湯水粉，錢卓真，李雷斌，劉智禹，王麗娟，位紹紅，姜琳琳，余 穎，陳宇鋒，劉海新，陳 思，羅方方

(福建省水產研究所，福建省海洋生物增養(yǎng)殖與高值化利用重點實驗室，福建 廈門 361013)

本研究在已有文獻和相關標準的基礎上，以菊黃東方鲀?yōu)檠芯繉ο螅M實際養(yǎng)殖中全池潑灑的給藥方式，研究呋喃西林代謝物氨基脲(Semicarbazide，SEM)在菊黃東方鲀體內的殘留與消除規(guī)律，評估使用呋喃西林后的代謝物SEM在菊黃東方鲀體內的殘留風險，為河鲀魚的安全健康養(yǎng)殖及質量安全風險評估提供科學的數據支持。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備

SEM標準品(CH5N3O，純度>99.0%，德國Augsburg公司)；內標SEM-13C-15N2標準品(13CH6ClN15N2O，純度>99.0%，德國WIETGA公司)；2-硝基苯甲醛(純度>98.0%，美國Sigma公司)；乙酸乙酯、正己烷、甲酸、甲醇(色譜純，美國Tedia公司)；乙酸銨、鹽酸、磷酸氫二鉀(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)。

TSQ Quantum Ultra液相色譜-串聯四級桿質譜聯用儀(美國Thermo Fisher公司)；Hypersil Gold C18色譜柱(100 mm × 2.1 mm，3.0 μm，美國Thermo公司)；AB204-E電子分析天平(精密度0.1 mg)、ME203E電子分析天平(精密度0.001 g，Menler Toledo公司)；SHA-B水浴恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)；MS3旋渦混合器(德國IKA公司)；DT5-5低速離心機(北京時代北利離心機有限公司)；HSC-24B氮吹儀(廣州智真生物科技有限公司)；Milli-Q純水機(法國Millipore公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 養(yǎng)殖條件

實驗地點為福建省水產研究所水產養(yǎng)殖實驗基地，養(yǎng)殖水體體積為20 m3，時間：12月—翌年3月。實驗用健康的菊黃東方鲀共計200尾，平均體質量約為250 g。實驗前，先對菊黃東方鲀進行暫養(yǎng)，正常投喂空白飼料，兩周后挑選體色、活力均正常的健康菊黃東方鲀進行實驗。

1.2.2 實驗設計與采樣

實驗分為1組空白對照組和2組平行給藥組，每組約有菊黃東方鲀70尾。經檢測，實驗用魚投藥前未檢出SEM。根據養(yǎng)殖過程中的菊黃東方鲀實際情況，對于給藥組，每組稱取10.0 g呋喃西林原粉，先用養(yǎng)殖水對其進行一定的溶解后，再進行全池潑灑，使養(yǎng)殖池中呋喃西林溶液理論濃度為0.5 mg/m3。于給藥后第8天對養(yǎng)殖池進行換水。給藥后第1、2、4、6、8、10、13、16、19、23、27、34、41、48、52、62和77天的上午9點進行樣品采集，每批次樣品至少采集3尾，去皮并處理取得肌肉部分，勻漿后將樣品分成3份，于-20 ℃冰箱中冷凍保存，一周內進行檢測?？瞻讓φ战M不給藥，采樣方法同給藥組。所有組別的養(yǎng)殖條件均一致，實驗周期為77 d。

1.2.3 樣品前處理

樣品前處理參考GB 31656.13—2021《食品安全國家標準 水產品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測定 液相色譜-串聯質譜法》[31]中的方法。

1.2.4 色譜條件

流動相：A為0.02%甲酸水溶液，含5 mmol/L乙酸銨；B為0.02%甲酸甲醇溶液。流動相梯度洗脫程序如表1所示。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution program

1.2.5 質譜條件

離子源：電噴霧離子源，正離子模式；噴霧電壓：3.0 kV；毛細管溫度：350 ℃；蒸發(fā)室溫度：220 ℃；鞘氣壓力：3.0×105Pa；輔助氣壓力：6.6×104Pa；碰撞氣壓力：0.20 Pa。

質譜參數：SEM離子對209/166，碰撞能量11 eV；離子對209/192，碰撞能量13 eV；離子對212/168，碰撞能量11 eV。

1.2.6 標準曲線

分別準確稱取10.0 mg SEM和SEM-13C-15N2,用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL標準儲備液和100 μg/mL內標儲備液，于-20 ℃冰箱中避光存放；再經稀釋，分別配制成質量濃度為100 ng/mL標準工作液和100 ng/mL內標工作液。于50 mL離心管中分別加入10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、400.0 μL標準工作液，同時加入100 μL內標工作液，按照1.2.3方法進行處理，配制得到的SEM質量濃度為1.0～40.0 ng/mL、內標質量濃度為10.0 ng/mL的系列標準溶液，待上機測定。以SEM的質量濃度為橫坐標，SEM與SEM-13C-15N2的峰面積比為縱坐標，得到線性回歸方程和相關系數。

1.2.7 加標回收率

在空白的菊黃東方鲀肌肉樣品中，分別加入100 ng/mL SEM標準溶液10.0、50.0 μL(相當于SEM在肌肉中的質量分數為0.50、2.50 μg/kg)，避光放置至少30 min，使SEM滲入肌肉組織。每個加標濃度作3個平行樣，按照1.2.3方法進行處理，經上機測定求得該方法的平均回收率和相對標準偏差。

1.2.8 數據處理(藥時曲線)

通過上機測定得到每批次樣品中SEM的含量，以采樣時間為橫坐標、SEM含量平均值為縱坐標，采用Excel 2013處理，得到菊黃東方鲀肌肉中SEM的藥時曲線。

2 結果與分析

2.1 線性回歸及回收率

在實驗設置的色譜和質譜條件下，對系列濃度的SEM標準溶液進行測定，可得SEM標準品的選擇離子流圖，圖1為20.0 ng/mL SEM標準溶液的選擇離子流圖。以SEM和內標SEM-13C-15N2的峰面積比值(Y)對SEM質量濃度(X，ng/mL)作線性回歸，SEM在系列濃度范圍內線性關系良好，標準曲線方程為：Y=0.172X-3.94×10-2，R2=0.999 7。同時以空白的菊黃東方鲀樣品為研究對象，考察加標回收率和精密度，得到菊黃東方鲀空白樣和加標樣品的選擇離子流圖(圖2)。結果表明，在加標量為0.50 μg/kg時，樣品平均回收率為112%，相對標準偏差為6.19%；在加標量為2.50 μg/kg時，平均回收率為89.2%，相對標準偏差為3.26%。本研究采用的高效液相色譜-串聯質譜法的精密度和準確度滿足水產品中硝基呋喃類代謝物殘留量檢測的要求。

2.2 SEM在菊東方鲀肌肉中的殘留量及消除規(guī)律

采用實驗選取的處理方法和儀器條件，對不同時間點采集的樣品進行SEM殘留量的測定，得到硝基呋喃代謝物的藥時曲線如圖3所示。由圖可知，在潑灑呋喃西林溶液后，SEM在菊黃東方鲀肌肉中呈現出較強的蓄積能力，1 d后菊黃東方鲀肌肉中檢出SEM的含量為4.50 μg/kg；到第4天，SEM的殘留量逐漸升高至峰值35.0 μg/kg；之后，SEM的殘留量開始下降，到了第6天迅速下降至15.0 μg/kg，隨后達到平衡狀態(tài)，消除速率趨于平緩；21 d后，SEM殘留量維持在9.00～12.0 μg/kg的濃度水平；35 d后SEM殘留量開始出現比較明顯的降低，但消除速率緩慢；直至第77天實驗結束時，肌肉中的SEM質量濃度還有約2.50 μg/kg，仍高于5倍檢出限(0.50 μg/kg)。

3 討論

3.1 SEM在菊東方鲀肌肉中的殘留量趨勢分析

呋喃西林潑灑到池塘后，菊黃東方鲀肌肉中SEM含量的達峰時間、峰濃度值是反映藥物在機體內消除規(guī)律的重要參數。在實驗的前期階段，菊黃東方鲀肌肉中SEM的殘留量呈現隨時間的延長顯著增加并達到最高值(第4天)再波動降低的趨勢(圖3)。這是因為在潑灑藥物后，呋喃西林原藥一部分在養(yǎng)殖水體中降解為SEM[28]，一部分則通過被菊黃東方鲀的皮膚、鰓、飲食等不同方式進行吸收或滲透，在體內代謝為SEM，從而使魚體內的SEM含量升高。相關研究表明，呋喃西林原藥在養(yǎng)殖水體中1 d內即降解為SEM[28]，而進入水生動物體內后，在幾小時內就迅速代謝為SEM[22-23，25]。而根據藥時曲線，菊黃東方鲀肌肉中SEM含量是逐漸升高的，在第4 天左右才達峰，而不是在第1 天。因此，推測在給藥后的0～4 d內，魚體除了自身吸收原藥代謝產生的SEM外，同時也在不斷吸收環(huán)境中的SEM，從而導致肌肉中SEM含量的累積。而第6天的迅速降低，可能是魚體自身的代謝和排泄導致的。在給藥第8天換水后，肌肉中SEM含量并沒有明顯的下降，反而有少量上升的趨勢，由此可見，到消除階段后期，養(yǎng)殖水體對肌肉中SEM含量的累積并沒有明顯的影響。根據索紋紋等[28]的研究結果，在水體中的SEM剛開始時消除速率較快，隨后趨于平緩并慢慢降至檢出限以下。這可能是養(yǎng)殖水體不再影響肌肉中SEM累積的原因所在。在第8～48天，SEM含量雖然整體上是下降的趨勢，但是有三次出現回升，這可能是SEM含量在體內降低至一定程度后達到了相對平衡，與環(huán)境互相循環(huán)所致。

3.2 SEM在菊東方鲀肌肉中的消除規(guī)律分析

本實驗開展的時間是12月—翌年3月，水溫比較低，而藥物的吸收和代謝受環(huán)境溫度的影響，在高溫條件下，動物代謝加強加快，藥物消除速率也會高于低溫狀態(tài)[24]。因此本次的研究結果僅代表該季節(jié)條件下SEM的殘留消除規(guī)律。另外，硝基呋喃類藥物對光敏感，在光照充足的條件下，降解加快，同時養(yǎng)殖環(huán)境中的微生物也會影響SEM的消除[24-25]。因此，室外的池塘養(yǎng)殖環(huán)境以及高溫條件下菊黃東方鲀對SEM的殘留消除規(guī)律還有待進一步研究。

4 結論

本實驗研究了在全池潑灑的給藥方式下，呋喃西林代謝物SEM在菊黃東方鲀肌肉中的殘留消除規(guī)律。直至實驗結束，菊黃東方鲀肌肉中的SEM仍未被消除至檢出限以下，可見SEM在菊黃東方鲀體內的消除時間較長。因此在實際的水產養(yǎng)殖過程中，應嚴格禁止呋喃西林藥物的使用。本實驗的研究結果可為河鲀魚的健康養(yǎng)殖提供科學的數據支持，也有利于相關管理部門對水產養(yǎng)殖過程中呋喃西林使用情況的嚴格監(jiān)控，進一步加強排查和監(jiān)測，從而保證水產品的質量安全。