宋 曉,黃紹敏,張珂珂,王沙沙,李向東,楊 程,楊天軍

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物營養(yǎng)與資源環(huán)境研究所,河南鄭州 450002;2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/河南省小麥生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南鄭州 450002;3.安陽市土壤肥料工作站,河南安陽 455000)

酵母雙雜交系統(tǒng)(yeast two hybrid system,Y2H)是研究植物體內(nèi)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的一種常用的分子生物學(xué)技術(shù)[1]。隨著分子技術(shù)以及現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展,該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于植物[2-3]、動(dòng)物[4]、微生物[4-5]等物種當(dāng)中。例如,Chini等[2]利用Y2H檢測(cè)技術(shù)識(shí)別了以高通量的方式直接調(diào)節(jié)植物激素感知復(fù)合物的小分子。Liu等[3]利用抑制活性試驗(yàn)和改良的酵母雙雜交研究木聚糖酶抑制劑(RIXI)對(duì)水稻致病機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn), RIXI對(duì)11個(gè)家族木聚糖酶的抑制活性隨RIXI-木聚糖酶復(fù)合物的相互作用強(qiáng)度而提高,表明兩者呈正相關(guān)。Lai 等[5]利用酵母雙雜交技術(shù)成功研究了弓形蟲的侵入機(jī)制。另外,該技術(shù)在人類疾病[6-7]和藥物研究[8]應(yīng)用方面也取得了較大的進(jìn)步,尤其是在研究人類帕金森病的發(fā)病機(jī)制方面[8]。

普通小麥(Triticumaestivum, 2n=6X=42,AABBDD)為異源六倍體,遺傳背景極其復(fù)雜,擁有巨大的基因組(≈17.9 Gb)[9]和冗余的重復(fù)序列(>80%),與水稻(≈400 Mb)、玉米(≈3 Gb)等[10]基因組相對(duì)較小的作物相比,其功能研究和作用機(jī)制研究較其它作物困難。盡管如此,酵母雙雜交技術(shù)在小麥功能基因組學(xué)研究方面也得到了較好的應(yīng)用。2020年,Yu等[11]利用酵母雙雜證實(shí)了小麥蛋白磷酸酶PP2C-a10可與小麥延遲萌發(fā)蛋白TaDOG1L1(DELAY OF GERMINATION 1)和TaDOG1L4相互作用,促進(jìn)轉(zhuǎn)基因擬南芥種子萌發(fā),降低種子的耐旱性。2021年,Kim等[12]利用酵母雙雜技術(shù)成功驗(yàn)證了編碼RNA聚合酶ii相關(guān)因子1(PAF1)基因TaELF7可與環(huán)型E3連接酶TaHUB2直接相互作用,為解析該基因在小麥小花發(fā)育和揚(yáng)花階段起負(fù)調(diào)控因子的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。除此之外,該技術(shù)在研究小麥產(chǎn)量[13-15]、品質(zhì)[16]、干旱脅迫[17]等方面也發(fā)揮了重要作用。

氮作為一種必要的大量元素對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育有非常重要的作用,在小麥中,合理使用氮肥,提高氮肥利用效率,對(duì)增加小麥產(chǎn)量,改善小麥品質(zhì)至關(guān)重要[18]。近年來,許多學(xué)者在小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(nitrate transporter 1,NRT1)家族[19-20]以及單個(gè)家族成員[21]對(duì)提高小麥氮肥利用效率方面做了大量的研究。2022年,小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因TaNRT1.1-1A(TraesCS1A02G210900.1)、TaNRT1.1-1B(TraesCS1B02G224900.1)和TaNRT1.1-1 D(TraesCS1D02G214200.1)被克隆了出來;其中,TaNRT1.1-1A基因和TaNRT1.1-1B基因可能在硝酸鹽的吸收過程中發(fā)揮了重要作用,TaNRT1.1-1D基因可能在硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮了重要作用[21]。但這些基因是如何在小麥體內(nèi)發(fā)揮作用的,和它相互作用的蛋白有哪些,并不知曉。因此,本研究通過對(duì)小麥TaNRT1.1-1A自激活檢測(cè),并利用酵母雙雜交技術(shù)篩選與TaNRT1.1-1A互作的候選蛋白,為進(jìn)一步闡明 TaNRT1.1-1A調(diào)控小麥硝酸鹽吸收有關(guān)的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

酵母雙雜交載體pGBKT7、酵母菌株Y2H Gold、小麥百農(nóng)矮抗58的cDNA文庫均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供;酵母雙雜交載體pGADT7-T、陰性對(duì)照pGBKT7-Lam[22]、陽性對(duì)照pGBKT7-P53[22]以及小麥TaNRT1.1-1A-pMD18-T質(zhì)粒DNA(包括TaNRT1.1-1ACDS序列全長(zhǎng))由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥資源與環(huán)境研究所土壤研究室保存。

1.2 TaNRT1.1-1A誘餌載體的構(gòu)建及酵母轉(zhuǎn)化

根據(jù)小麥TaNRT1.1-1A基因編碼區(qū)序列(TraesCS1A02G210900.1)及pGBKT7載體序列,設(shè)計(jì)特異性引物(TaNRT1.1-1A-F: GAATTCATGGGCTCGGTGCTGC; TaNRT1.1-1A-R: GGATCCTCAGTGACCGACGATCA),在該基因兩端分別引入EcoR I和BamH I(Promega, 美國)酶切位點(diǎn)。以小麥TaNRT1.1-1A-pMD18-T質(zhì)粒DNA為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增,PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序參照王沙沙等[21]的方法進(jìn)行操作。1%瓊脂糖凝膠電泳用于檢測(cè)目的片段。目的片段回收和純化后,同時(shí)與pGBKT7載體進(jìn)行雙酶切、連接、轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。

利用特異性引物TaNRT1.1-1A-F/R進(jìn)行單克隆菌落的PCR檢測(cè), 篩選陽性克隆,并測(cè)序驗(yàn)證融合質(zhì)粒pGBKT7-TaNRT1.1-1A克隆正確。利用 PEG/LiAC 介導(dǎo)酵母轉(zhuǎn)化方法,將pGBKT7-TaNRT1.1-1A+pGADT7載體、陽性對(duì)照pGBKT7-T+pGADT7-p53、 陰性對(duì)照pGBKT7-T+pGADT7-Lam轉(zhuǎn)化至Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞中。

1.3 誘餌表達(dá)載體pGBKT7-TaNRT1.1-1A的自激活檢測(cè)

將含pGBKT7-TaNRT1.1-1A的酵母菌、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照分別涂布SD-Trp/-Leu、SD-Trp/-Leu/-His/X-α-Gal、SD-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal平板篩選培養(yǎng),驗(yàn)證pGBKT7-TaNRT1.1-1A是否具有自激活活性。

1.4 誘餌質(zhì)粒、小麥百農(nóng)矮抗58文庫質(zhì)粒的擴(kuò)繁和制備

分別挑取誘餌質(zhì)粒(pGBKT7-TaNRT1.1-1A)和百農(nóng)矮抗58的新鮮菌斑到500 μL LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行重懸后,加入到 200 mL LB液體培養(yǎng)基(50 μg·mL-1Amp)中,37 ℃過夜培養(yǎng)。分別提誘餌質(zhì)粒、文庫質(zhì)粒DNA備用。

1.5 TaNRT1.1-1A互作蛋白的篩選

按照MatchmakerTMGold Yeast Two-Hybrid System User Manual(Clontech,Cat.No.630489)的方法將已構(gòu)建pGBKT7-TaNRT1.1-1A誘餌質(zhì)粒10 μg及小麥酵母雙雜交文庫質(zhì)粒40 μg混合均勻,轉(zhuǎn)入10 mL的Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞中,振蕩混勻。加入6 mL 1×PEG/liAc混合液,再次振蕩混勻。30 ℃ 200 ～230 r·min-1,振蕩培養(yǎng)30 min。加入200 μL的DMSO,上下溫和顛倒混勻。42 ℃熱激15 min后迅速置于冰上2～3 min。瞬時(shí)離心,12 000 r·min-1,5～10 s。棄上清,加入8 mL 0.25×YPDA重懸混勻。取200 μL菌液均勻涂布于SD-Trp/-Leu/-His/X-Gal/AbA培養(yǎng)基上,30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。待菌斑長(zhǎng)到直徑2 mm大小時(shí),將藍(lán)色克隆轉(zhuǎn)移至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上繼續(xù)篩選,設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照,3次重復(fù),二次篩選陽性克隆即為候選克隆。提取篩選獲得的陽性克隆質(zhì)粒,用特異性引物對(duì)(AD-F:CGGCTAGTAAAATTGATGATGGTAATAATTCA;AD-R:CACAGTTGAAGTGAACTTGCGG)對(duì)陽性克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定,并送樣測(cè)序。利用NCBI 的BLAST database(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)所測(cè)得的序列進(jìn)行同源性分析,初步確定互作蛋白的基因及蛋白信息。

1.6 TaNRT1.1-1A互作蛋白的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

為驗(yàn)證pGBKT7-TaNRT1.1-1A與候選蛋白存在互作,將構(gòu)建好的pGBKT7-TaNRT1.1-1A質(zhì)粒與pGADT7-候選互作蛋白質(zhì)粒,通過酵母雙雜交的方法共轉(zhuǎn)于Y2H Gold酵母感受態(tài)細(xì)胞中,依次涂布于SD-Trp/-Leu/-His+/X-α-Gal/AbA和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA培養(yǎng)基上,培養(yǎng)3～5 d。設(shè)置陽性和陰性對(duì)照,3次重復(fù), 觀察共轉(zhuǎn)酵母質(zhì)粒在平板上的生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 誘餌表達(dá)載體pGBKT7-TaNRT1.1-1A的構(gòu)建

將小麥TaNRT1.1-1A CDS序列連接到載體pGBKT7上,重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,并對(duì)所得單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè),結(jié)果如圖1所示,目的片段與基因片段(1 803 bp)大小一致。提取大腸桿菌質(zhì)粒并測(cè)序,測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確,說明 pGBKT7-TaNRT1.1-1A誘餌載體構(gòu)建成功。

M:DL2000; 1～3為pGBKT7-TaNRT1.1-1A菌液PCR片段。M: DL2000; 1-3 represent the PCR fragments of positive colony of pGBKT7-TaNRT1.1-1A圖1 陽性克隆菌液PCR電泳檢測(cè)Fig.1 PCR electrophoresis detection of positive colony

2.2 誘餌表達(dá)載體pGBKT7-TaNRT1.1-1A的自激活檢測(cè)

為驗(yàn)證TaNRT1.1-1A是否具有自激活活性,將pGBKT7-TaNRT1.1-1A重組載體、陰性對(duì)照pGBKT7-Lam和陽性對(duì)照pGBKT7-p53分別與pGADT7共同轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H Gold感受態(tài)細(xì)胞中。3 種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母后在單缺培養(yǎng)基(SD/-Trp)上均能夠生長(zhǎng),說明這 3 種質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到酵母中。陰性對(duì)照在X-α-Gal 的三缺、四缺培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng),含有 pGBKT7-TaNRT1.1-1A重組載體的酵母和陽性對(duì)照在含有X-α-Gal 的三缺、四缺培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng),而且均能顯示藍(lán)色,說明TaNRT1.1-1A能夠激活下游報(bào)告基因的表達(dá),TaNRT1.1-1A編碼的蛋白具有自激活功能(圖2)。

圖2 pGBKT7-TaNRT1.1-1A 誘餌載體轉(zhuǎn)化酵母自激活檢測(cè)Fig.2 Detection of self-activation of pGBKT7-TaNRT1.1-1A bait vector

2.3 TaNRT1.1-1A互作蛋白的篩選

將小麥百農(nóng)矮抗58文庫質(zhì)粒DNA和無自激活活性的誘餌表達(dá)載體pGBKT7-TaNRT1.1-1A通過質(zhì)粒共轉(zhuǎn)的方法轉(zhuǎn)化Y2H Gold酵母感受態(tài)中,依次涂布于SD/-Trp/-Leu/-His、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 以及SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA營養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基上,30 ℃培養(yǎng) 3～5 d,經(jīng)3次連續(xù)篩選,共獲得38個(gè)藍(lán)色單克隆菌落(圖3)。

1～38是篩選獲得的互作蛋白陽性克隆; -表示陰性對(duì)照; +表示陽性對(duì)照。1-38 are positive colonies of TaNRT1.1-1A interacting proteins; - represents the negative control; + represents the positive control.圖3 小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 TaNRT1.1-1A互作蛋白的篩選Fig.3 Screening of candidate interacting protein for nitrate transporter TaNRT1.1-1A in wheat

2.4 候選互作蛋白的鑒定及其序列分析

利用特異性引物對(duì)所獲得的陽性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),篩選獲得的陽性克隆均能獲得擴(kuò)增條帶(圖4)。將篩選獲得陽性克隆進(jìn)行酵母質(zhì)粒提取,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,并進(jìn)行序列測(cè)定。將所獲得的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,確定2種與TaNRT1.1-1A候選互作蛋白,它們分別為XP_044340979.1和XP_044344556.1 (表1)。其中XP_044340979.1是與植物致病有關(guān)的含絲氨酸天冬氨酸重復(fù)序列蛋白Sdr I-like,XP_044344556.1是未知蛋白。

M:DL6000;1～38為互作蛋白陽性克隆PCR條帶;-表示陰性對(duì)照;+ 表示陽性對(duì)照。M:DL6000;1-38:PCR bands of interaction positive clones;- represents the negative control;+ represents the positive control.圖4 互作陽性克隆PCR檢測(cè)Fig.4 PCR detection of interacting positive colonies

表1 TaNRT1.1-1A蛋白酵母雙雜交篩選得到的陽性克隆信息Table 1 Screening of the TaNRT1.1-1A protein positive colony information by yeast two-hybrid system

2.5 TaNRT1.1-1A與互作蛋白Sdr I-like的回轉(zhuǎn)驗(yàn)證

將篩選獲得的含候選蛋白Sdr I-like的質(zhì)粒(陽性克隆A1-21)和誘餌載體進(jìn)行一對(duì)一驗(yàn)證, 經(jīng)酵母轉(zhuǎn)化后在 SD/Ade/His/Leu/Trp/X-α-Gal/AbA 四缺平板上生長(zhǎng), 顯示該克隆能長(zhǎng)出藍(lán)色克隆(圖5), 說明篩選獲得的陽性克隆可能與TaNRT1.1-1A存在互作關(guān)系。

圖5 小麥TaNRT1.1-1A蛋白與候選互作蛋白Sdr I-like回轉(zhuǎn)驗(yàn)證Fig.5 Validation of TaNRT1.1-1A and candidate protein Sdr I-like of wheat

3 討論

合理使用氮肥,提高小麥的氮素利用效率對(duì)增加小麥產(chǎn)量、保證國家糧食安全以及促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展等均具有重要意義。硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NRT1.1)作為植物吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的主要載體在提高小麥氮肥利用效率方面發(fā)揮了重要作用。因此,開展與小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白相關(guān)研究對(duì)提高小麥氮肥利用效率,增加小麥產(chǎn)量至關(guān)重要。許多學(xué)者首先針對(duì)小麥龐大的、復(fù)雜的NRT1家族成員進(jìn)行了鑒定。例如,小麥NPF(NRT1)轉(zhuǎn)運(yùn)基因家族成員的復(fù)雜組成[23]、染色體位置、進(jìn)化關(guān)系和表達(dá)譜等[19]方面。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展以及各種小麥數(shù)據(jù)庫平臺(tái)的建立和健全,小麥TaNRT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族的鑒定工作取得了更大的進(jìn)步。 郭志強(qiáng)等[20]通過借助生物信息學(xué)的數(shù)據(jù)庫對(duì)小麥TaNRT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因家族77個(gè)成員進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定,可為后續(xù)相應(yīng)基因的功能組學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。除此之外,在其單個(gè)基因功能的研究方面也取得了較大的進(jìn)展。王沙沙等[21]從小麥中克隆了水稻硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋基因OsNRT1.1B在小麥中的三個(gè)同源基因TaNRT1.1-1A、TaNRT1.1-1B和TaNRT1.1-1D。不同組織qRT-PCR分析結(jié)果表明,TaNRT1.1-1A基因和TaNRT1.1-1B基因?qū)ο跛猁}的吸收過程發(fā)揮重要作用,而TaNRT1.1-1D基因?qū)ο跛猁}在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)方面發(fā)揮重要作用。另外,在研究TaNRT1.1-1A基因等位變異與氮利用效率之間關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn),其啟動(dòng)子上游-1 120 bp 位置8 bp(TGCATGCA)插入位點(diǎn)與TaNRT1.1基因的高表達(dá)與氮利用效率密切相關(guān)。不同基因型小麥品種的qRT-PCR分析結(jié)果表明,TaNRT1.1基因表達(dá)可能正調(diào)控小麥氮利用效率。該研究初步明確了TaNRT1.1基因的生物學(xué)功能,并為后期對(duì)其進(jìn)行功能標(biāo)記開發(fā)以及功能研究奠定基礎(chǔ)。

本研究分析了TaNRT1.1-1A的轉(zhuǎn)錄激活活性,結(jié)果表明:TaNRT1.1-1A不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。隨后以TaNRT1.1-1A為誘餌蛋白,利用酵母雙雜技術(shù)篩選小麥百農(nóng)矮抗58的酵母cDNA文庫,獲得了2個(gè)無重復(fù)性候選互作蛋白。由于普通小麥具有龐大的基因組[9]和冗余的重復(fù)序列,遺傳基礎(chǔ)極其復(fù)雜,對(duì)其進(jìn)行功能基因組學(xué)研究較為困難。本研究通過酵母雙雜交技術(shù)成功找到TaNRT1.1-1A的互作蛋白,該方法可為解析與小麥氮吸收相關(guān)的分子機(jī)制及其調(diào)控機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

Sdr I是從腐生葡萄球菌菌株7108中鑒定出來的一種絲氨酸-天冬氨酸重復(fù)蛋白,研究表明,該蛋白是生物致病(包括人體尿路感染)的重要因素[24]。另有研究證實(shí),NRT1轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因正調(diào)控植物致病。如Pike等[25]研究葡萄和擬南芥白粉病等致病機(jī)制影響時(shí)發(fā)現(xiàn),在其感病的植株葉片內(nèi),該蛋白基因上調(diào)表達(dá)。本研究通過酵母雙雜交技術(shù)篩選到了小麥TaNRT1.1-1A的互作蛋白Sdr I-like,推測(cè)TaNRT1.1-1A可能與其相互作用,參與小麥病害有關(guān)的調(diào)控機(jī)制。早期的研究證實(shí),過度施用N肥可導(dǎo)致小麥銹病、白粉病、葉枯病以及穗部交鏈孢菌黑霉病等各種病害的發(fā)生[26-27]。因此,進(jìn)一步推測(cè)TaNRT1.1-1A可能與Sdr I-like蛋白相互作用,通過調(diào)控N肥的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)一步提高氮肥利用效率,減少小麥病害的發(fā)生,最終提高小麥產(chǎn)量。但二者是如何發(fā)揮作用有待進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

小麥硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TaNRT1.1-1A無自激活活性;以 TaNRT1.1-1A為誘餌,篩選獲得了與植物抗病等相關(guān)的2個(gè)TaNRT1.1-1A候選互作蛋白;利用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)其候選互作蛋白Sdr I-like進(jìn)行了回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。該研究結(jié)果為深入解析TaNRT1.1-1A調(diào)控小麥氮吸收相關(guān)的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。