分別為22.75%、23.00%,其萌發(fā)期耐鹽脅迫能力和苗期耐鹽/堿脅迫能力均低于中棉所12號(hào)。