韋秀蘭,蘇 寧,劉 濤,聶小軍,童 維

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院,陜西楊凌 712100)

植物在生長(zhǎng)過(guò)程中經(jīng)常遭遇干旱、寒冷、高溫、鹽害等非生物脅迫,對(duì)作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量造成威脅,導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失[1]。蛋白激酶在響應(yīng)非生物脅迫過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,其中蛋白激酶的可逆磷酸化是高等植物滲透脅迫誘導(dǎo)的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一。

SnRK(sucrose non-fermenting 1-related protein kinase)是一種在植物中廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,根據(jù)序列相似性和保守結(jié)構(gòu)域,可分為SnRK1、SnRK2和SnRK3三個(gè)亞家族[2]。SnRK2和SnRK3基因家族是植物特有的[3],其中SnRK2基因家族成員在植物響應(yīng)滲透脅迫和脫落酸(ABA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[4-5]。SnRK2蛋白包含三個(gè)保守功能域,分別為三磷酸腺苷(ATP)結(jié)合域、絲氨酸/蘇氨酸激酶域和一個(gè)多樣化的調(diào)節(jié)C端轉(zhuǎn)錄激活域。目前, SnRK2基因已被在擬南芥[2]、水稻[6]、玉米[7]等植物中進(jìn)行了全基因組鑒定。

干旱、鹽、高溫等非生物脅迫是影響小麥生長(zhǎng)和產(chǎn)量的主要限制因素。目前,已有研究對(duì)小麥部分SnRK2基因家族成員進(jìn)行了功能分析。例如,TaSnRK2.7[8]和TaSnRK2.8[9]參與小麥對(duì)干旱、鹽堿和低溫脅迫的響應(yīng)過(guò)程。此外,TaSnRK2.3、TaSnRK2.4和TaSnRK2.8基因均受ABA誘導(dǎo)表達(dá),而TaSnRK2.7對(duì)ABA誘導(dǎo)無(wú)響應(yīng),表明TaSnRK2.7可能參與ABA非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。因此,研究小麥抗逆性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因有利于提高小麥抗逆性,降低逆境脅迫對(duì)小麥生長(zhǎng)發(fā)育的影響,最終提高小麥產(chǎn)量。

最新完成的普通小麥及其祖先供體參考基因組序列信息[10]可用于在全基因組范圍內(nèi)鑒定小麥SnRK2基因家族成員。本研究利用生物信息學(xué)方法,在全基因組水平上對(duì)普通小麥及其兩個(gè)祖先供體野生二粒小麥(Triticumdicoccoides)和節(jié)節(jié)麥(Aegilopstauschii)中的SnRK2基因家族成員進(jìn)行鑒定,對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育、核苷酸多樣性以及逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析,并通過(guò)同源模型預(yù)測(cè)小麥SnRK2蛋白的三維結(jié)構(gòu),以期為小麥SnRK2基因的功能研究提供信息。

1 材料與方法

1.1 普通小麥及其兩個(gè)祖先供體SnRK2基因的全基因組鑒定

從Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(kù)(http://plants.ensembl.org/index.html)下載已報(bào)道的水稻和擬南芥的SnRK2蛋白序列,將其作為query序列,在普通小麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTP比對(duì),設(shè)置參數(shù)為1e-5。同時(shí)從Pfam數(shù)據(jù)庫(kù)(http://pfam.sanger.ac.uk/)下載SnRK2蛋白激酶典型結(jié)構(gòu)域的hmm文件PF00069和PF07714,通過(guò)HMMER 3.0軟件搜索小麥全基因組數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置參數(shù)為1e-5。然后用perl腳本對(duì)兩種方法得到的候選蛋白進(jìn)行整合和去冗余,最終將候選基因提交到NCBI-CDD網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/),驗(yàn)證SnRK2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。用同樣的方法鑒定節(jié)節(jié)麥和野生二粒小麥的SnRK2基因。

1.2 普通小麥及其兩個(gè)祖先供體SnRK2基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

用ClustalW軟件對(duì)普通小麥及其兩個(gè)祖先供體的蛋白序列進(jìn)行多重對(duì)比,用鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),bootstrap值設(shè)為1 000。用itol進(jìn)行可視化?；谄胀ㄐ←溂捌浣壩锓N的基因組注釋信息,獲得SnRK2基因的內(nèi)含子/外顯子結(jié)構(gòu)和染色體位置信息。用在線軟件GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制SnRK2基因結(jié)構(gòu)圖,用在線軟件MEME(https://meme-suite.org/meme/)預(yù)測(cè)每個(gè)SnRK2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域,設(shè)置motif數(shù)量為10,其余參數(shù)為默認(rèn)值。

1.3 普通小麥SnRK2基因的表達(dá)模式分析

從wheatURGI(https://urgi.versailles.inra.fr/files/RNASeqWheat/)和NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)下載普通小麥5個(gè)組織(根、莖、葉、穗和粒)以及鹽、干旱、低溫和熱脅迫下的RNA-seq數(shù)據(jù)。然后通過(guò)Hisat 2和Stringtie軟件計(jì)算每個(gè)SnRK2基因的FPKM值,鑒定出差異表達(dá)基因。然后基于R語(yǔ)言pheatmap包繪制普通小麥SnRK2基因在不同組織和不同脅迫下的表達(dá)譜熱圖。

隨機(jī)選擇6個(gè)小麥SnRK2基因,驗(yàn)證小麥SnRK2基因在受到干旱和鹽脅迫下的表達(dá)模式,首先將中國(guó)春小麥種子在溫室中(23±1 ℃,16 h光照/8 h黑暗)進(jìn)行萌發(fā)培養(yǎng)。待小麥生長(zhǎng)至三葉期時(shí),將幼苗材料分成兩份,一份材料進(jìn)行干旱處理,即在80 g·L-1的聚乙二醇(PEG6000)溶液中分別培養(yǎng)1、6和12 h;另一份材料進(jìn)行鹽脅迫處理,即在150 mmol·L-1的NaCl溶液中分別培養(yǎng)6、12、24和48 h,將正常條件下生長(zhǎng)的幼苗作為對(duì)照。所有樣品的葉片均來(lái)自3次獨(dú)立重復(fù)試驗(yàn),以肌動(dòng)蛋白基因(Actin)作為內(nèi)參。用Plant RNA Kit試劑盒(Omega,美國(guó))提取這些樣品的RNA。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Reverse Transcriptase M-MLV(RNaseH-)(TaRaKa,日本)合成cDNA第一鏈。參照SYBR Premix Ex TaqII(TaKaRa,日本)說(shuō)明書(shū)的反應(yīng)體系,在Quant Studiotm 7 Flex系統(tǒng)(Thermo,美國(guó))進(jìn)行qRT-PCR。PCR反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性3 s,60 ℃退火30 s,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。用2-ΔΔCT法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 普通小麥及其近緣物種SnRK2基因的單倍型和核苷酸多樣性分析

從NCBI上下載93份六倍體、二倍體和四倍體小麥的全基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)(PRJNA476679)獲取SNP信息。用Samtools軟件包中的bcftools,根據(jù)位置信息提取小麥SnRK2基因內(nèi)含子和外顯子區(qū)域的SNP位點(diǎn)。用vcftools計(jì)算核苷酸多樣性(Pi)和分化指數(shù)(Fst),以探究SnRK2基因在普通小麥形成過(guò)程中受到的選擇壓力。根據(jù)重測(cè)序數(shù)據(jù)獲得的SNP信息,利用perl腳本對(duì)每個(gè)SnRK2基因的單倍型進(jìn)行計(jì)數(shù),分析野生二粒小麥、硬粒小麥、農(nóng)家種和栽培品種的單倍型。同時(shí),對(duì)重測(cè)序材料的農(nóng)藝性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,探討基因型變異與植株性狀之間的關(guān)系。

1.5 小麥SnRK2蛋白三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將候選蛋白序列提交到PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/),搜索并下載最優(yōu)的小麥SnRK2同源模板蛋白。利用PSI-BLAST比對(duì)小麥SnRK2和模板蛋白的序列,然后用Swiss-Model軟件(https://swissmodel.expasy.org/interactive/)預(yù)測(cè)SnRK2蛋白的三維結(jié)構(gòu),用Pymol軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥SnRK2基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

通過(guò)BLASTP和HMMER從普通小麥、節(jié)節(jié)麥和野生二粒小麥基因組中分別鑒定到30、10和19個(gè)SnRK2候選基因,將這些候選基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。結(jié)果(圖1)顯示,這些基因被分為3個(gè)亞家族?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示,這些基因的序列長(zhǎng)度范圍為1 901～6 652 bp,其中Ta-5A-SnRK2.26序列最長(zhǎng),為6 652 bp。此外,大部分普通小麥SnRK2基因的序列長(zhǎng)度和外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)與其祖先供體節(jié)節(jié)麥、野生二粒小麥的同源基因相似,但UTR區(qū)域和外顯子長(zhǎng)度存在差異。相同亞家族成員之間的基因結(jié)構(gòu)較為相似,而不同亞家族成員之間存在一定差異。在亞家族I中,Ta-2A-SnRK2.10和Ta-2B-SnRK2.14基因含有2個(gè)內(nèi)含子,Ta-2D-SnRK2.18基因含有3個(gè)內(nèi)含子外,其余小麥SnRK2基因以及大部分節(jié)節(jié)麥和野生二粒小麥SnRK2基因均含有8個(gè)內(nèi)含子;在亞家族II中,所有小麥SnRK2基因及其祖先物種均含有8個(gè)內(nèi)含子;在亞家族III中,Ta-4A-SnRK2.22、Ta-4B-SnRK2.23和Ta-4D-SnRK2.24含有7個(gè)內(nèi)含子,其他小麥SnRK2基因及大部分節(jié)節(jié)麥和野生二粒小麥SnRK2基因均含有8個(gè)內(nèi)含子。

圖1 小麥及其兩個(gè)祖先供體SnRK2基因的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系(A)、保守基序(B)和基因結(jié)構(gòu)(C)分析Fig.1 Phylogenetic relationship(A), conserved motifs(B) and gene structure(C) of SnRK2 genes in wheat and its two progenitors

利用MEME在線工具對(duì)這些SnRK2蛋白的保守結(jié)構(gòu)域組成和數(shù)量進(jìn)行預(yù)測(cè),共鑒定到10個(gè)保守的基序,且不同蛋白中這些基序的排列順序基本一致(圖1)。通過(guò)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),所有SnRK2蛋白都含有motif 8和motif 3。Motif 2和motif 4分別是ATP結(jié)合域和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,在大部分成員中均存在。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),亞家族I所有成員都含有10個(gè)motif;但亞家族II的成員除均含有motif 1～8外,均缺少motif 9或motif 10;亞家族III所有成員均缺少motif 9。表明同一亞家族成員間具有相似的基序組成,而不同亞家族成員間具有各自特定的基序,推測(cè)不同亞家族間可能已經(jīng)發(fā)生了功能分化。

2.2 小麥SnRK2基因的表達(dá)模式

利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析SnRK2基因在小麥不同組織中的表達(dá)模式,結(jié)果(圖2)顯示,小麥SnRK2的表達(dá)具有顯著的組織特異性。其中,Ta-1A-SnRK2.1、Ta-1B-SnRK2.3、Ta-1D-SnRK2.5和Ta-5D-SnRK2.29基因在根中高表達(dá),而其他基因在根中不表達(dá)或表達(dá)量較低,表明這4個(gè)基因在根系形態(tài)學(xué)建成中具有重要功能。Ta-2D-SnRK2.17和Ta-4D-SnRK2.24基因在籽粒中高表達(dá),而在其他組織中表達(dá)量較低,推測(cè)這兩個(gè)基因可能在小麥種子發(fā)育過(guò)程中起重要作用。此外,Ta-2D-SnRK2.15在葉、根和莖中高表達(dá),Ta-3D-SnRK2.21在莖和穗中高表達(dá),表明這兩個(gè)基因可能在莖發(fā)育中均發(fā)揮重要作用。

根據(jù)自卸車的實(shí)際工作運(yùn)行情況，在環(huán)境溫度16℃，油液溫度23℃環(huán)境條件下進(jìn)行了油液溫升試驗(yàn)。第一階段自卸車持續(xù)運(yùn)行約2.5h。第二階段自卸車停止運(yùn)行，液壓系統(tǒng)自然冷卻1.5h。第三階段自卸車?yán)^續(xù)運(yùn)行約2h。

Grain:籽粒; Leaves:葉片; Spike:穗; Root:根; Stem:莖.圖2 SnRK2基因在小麥不同組織中的表達(dá)譜Fig.2 Expression profiles of SnRK2 gene in different tissues of wheat

進(jìn)一步利用RNA-seq數(shù)據(jù)分析小麥SnRK2基因在不同逆境脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果(圖3)表明,干旱脅迫處理下,Ta-2D-SnRK2.15基因在處理1 h后表達(dá)量較高,在處理6 h后表達(dá)量有所降低;Ta-1A-SnRK2.1、Ta-1B-SnRK2.3、Ta-1D-SnRK2.5和Ta-2D-SnRK2.17基因在處理1 h后表達(dá)水平較低,但在處理6 h后表達(dá)量明顯提高。鹽脅迫處理下,大部分SnRK2基因的表達(dá)量在處理6 h后上調(diào)表達(dá),但隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),這些基因的表達(dá)量并沒(méi)有明顯提高,甚至部分基因(如Ta-1A-SnRK2.1、Ta-3A-SnRK2.19和Ta-3B-SnRK2.20)在處理24 h后有所下降。低溫脅迫(4 ℃)處理下,Ta-2A-SnRK2.9和Ta-2D-SnRK2.17基因上調(diào)表達(dá);而Ta-2D-SnRK2.16和Ta-5D-SnRK2.29基因下調(diào)表達(dá)。熱脅迫處理下,大部分SnRK2基因的表達(dá)量隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸提高,其中Ta-5B-SnRK2.27和Ta-5D-SnRK2.29在處理6 h后明顯上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明,小麥SnRK2基因家族在響應(yīng)不同非生物脅迫過(guò)程中均發(fā)揮重要作用,但不同成員發(fā)揮的功能不同。

CK:對(duì)照; Drought 1h: 干旱處理1 h; Drought 6h: 干旱處理6 h; Salt 6h: 鹽處理6h; Salt 12h: 鹽處理12 h; Salt 24h: 鹽處理24 h; Salt 48h: 鹽處理48 h; 23℃: 23 ℃正常處理; 4℃: 4 ℃低溫處理; Heat 1h: 熱處理1 h; Heat 6h: 熱處理6 h.圖3 小麥SnRK2基因在不同脅迫下的表達(dá)譜Fig.3 Expression profiles of wheat SnRK2 genes under different stresses

選擇來(lái)自兩個(gè)部分同源染色體的6個(gè)小麥SnRK2基因,利用qRT-PCR驗(yàn)證其在干旱和鹽脅迫下的表達(dá)模式。結(jié)果(表1)表明,6個(gè)小麥SnRK2基因在干旱和鹽脅迫下存在明顯的表達(dá)差異,整體表達(dá)趨勢(shì)與RNA-seq結(jié)果一致,但是位于相同部分同源染色體的基因間表達(dá)水平存在明顯差異。位于第一部分同源染色體的3個(gè)基因中,Ta-1D-SnRK2.5基因的表達(dá)量在干旱和鹽脅迫各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于Ta-1A-SnRK2.1和Ta-1B-SnRK2.3。與對(duì)照處理相比,除干旱脅迫12 h后Ta-1A-SnRK2.1基因的表達(dá)量有所提高以及Ta-1D-SnRK2.5基因的表達(dá)量無(wú)明顯變化外,3個(gè)基因的表達(dá)量在干旱脅迫各時(shí)間點(diǎn)均有所降低;3個(gè)基因的表達(dá)量在鹽脅迫6 h后均有一定程度的增加,且明顯高于對(duì)照處理,之后隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)有不同程度的降低。位于第二部分同源染色體的3個(gè)基因中,Ta-2A-SnRK2.10基因的表達(dá)量在干旱和鹽脅迫各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著高于Ta-2B-SnRK2.14和Ta-2D-SnRK2.18;與對(duì)照處理相比,3個(gè)基因的表達(dá)量在干旱脅迫各時(shí)間點(diǎn)均有所下降;Ta-2A-SnRK2.10和Ta-2B-SnRK2.18基因的表達(dá)量在鹽脅迫6 h后明顯高于對(duì)照處理,隨著脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng),3個(gè)基因的表達(dá)均受到不同程度的抑制。表明這些基因在調(diào)控脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。

表1 干旱脅迫和鹽脅迫下小麥SnRK2基因的表達(dá)量Table 2 Expression levels of wheat SnRK2 genes under drought and salt stresses

2.3 小麥SnRK2基因的核苷酸多樣性

在小麥馴化過(guò)程中,純化選擇的預(yù)期結(jié)果之一是附近基因位點(diǎn)遺傳多樣性的下降。因此,在從野生二粒小麥到硬粒小麥的進(jìn)化過(guò)程中,A和B亞基因組中絕大多數(shù)SnRK2基因的Pi值都呈現(xiàn)下降趨勢(shì),尤其Ta-5B-SnRK2.28基因的Pi值下降最為明顯(圖4),基因的核苷酸多樣性與進(jìn)化時(shí)的選擇壓力有關(guān),說(shuō)明該基因在進(jìn)化時(shí)經(jīng)歷了強(qiáng)烈的選擇壓力;同時(shí),從農(nóng)家種到栽培品種的改良過(guò)程中也出現(xiàn)了類似的下降趨勢(shì),但下降幅度比前者小。為探究小麥及其祖先物種在進(jìn)化過(guò)程中的分化程度,利用重測(cè)序數(shù)據(jù)對(duì)不同群體間的Fst進(jìn)行分析(圖5)。從A和B亞基因組來(lái)看,野生二粒小麥和硬粒小麥之間SnRK2基因的Fst普遍高于硬粒小麥和農(nóng)家種以及農(nóng)家種和栽培品種之間SnRK2基因的Fst,其中農(nóng)家種和栽培品種之間的Fst最低。值得注意的是,Ta-5B-SnRK2.28基因在從野生二粒小麥到硬粒小麥的進(jìn)化過(guò)程中Fst較高(圖5),表明該基因與鄰近區(qū)域遺傳位點(diǎn)在馴化過(guò)程中存在明顯分化。

B亞基因組上所有小麥SnRK2基因的位置用藍(lán)點(diǎn)標(biāo)出,Ta-5B-SnRK2.28位于第5B染色體上。圖5同。All the wheat SnRK2 genes on B subgenome were highlighted using blue dots. Ta-5B-SnRK2.28 was located on chromosome 5B. The same in table 5.圖4 小麥SnRK2基因在B亞基因組上的核苷酸多樣性指數(shù)(Pi)Fig.4 Nucleotide diversity index(Pi)of wheat SnRK2 genes on B subgenome

圖5 小麥SnRK2基因在B亞基因組的群體分化指數(shù)(Fst)Fig.5 Population divergence(Fst) of wheat SnRK2 genes on B subgenome

2.4 小麥SnRK2基因的單倍型

基于Ta-5B-SnRK2.28進(jìn)行單倍型分析,發(fā)現(xiàn)在野生二粒小麥中有GG、AG和AA三種單倍型,而在硬粒小麥中只有AA一個(gè)單倍型(圖6)。在六倍體農(nóng)家種也存在GG、AG和AA三種單倍型,而六倍體栽培品種中只有AA一種單倍型。說(shuō)明從野生二粒小麥到硬粒小麥的馴化以及六倍體農(nóng)家種到六倍體栽培品種的改良過(guò)程中,GG、AG單倍型的消失以及AA單倍型的迅速擴(kuò)大可能是人工選擇的結(jié)果。根據(jù)單倍型對(duì)材料進(jìn)行分類后,重測(cè)序材料的表型差異證實(shí)了該觀點(diǎn)。具有AA單倍體的六倍體小麥種子長(zhǎng)度更短,種子更寬,千粒重更高,滿足小麥籽粒改良的預(yù)期要求。

圖6 Ta-5B-SnRK2.28基因的單倍型分析Fig.6 Haplotype analysis of Ta-5B-SnRK2.28 gene

2.5 小麥SnRK2蛋白的三維結(jié)構(gòu)

選取位于三個(gè)部分同源染色體的9個(gè)小麥SnRK2蛋白,采用同源建模方法預(yù)測(cè)其三維結(jié)構(gòu)(圖7)。結(jié)果表明,9個(gè)小麥SnRK2蛋白的RMSD值(根均方偏差)均小于1.5?(表2),說(shuō)明這些蛋白具有相似的三維結(jié)構(gòu)。特別是Ta-5A-SnRK2.26、Ta-5B-SnRK2.27、Ta-5D-SnRK2.30蛋白間具有完全相同的三維結(jié)構(gòu)模型,RMSD值均為0,可見(jiàn)這3個(gè)基因在進(jìn)化過(guò)程中結(jié)構(gòu)高度保守。

表2 小麥SnRK2蛋白間三維結(jié)構(gòu)的均方根偏差 (RMSD)Table 1 Root-mean-square deviation(RMSD) of the predicted three-dimensional structure between different wheat SnRK2 proteins

圖7 小麥SnRK2蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.7 Three-dimensional structure of wheat SnRK2 proteins

3 討論

基因的差異表達(dá)在一定程度上反映該基因的功能。Sun等[12]研究表明,小麥SnRK2基因在根、葉、花、籽粒等組織中的表達(dá)具有特異性。本研究發(fā)現(xiàn),Ta-2D-SnRK2.17和Ta-4D-SnRK2.24基因在籽粒中表達(dá)量較高,而在其他組織中表達(dá)量較低或不表達(dá),推測(cè)這兩個(gè)基因在小麥種子發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Ta-1A-SnRK2.1、Ta-1B-SnRK2.3、Ta-1D-SnRK2.5和Ta-5D-SnRK2.29基因在根中表達(dá)量最高,推測(cè)這四個(gè)基因在根系形態(tài)學(xué)建成中具有重要功能。此外,SnRK2還參與干旱、鹽、ABA等多種非生物脅迫響應(yīng)過(guò)程[14-16]。本研究發(fā)現(xiàn),在干旱脅迫6 h后,大部分小麥SnRK2基因有不同程度的響應(yīng),這與Fatima等[17]的報(bào)道一致。其中,Ta-2B-SnRK2.13和Ta-1A-SnRK2.2在干旱處理6 h后表達(dá)量較高,而在其他脅迫處理中表達(dá)量較低或不表達(dá),表明這兩個(gè)基因在響應(yīng)干旱脅迫過(guò)程中具有重要的調(diào)控作用。qRT-PCR分析結(jié)果顯示,小麥SnRK2基因A、B和D亞基因組三個(gè)同源拷貝的表達(dá)水平存在顯著差異。推測(cè)小麥SnRK2基因家族同源基因在異源多倍體化過(guò)程中發(fā)生了功能分化,導(dǎo)致同源基因?qū)Σ煌{迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。

本研究結(jié)合小麥重測(cè)序數(shù)據(jù),從群體遺傳學(xué)的角度分析了SnRK2基因在不同材料中的基因型差異,推測(cè)小麥馴化過(guò)程中的人工選擇是導(dǎo)致SnRK2基因位點(diǎn)遺傳多樣性下降的原因之一。同時(shí),大部分SnRK2的Pi值從野生二粒小麥到硬粒小麥的馴化過(guò)程中明顯降低,從六倍體農(nóng)家種到六倍體栽培品種的改良過(guò)程中也略有降低,這一結(jié)果也表明,馴化對(duì)遺傳多樣性的影響大于改良。此外,野生二粒小麥和硬粒小麥之間SnRK2基因的Fst普遍高于硬粒小麥和六倍體農(nóng)家種以及六倍體農(nóng)家種和六倍體栽培品種之間SnRK2基因的Fst,說(shuō)明從野生四倍體小麥到栽培四倍體小麥的分化程度更高。Ta-5B-SnRK2.28的單倍型表型分析進(jìn)一步證明了本研究觀點(diǎn)。本研究為分析六倍體小麥的基因功能提供了參考信息,并為小麥育種提供了重要的基因資源。