牛明澤

時(shí)至今日，我們已經(jīng)知道G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）是質(zhì)膜受體中最大、最普遍存在的家族之一。人類基因組中有約千個(gè)編碼此類受體的基因，調(diào)控了人類生理過(guò)程中幾乎所有已知的方面，例如視覺(jué)、味覺(jué)和嗅覺(jué)等感官方式等。也正因如此普遍，目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)上市的藥物中，約三分之一靶向GPCRs，并且這一比例仍在上升。不難看出，這一龐大、多樣化的受體家族是生命科學(xué)和醫(yī)藥領(lǐng)域極為重要的研究對(duì)象。隨著對(duì)GPCRs結(jié)構(gòu)和功能的深入研究，它們不僅成為藥物研發(fā)的主要靶點(diǎn)，也為我們了解人體生理學(xué)的基本原理提供了極為重要的啟示。

“受體”的探索

受體研究在當(dāng)今的生物醫(yī)學(xué)研究中發(fā)揮著非常重要的作用，但直到最近的三四十年，人們才普遍接受它們的存在。

一個(gè)多世紀(jì)以來(lái)，細(xì)胞如何感知和響應(yīng)外界刺激一直是生物學(xué)中的一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題?？缭郊?xì)胞膜并能夠感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)的“受體假說(shuō)”在今天看來(lái)是合乎邏輯的，但是當(dāng)這個(gè)想法在20世紀(jì)早期首次被英國(guó)藥理學(xué)家蘭利（J. N.Langley）提出時(shí)，它備受爭(zhēng)議并且遭到質(zhì)疑。

蘭利的假設(shè)指出，受體結(jié)構(gòu)具有兩個(gè)相互關(guān)聯(lián)的功能：首先，受體與化學(xué)物質(zhì)或刺激物相互作用，大概率是通過(guò)特定的方式結(jié)合它們；其次，受體也作用于細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)器以改變它們的功能。然而具有諷刺意味的是，雖然蘭利的假設(shè)在當(dāng)時(shí)并未被學(xué)界所認(rèn)同，但他的學(xué)生亨利 ? 戴爾（Henry Hallett Dale）卻因膽堿能神經(jīng)信號(hào)傳遞的研究于1936年獲得了諾貝爾獎(jiǎng)。而目前科學(xué)家早已查明，乙酰膽堿受體是鑲嵌在膜上的蛋白，其中毒蕈堿受體（M受體）就是一種GPCR。

在接下來(lái)的很長(zhǎng)一段時(shí)間里，有很多科學(xué)家在“旁敲側(cè)擊”地證明著受體的存在，比如厄爾 ? 薩瑟蘭（Earl Sutherland）。

20世紀(jì)40年代，薩瑟蘭專注于人體處于饑餓狀態(tài)下的能量代謝機(jī)制研究，開(kāi)啟了一系列關(guān)于腎上腺素和胰高血糖素刺激肝糖原轉(zhuǎn)化為葡萄糖機(jī)制的實(shí)驗(yàn)。他發(fā)現(xiàn)，這些激素通過(guò)一種間接而復(fù)雜的機(jī)制，增加了肝臟內(nèi)磷酸化酶的數(shù)量。直到1956年，他只能在完整的肝細(xì)胞中顯示腎上腺素的這種功能。但是在1957年，他表明這些激素可以激活肝臟勻漿中的酶。薩瑟蘭和其同事進(jìn)一步的工作表明，將肝臟勻漿離心后就可以使其中的酶失活，向離心后產(chǎn)生的上清液中添加激素也不能使酶恢復(fù)活性。然而，當(dāng)激素被添加到離心的細(xì)胞碎片中時(shí)，它們刺激了熱穩(wěn)定因子的形成，從而激活了酶。這種因子被分離出來(lái)，被后來(lái)的人鑒定為3',5'-單磷酸腺苷，其更加廣為人知的名字是環(huán)AMP（cAMP），而那個(gè)酶也被命名為腺苷酸環(huán)化酶。薩瑟蘭也因?yàn)檫@項(xiàng)出色的工作獲得了1971年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

薩瑟蘭的工作表明腎上腺素激活一種膜酶——腺苷酸環(huán)化酶，它合成cAMP（一種細(xì)胞內(nèi)第二信使），通過(guò)涉及蛋白激酶的信號(hào)級(jí)聯(lián)確保糖原的水解。但是腎上腺素等激素、神經(jīng)遞質(zhì)（其中很多在當(dāng)時(shí)已經(jīng)被識(shí)別）是如何被細(xì)胞識(shí)別的呢？于是藥理學(xué)家偽造了受體的概念[受體在當(dāng)時(shí)仍被稱作接受物質(zhì)（Receptive Substance）]，其中一些受體，特別是腎上腺素受體和去甲腎上腺素受體（如α-和β-腎上腺素能受體）具有明確的藥理學(xué)特征。然而，在20世紀(jì)60年代后期，受體仍沒(méi)有生化實(shí)體。

此外，還有很多未與GPCR聯(lián)系起來(lái)，但實(shí)際上卻與GPCR息息相關(guān)的科學(xué)發(fā)現(xiàn)。比如，1967年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)?lì)C給了發(fā)現(xiàn)動(dòng)物感光機(jī)制的科學(xué)家。現(xiàn)在我們知道視紫紅質(zhì)或感光蛋白都屬于GPCR家族成員，但當(dāng)時(shí)并未將感光系統(tǒng)與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)聯(lián)系起來(lái)。

“感知”和“看見(jiàn)”GPCR

“假設(shè)”的證據(jù)已經(jīng)足夠充分，一些科學(xué)家也開(kāi)始著手尋找這些“看不見(jiàn)摸不著”但又客觀存在的東西，以證明它們的存在。

雖然魚(yú)兒們?nèi)绱祟B皮，但對(duì)我這個(gè)“釣魚(yú)高手”來(lái)說(shuō)，也只是雕蟲(chóng)小技。我先將一撮沒(méi)有連著線的魚(yú)食拋進(jìn)了魚(yú)群，那些魚(yú)兒們過(guò)去嗅了嗅，都走開(kāi)了。他們好像在嘲笑我：“哼！我們才不中計(jì)呢！想把我們釣走，沒(méi)門兒！”可他們不知道，他們已經(jīng)中計(jì)了！剛剛我把魚(yú)食拋得很近，本來(lái)就是給他們?cè)O(shè)的圈套。他們一下子躲到了后面，卻不料我的魚(yú)鉤上已經(jīng)放了魚(yú)食在等他們，其中一個(gè)調(diào)皮的，上去咬了一口，沒(méi)有被釣起來(lái)，他的膽子就變大了，一口將魚(yú)食吞了下去，我熟練的將魚(yú)竿收回，哈！一條黑色的魚(yú)！我用同樣的方法，又釣了九條魚(yú)！

20世紀(jì)60年代，美國(guó)科學(xué)家馬丁 ? 羅德貝爾（Martin Rodbell）將計(jì)算機(jī)信息加工過(guò)程與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程進(jìn)行類比，并細(xì)化了第二信使假說(shuō)，提出了新的作用模型，即信號(hào)傳遞需要三類基本元件：辨別器、轉(zhuǎn)換器和放大器。細(xì)胞膜上的受體作為辨別器，而cAMP引起的下游激活則可以作為放大器，二者之間的轉(zhuǎn)換器即為G蛋白。

1980年，阿爾弗雷德 ? 吉爾曼（Alfred G. Gilman）將G蛋白純化，發(fā)現(xiàn)它由α、β、γ三個(gè)亞基組成，因此又稱為異源三聚體G蛋白。他進(jìn)一步闡明了G蛋白的作用機(jī)理：當(dāng)配體與受體結(jié)合時(shí)，三聚體G蛋白解離并發(fā)生GDP與GTP的交換，游離的α-GTP處于活化開(kāi)啟態(tài)，導(dǎo)致其結(jié)合并激活效應(yīng)器蛋白，從而傳遞信號(hào)；當(dāng)α-GTP水解形成α-GDP時(shí)，則處于失活關(guān)閉態(tài)，終止信號(hào)傳遞并導(dǎo)致三聚體G蛋白重新組裝，系統(tǒng)恢復(fù)進(jìn)入靜息狀態(tài)。吉爾曼和羅德貝爾的發(fā)現(xiàn)揭示了G蛋白將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)換為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的分子機(jī)制，開(kāi)創(chuàng)了細(xì)胞信號(hào)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)研究的新時(shí)代。同樣，羅德貝爾和吉爾曼因這項(xiàng)出色工作獲得了1994年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

自此，G蛋白開(kāi)始擁有姓名。但是，作為“辨別器”的受體呢？它們當(dāng)然不會(huì)被忽視。與此同時(shí)，還有一些優(yōu)秀的科學(xué)家也在為如何“感知”和“看見(jiàn)”受體做著努力。

1968到1971年間，美國(guó)科學(xué)家羅伯特 ? 萊夫科維茨（Robert J. Lefkowitz）與他的學(xué)生和同事一起開(kāi)發(fā)了放射性配體結(jié)合分析技術(shù)，并采用放射性標(biāo)記的方法標(biāo)記了糖皮質(zhì)激素和腎上腺素，證明了受體獨(dú)立于腺苷酸環(huán)化酶的存在。通過(guò)逐步摸索受體分離的方法，萊夫科維茨小組純化了β-腎上腺素能受體，幾年后，他們把純化后的、可與腎上腺素結(jié)合的細(xì)胞表面蛋白導(dǎo)入不響應(yīng)腎上腺素的細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的表現(xiàn)與具有腎上腺素受體的細(xì)胞一致，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果使人們真正相信了細(xì)胞表面受體的獨(dú)立存在。而且，他們還利用放射性配體結(jié)合研究多種因素對(duì)受體的調(diào)節(jié)，并發(fā)現(xiàn)了之前未知的受體亞型，在此基礎(chǔ)上發(fā)展了有關(guān)受體作用機(jī)制的理論。

今天看來(lái)，克隆基因可能是一項(xiàng)非常簡(jiǎn)單的任務(wù)，幾乎每個(gè)生化實(shí)驗(yàn)室都可以完成。只要可以獲得純化的腎上腺素受體蛋白，就可以通過(guò)序列測(cè)定獲得蛋白的部分序列信息，從而極大地促進(jìn)對(duì)腎上腺素受體的研究。但由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)限制，這項(xiàng)工作猶如大海撈針。即使在1984年視紫紅質(zhì)基因被成功克隆之后，人們?nèi)匀粵](méi)有將感光受體和激素受體聯(lián)系起來(lái)，而且由于激素受體表達(dá)水平極低，這項(xiàng)工作變得尤為困難。

1986年，布萊恩 ? 科比爾卡（Brian K. Kobilka）作為實(shí)驗(yàn)室研究助理，加入并領(lǐng)導(dǎo)了這項(xiàng)工作。起初，這項(xiàng)工作非常艱難，使用cDNA（反轉(zhuǎn)錄DNA）文庫(kù)反復(fù)嘗試克隆仍然無(wú)法獲得正確的結(jié)果。但是，科比爾卡提出了一個(gè)大膽的想法，嘗試使用基因組文庫(kù)來(lái)完成克隆任務(wù)。

就是在這一年，萊夫科維茨實(shí)驗(yàn)室開(kāi)創(chuàng)了一個(gè)里程碑，成功克隆并測(cè)序分析了編碼倉(cāng)鼠β2-腎上腺素能受體蛋白（β2AR）的基因。經(jīng)過(guò)對(duì)該基因序列的深入研究，他們驚喜地發(fā)現(xiàn)β2-腎上腺素能受體蛋白與牛源視紫紅質(zhì)蛋白的氨基酸序列有著驚人的相似性，二者都包含了七個(gè)跨膜區(qū)域。萊夫科維茨和科比爾卡敏銳地推斷出視紫紅質(zhì)受體和β2-腎上腺素能受體可能屬于同一家族，這個(gè)家族可能編碼著許多重要的激素受體。隨后不久，毒蕈堿乙酰膽堿受體的克隆實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)推論。在此基礎(chǔ)上，科比爾卡等人很快成功克隆了編碼人類β2-腎上腺素受體蛋白的cDNA，還克隆了編碼人類β1-腎上腺素受體、人類血小板α2腎上腺素受體、5-羥色胺受體以及第一個(gè)孤兒受體等一系列受體的基因。這項(xiàng)工作所得到的信息和技術(shù)也為嗅覺(jué)受體這一超級(jí)家族的發(fā)現(xiàn)和克隆奠定了基礎(chǔ)，最終嗅覺(jué)受體的研究工作獲得了2004年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

除了成功克隆出各種不同的受體基因外，科比爾卡還嘗試了一項(xiàng)大膽的工作：對(duì)腎上腺素能受體進(jìn)行結(jié)晶和結(jié)構(gòu)分析。這項(xiàng)工作在當(dāng)時(shí)看來(lái)幾乎是不可能的，因?yàn)镚PCR蛋白豐度低、難以純化，并且很不穩(wěn)定，這些因素決定了其結(jié)晶的難度相當(dāng)大。后續(xù)的故事也向我們?cè)俅巫C明了這一觀點(diǎn)——隨著一些新興技術(shù)的不斷發(fā)展，科比爾卡用了十幾年的時(shí)間才完成了這項(xiàng)工作。

不過(guò)，在萊夫科維茨實(shí)驗(yàn)室中，科比爾卡也通過(guò)融合蛋白與拆分蛋白等方法，探究了GPCR上能夠起到關(guān)鍵作用的區(qū)域。在斯坦福大學(xué)成立自己的實(shí)驗(yàn)室后，他通過(guò)使用嵌合受體和定點(diǎn)突變體的一系列研究繼續(xù)完善GPCR功能域圖譜，并且通過(guò)使用熒光光譜來(lái)表征激動(dòng)劑結(jié)合和激活的機(jī)制，這些前期工作為后續(xù)研究GPCR蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的工作奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

成功雖遲但到。2007年，科比爾卡的研究成果迎來(lái)了爆發(fā)，他通過(guò)將GPCR與抗體共結(jié)晶和在第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)中插入溶菌酶兩種方法，幾乎同時(shí)獲得了β2-腎上腺素能受體的晶體，其中第二種方法不僅得益于脂立方技術(shù)的發(fā)展，還與他之前從分子水平探究GPCR結(jié)構(gòu)域互作的工作脫不開(kāi)關(guān)系。這些結(jié)果幾乎在同一時(shí)間井噴式地發(fā)表在《科學(xué)》《自然》《自然-方法》等頂級(jí)期刊上。從此之后，他的實(shí)驗(yàn)室和其他幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室在激動(dòng)劑、拮抗劑或反向激動(dòng)劑存在的情況下，成功地結(jié)晶了大約50個(gè)A家族GPCR結(jié)構(gòu)，甚至共結(jié)晶β2-腎上腺素能受體的完全活性形式，這些工作使人們更加全面且直觀地了解了GPCR的工作原理。

因?yàn)樗麄兊慕艹龉ぷ?，科比爾卡和他前任“老板”萊夫科維茨共享了2012年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。其實(shí)諾貝爾獎(jiǎng)此前曾多次頒給關(guān)于GPCR的研究，其中涉及受體、配體、感官、疾病等多個(gè)研究領(lǐng)域，但直到這次，人們對(duì)其空間結(jié)構(gòu)和G蛋白的互作方式才有了清晰全面的認(rèn)知。

有一位中國(guó)科學(xué)家致力于系統(tǒng)揭示大麻素的受體

解析GPCR的分子結(jié)構(gòu)，不僅可以讓我們從微觀角度更加了解自己的生理結(jié)構(gòu)，還能夠以此為依據(jù)開(kāi)發(fā)新的藥物靶點(diǎn)，有著非常重要的科學(xué)與現(xiàn)實(shí)意義。

“做科研可能是99.99%的失敗，0.01%的成功，這就意味著你要坐得起‘冷板凳’，經(jīng)受得住打持久戰(zhàn)的考驗(yàn)，有信心有定力的人才有希望。”這是上?？萍即髮W(xué)劉志杰教授常用來(lái)激勵(lì)學(xué)生的話，也是他科研工作的真實(shí)寫(xiě)照。

2012年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主萊夫科維茨（左）和科比爾卡（右）

劉志杰教授團(tuán)隊(duì)與其解析的大麻素受體CB1與激動(dòng)劑復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)

多年來(lái)，劉志杰將研究目標(biāo)鎖定在與重大疾病相關(guān)的GPCR上，在多種精神和神經(jīng)類疾病、疼痛及炎癥、免疫調(diào)節(jié)類疾病等靶點(diǎn)上不斷突破、碩果累累。其中一個(gè)主要方向便是系統(tǒng)研究大麻素受體結(jié)構(gòu)與功能。

為什么大麻素受體如此值得研究？

人體有11個(gè)主要的器官系統(tǒng)，包括循環(huán)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等，所有這些系統(tǒng)構(gòu)成了人體。此外，還存在一個(gè)內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)（ECS），雖然大多數(shù)人幾乎沒(méi)了解過(guò)它，但它非常重要——通過(guò)動(dòng)態(tài)平衡調(diào)節(jié)身體，例如身體溫度不能太熱或太冷，血糖水平不能太高或太低等。ECS系統(tǒng)主要涉及三個(gè)關(guān)鍵部分：存在于細(xì)胞表面的大麻素受體、激活大麻素受體的內(nèi)源性大麻素、分解內(nèi)源性大麻素的代謝酶。大麻素受體主要包括兩種——兩個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體分子：CB1和CB2。

CB1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中更為豐富，例如，當(dāng)神經(jīng)元過(guò)度興奮，內(nèi)源性大麻素釋放，與CB1結(jié)合，使得過(guò)度活躍的神經(jīng)元安靜下來(lái)。我們熟知的大麻中的關(guān)鍵成分——四氫大麻酚也是與CB1結(jié)合而起作用，如果科學(xué)家能揭示其中的作用機(jī)理，挖掘大麻的治療價(jià)值就有了可能。實(shí)際上已經(jīng)有研究人員正在探索這項(xiàng)工作，包括探索大麻對(duì)抗癌癥帶來(lái)的疼痛但產(chǎn)生更少的副作用。近些年研究發(fā)現(xiàn)，可治療抑郁癥的“裸蓋菇素”也可能是通過(guò)CB1在起作用。

CB2在神經(jīng)系統(tǒng)外更豐富，包括免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。當(dāng)細(xì)菌或病毒感染引發(fā)免疫反應(yīng)時(shí)，免疫細(xì)胞釋放“促炎分子”，這些信號(hào)分子可以告訴其他免疫細(xì)胞共同加入戰(zhàn)斗。內(nèi)源性大麻素也被釋放，向其他免疫細(xì)胞發(fā)出信號(hào)，在尋求幫助的同時(shí)避免過(guò)度炎癥反應(yīng)；在炎癥結(jié)束時(shí)，促使細(xì)胞和身體返回平衡狀態(tài)。因此，CB2受體被認(rèn)為是治療炎癥和免疫類疾?。ɡ缣弁?、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、自身免疫疾病等）的理想靶點(diǎn)。

在過(guò)去幾年中，劉志杰教授及研究團(tuán)隊(duì)系統(tǒng)揭示了大麻素受體的拮抗、激活及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的分子機(jī)制。相關(guān)研究成果分別于2016、2017和2019年發(fā)表在《自然》和《細(xì)胞》雜志上。2023年，華甜/劉志杰團(tuán)隊(duì)與合作者在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《自然 -通訊》上發(fā)表了研究論文，揭示了大麻素受體CB2在分子水平與配體結(jié)合的選擇性機(jī)制。該研究為靶向CB2的藥物設(shè)計(jì)提供了精準(zhǔn)模板和理論指導(dǎo)。

除大麻素受體，劉志杰教授團(tuán)隊(duì)在其他GPCR結(jié)構(gòu)解析方面也取得了重要的科研成果。2017年，他們成功解析了糖尿病治療的重要靶標(biāo)GLP1受體與別構(gòu)小分子的復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)，并揭示了其拮抗機(jī)制。2023年由埃隆 ? 馬斯克帶火的Ozempic就是GLP1受體激動(dòng)劑。它本用來(lái)治療糖尿病，但人們意外發(fā)現(xiàn)它的“副作用”——減肥頗有效。劉志杰團(tuán)隊(duì)的成果與這種藥物的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)緊密相關(guān)。除此以外，在肥胖癥、精神分裂癥、癌癥等相關(guān)的GPCR受體結(jié)構(gòu)及機(jī)制揭示上，劉志杰團(tuán)隊(duì)陸續(xù)都有重要發(fā)現(xiàn)。也因此種種重要發(fā)現(xiàn)，劉志杰教授團(tuán)隊(duì)完成的“G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)與功能的系統(tǒng)性研究”項(xiàng)目獲得了2020年度上海市自然科學(xué)獎(jiǎng)一等獎(jiǎng)。

值得注意的是，2022年9月16日，劉志杰教授團(tuán)隊(duì)在《科學(xué)》雜志上發(fā)表了苦味受體的冷凍電鏡高分辨結(jié)構(gòu)，成功破解了苦味受體的神秘面紗，這也是國(guó)際上首個(gè)發(fā)表的苦味受體結(jié)構(gòu)。該研究填補(bǔ)了T類GPCR結(jié)構(gòu)的空白，為探索苦味受體的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制開(kāi)創(chuàng)了新途徑，未來(lái)還將促進(jìn)針對(duì)苦味受體的化學(xué)感知和藥物候選分子的探索。要知道，感覺(jué)類受體的揭示長(zhǎng)期以來(lái)都備受諾獎(jiǎng)青睞。