申茂恒,蒲 齡,田程程,代國滔,田宇杰,陳浩林*

（1.安順市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,貴州 安順 561000；2.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所,貴州 貴陽 550005）

平壩區(qū)位于貴州省中部地區(qū)，地勢平坦，水資源豐富，適合發(fā)展水禽產(chǎn)業(yè)，當(dāng)?shù)匾云綁位淫Z、三花鵝、獅頭鵝等品種為主，逐步形成了養(yǎng)殖、加工、銷售的產(chǎn)業(yè)鏈［1］，成為該縣實現(xiàn)鄉(xiāng)村振興的重要產(chǎn)業(yè)。隨著肉鵝養(yǎng)殖密度的增加，免疫程序、消毒措施、糞污處理方式不當(dāng)?shù)纫蛩?，?dǎo)致養(yǎng)殖場常見細菌如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、魏氏梭菌、金黃色葡萄球菌等滋生，而前期對平壩區(qū)細菌感染情況的調(diào)查較少，導(dǎo)致養(yǎng)殖場盲目使用抗生素，病鵝產(chǎn)生細菌耐藥性，給養(yǎng)殖場細菌病的防控帶來極大困難。為平壩區(qū)養(yǎng)殖戶的細菌病防控提供理論依據(jù)，收集2021年平壩區(qū)不同養(yǎng)殖場發(fā)病鵝的組織樣品，開展細菌感染情況調(diào)查，明確平壩區(qū)細菌感染的感染率、不同細菌的分布情況等。

1 材料與方法

1.1 樣品收集

2021年從貴州省安順市平壩區(qū)采集76份發(fā)病鵝組織樣品，包括鵝的腦組織、肝臟、腸道等，樣品送至貴州省畜牧獸醫(yī)研究所畜禽疫病研究室進行病原的分離和鑒定。

1.2 主要試劑

TSA 固體培養(yǎng)基、TSB 液體培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、沙門氏菌二代鑒別培養(yǎng)基等，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；新生牛血清，購自浙江天杭微生物科技股份有限公司；DNA 提取試劑盒、2×Pfu MasterMix，購自北京世紀(jì)康為生物科技有限公司；Puc57 克隆載體、DH5α、DNA Marker，購自寶生物工程有限公司。

1.3 樣品的初步分離

組織樣品在超凈工作臺內(nèi)打開，用酒精棉擦拭組織樣本外側(cè)并灼燒，灼燒后的鑷子將深層組織暴露。使用一次性醫(yī)用棉簽蘸取深層組織涂布于含0.5%酵母提取物和5%牛血清的TSA 培養(yǎng)基上，在含5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)16～32h后觀察菌落形態(tài)，挑取單菌落傳代培養(yǎng)對樣品進行純化。腸道內(nèi)容物用一次性醫(yī)用棉簽蘸取，在BPW 培養(yǎng)基震蕩培養(yǎng)48 h 后，取50 μL 接種至TTB 液體培養(yǎng)基中，震蕩培養(yǎng)48 h 后平板劃線至沙門氏菌二代鑒別培養(yǎng)基上，進行初步鑒定。經(jīng)純化后的菌落分別接種至麥康凱培養(yǎng)基、甘露醇鹽瓊脂培養(yǎng)基、伊紅美藍培養(yǎng)基、沙門氏菌二代鑒別培養(yǎng)基，鴨疫里氏桿菌和巴氏桿菌在含0.5%酵母提取物和5%牛血清的TSA 培養(yǎng)基上為圓潤光滑的菌落，在無血清或無全血的培養(yǎng)基上不生長。大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基上呈玫紅色，在伊紅美藍培養(yǎng)基上呈黑色并帶有金屬光澤；沙門氏菌在沙門氏菌二代鑒別培養(yǎng)基上呈紫色圓形菌落；金黃色葡萄球菌在甘露醇鹽培養(yǎng)基上呈含淡黃色暈環(huán)的金黃色菌落。根據(jù)不同細菌在不同培養(yǎng)基上的生長情況對其進行初步鑒定。

1.4 菌株的PCR鑒定

將初步鑒定的細菌擴大培養(yǎng)后，采用水煮法提取細菌DNA，采用表1 的引物對樣品進行擴增，將PCR 鑒定后的菌株使用甘油肉湯液體培養(yǎng)基于－40 ℃保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 鵝細菌感染的檢測結(jié)果

對收集的76 份樣品進行細菌分離鑒定，從表2可知，61份樣品中分離出細菌94株，15份樣品未分離出細菌，分離率80.3%。其中分離大腸桿菌41 株，分離率最高，為43.6%；鴨疫里氏桿菌30 株，分離率次之，為31.9%；分離沙門氏菌16 株，分離率17.0%；金黃色葡萄球菌7 株，分離率7.4%；未分離到巴氏桿菌。

表2 樣品中不同細菌分離情況

2.2 鵝細菌的多重感染情況

從表3 可知平壩區(qū)的鵝細菌感染情況。76 份樣品中，有33 份樣品為單一細菌感染，單一感染大腸桿菌占比25.0%、單一感染鴨疫里氏桿菌占比11.8%，單一感染金黃色葡萄球菌占比3.9%，單一感染沙門氏菌占比2.6%。有28 份樣品同時檢出2 種以上細菌，其中大腸桿菌和鴨疫里氏桿菌混合感染占比14.5%，大腸桿菌和沙門氏菌混合感染占比6.6%，沙門氏菌和鴨疫里氏桿菌混合感染占比3.9%；大腸桿菌和金黃色葡萄球菌混合感染占比2.6%。有6 份樣品同時檢出大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里氏桿菌3種細菌感染，占比7.9%。

表3 樣品的細菌感染情況

續(xù)表3

3 討論與結(jié)論

對平壩區(qū)2021年的病料進行收集和檢測表明，大腸桿菌、鴨疫里氏桿菌、沙門氏菌是危害鵝場的主要病原細菌，臨床感染致病性大腸桿菌的鵝關(guān)節(jié)腫大，跛行，有氣囊炎、腹膜炎、心包炎、輸卵管炎等，2 個月以內(nèi)的鵝易感［2］。20日齡左右的雛鵝感染疫里氏桿菌概率極高，病死率居高不下，剖檢最典型的癥狀是心臟、肝臟、氣囊的纖維素性炎癥［3］。沙門氏菌主要引起雛鵝的腹瀉、糊肛以及腸外感染，鼠傷寒沙門氏菌是主要流行血清型［4］。葡萄球菌引起鵝內(nèi)臟器官、肌肉出血［5］，發(fā)病率低。試驗未檢出巴氏桿菌，與采集樣品為30日齡以內(nèi)的鵝為主，而巴氏桿菌主要感染成年鵝和產(chǎn)蛋鵝，因此檢出率低。試驗中，單一細菌感染占比僅為43.3%，混合感染占比36.8%，提示細菌病感染情況復(fù)雜，應(yīng)關(guān)注多種細菌的混合感染，加強細菌的流行病學(xué)監(jiān)測，優(yōu)化疫病防控措施，控制混合感染和繼發(fā)感染，以減少細菌病的發(fā)生。