潘敏慧，黃小乘，田怡豪，孫占微，李成云,2,3

（1.延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 吉林 延吉 133002；2.延邊大學(xué)肉?？茖W(xué)與產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心, 吉林 延吉 133002；3.東北寒區(qū)肉牛科技創(chuàng)新教育部工程研究中心, 吉林 延吉 133002）

青貯飼料是一種營養(yǎng)豐富、適口性好，易于吸收的飼料，是反芻動物的重要飼料來源[1]。柞樹葉的蛋白質(zhì)含量較高，是一種比較優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)飼料資源。張棟等[2]觀測不同粗纖維(玉米秸葉、柞樹葉)來源日糧對東北梅花鹿瘤胃內(nèi)環(huán)境的影響，結(jié)果表明以柞樹葉為粗纖維來源組成的日糧對東北梅花鹿?fàn)I養(yǎng)需求與瘤胃發(fā)酵更為有利。青貯柞樹葉的粗蛋白質(zhì)、粗脂肪含量都高于青貯玉米稈的含量，而粗纖維的含量卻比青貯玉米低[3]。青貯添加劑的使用已有百年多的歷史，如今使用的添加劑種類已超過百種。青貯添加劑分為青貯發(fā)酵促進(jìn)劑、有害微生物抑制劑、營養(yǎng)添加劑和好氧性變質(zhì)抑制劑[4]。青貯添加劑一般具有防止青貯飼料腐敗、提高青貯飼料的營養(yǎng)和改善飼料適口性的作用[5]。如今，多種青貯添加劑被商業(yè)化而廣泛的生產(chǎn)使用。有研究表明，在青貯玉米中以乳酸菌作為添加劑可以減少3%的青貯原料損耗[6]。張嘉懿等[7]研究表明，單獨(dú)或混合添加不同發(fā)酵類型乳酸菌都提高了青貯品質(zhì)。乳酸菌添加劑在提高青貯品質(zhì)的同時對動物的生產(chǎn)性能具有影響，如飼料利用率[8]。但也有研究表明，加乳酸菌添加劑后青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)并沒有明顯的提升，卻對動物的生產(chǎn)性能有益[9]。同時，添加菌劑處理的青貯飼喂反芻動物后對其瘤胃具有一定的影響[10]。糖蜜是一種富含碳水化合物的物質(zhì)，主要是為乳酸菌提供更多的有效能，有利于乳酸發(fā)酵。有些研究表明，青貯時添加糖蜜，會降低pH 和氨態(tài)氮，增加乳酸、乙酸以及可溶性碳水化合物含量，并提高青貯品質(zhì)[11-12]。柞樹葉青貯處理后有利于其保存和品質(zhì)的提高，但不同添加劑處理柞樹葉青貯對瘤胃降解率和微生物菌群的影響研究鮮有報道。因此，擬研究不同添加劑處理柞樹葉青貯對延邊黃牛瘤胃降解率和微生物菌群的影響，以期篩選出最佳的發(fā)酵添加劑，為青貯柞樹葉在反芻動物上的實際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

柞樹葉于2021 年9 月中旬在延邊朝鮮族自治州草原管理站采集，其化學(xué)成分為干物質(zhì)含量(DM) 41.32%、粗 蛋 白 質(zhì)(CP) 14.17、粗 脂 肪(EE)6.64、粗灰分(ASH) 3.00、酸性洗滌纖維(ADF)48.07、中性洗滌纖維(NDF) 55.96、鈣(Ca) 0.96、磷(P) 0.21 和縮合單寧(CT) 4.22。糖蜜由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供，乳酸菌和EM 菌由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動物營養(yǎng)實驗室提供，1%石灰水由無水氫氧化鈣配制。

1.2 試驗設(shè)計

試驗采用單因子試驗設(shè)計，對照組用無添加劑處理，其余6 組試驗組分別用乳酸菌、糖蜜、石灰水和EM 菌，或者是其中兩者結(jié)合，不同處理均設(shè)3 個重復(fù)，具體試驗設(shè)計如表1 所列。

表1 試驗設(shè)計Table 1 Experimental design

1.3 試驗動物及飼糧

選擇平均體重為(443.3 ± 26.7) kg、年齡在1.5～2歲裝有永久性瘤胃屢管的延邊黃牛公牛4 頭。基礎(chǔ)飼糧按照美國NRC (2000)生長育肥階段配制，每日定時飼喂2 次(07:00 和16:00)，自由飲水。將不同添加劑處理的紫柞樹葉青貯添加到日糧中進(jìn)行試驗。基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平如表2 所列。

表2 試驗飼糧組成及營養(yǎng)水平Table 2 Composition and nutrient levels of experimental diets

1.4 方法

1.4.1 青 貯飼料調(diào)制

青貯柞樹葉調(diào)制的具體方法和步驟參考潘敏慧等[13]試驗方法。

1.4.2 瘤 胃液采集

在晨飼前2 h 內(nèi)經(jīng)瘤胃瘺管采集3 頭試驗牛的瘤胃液，用8 層紗布過濾后，迅速置于提前預(yù)熱至39 ℃的保溫瓶中帶回實驗室。

1.4.3 體 外培養(yǎng)

參照Menke 等[14]的方法配制瘤胃緩沖液，將人工瘤胃液與采集的牛瘤胃液以2 ? 1 的比例進(jìn)行混合，用于青貯柞樹葉體外發(fā)酵。每1 g 柞樹葉，加入70 mL 人工瘤胃液。每組每個重復(fù)稱取2 g 青貯柞樹葉樣品放入尼龍袋，置于有發(fā)酵培養(yǎng)液的體外發(fā)酵瓶中，在(39 ± 0.5) ℃恒溫水浴搖床中培養(yǎng)發(fā)酵48 h。

1.4.4 樣品的采集及瘤胃DNA 的提取

發(fā)酵48 h 之后，對微生物樣品進(jìn)行采集，具體方法和步驟參考黃小乘[15]試驗方法。

1.4.5 引 物設(shè)計及PCR 擴(kuò)增

引物由北京百邁客生物科技有限公司合成，用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和反 向 引 物806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTA AT-3′)對V3-V4 區(qū)進(jìn)行全長16S rRNA 基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)程序、具體方法和步驟參考黃小乘[15]試驗方法。

1.5 測定指標(biāo)及方法

1.5.1 降 解率的測定

發(fā)酵結(jié)束后，取出尼龍袋，沖洗干凈后放在65 ℃烘箱中充分烘干至恒重并稱重記錄，用于DM、CP 以及NDF 含量的測定，并計算降解率。

1.5.2 高通量測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計

測序完成后，按照Li 等[16]的描述進(jìn)行序列提取、過濾和優(yōu)化。使用UCLUST 基于97%的相似度水平識別將唯一序列集劃分OTU (operational taxonomic units)[17]。最后，使用Mothur 3 軟件將代表性序列與Silva (細(xì)菌)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，獲得分類信息[16]。采用QIIME 軟件計算α 多樣性指數(shù)，繪制香農(nóng)指數(shù)曲線和稀釋度曲線，使用ANOVA 方法進(jìn)行顯著物種差異分析，進(jìn)行主成分(PCoA)分析，微生物相關(guān)性分析、功能預(yù)測分析等[18]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 記錄試驗數(shù)據(jù)并進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)計算，使用SPSS 26.0 進(jìn)行單因素方差分析，并通過最小顯著性差異法(LSD)和鄧肯(Duncan)法對各組的平均值進(jìn)行多重比較，P< 0.05 表示差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果用“平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛瘤胃降解率的影響

與對照組相比，各組青貯柞樹葉干物質(zhì)降解率、粗蛋白質(zhì)降解率和中性洗滌纖維降解率都有了顯著的提高(P< 0.05) (表3)。其中，M 組和LAB-M組的干物質(zhì)降解率差異不顯著(P> 0.05)，其他各組間干物質(zhì)降解率差異顯著(P< 0.05)；EM-M 組的粗蛋白質(zhì)降解率顯著高于其他試驗組(P< 0.05)，LABM 組的粗蛋白質(zhì)降解率顯著低于除對照組以外的其他試驗組(P< 0.05)；LAB-M 組和EM 組的中性洗滌纖維降解率差異不顯著(P> 0.05)，其他各組間中性洗滌纖維降解率差異顯著(P< 0.05)。在除對照組和W 組以外的各個試驗組中，LW 組的干物質(zhì)降解率、粗蛋白質(zhì)降解率和中性洗滌纖維降解率顯著低于其他4 個組(P< 0.05)。

表3 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛瘤胃體外發(fā)酵干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)和中性洗滌纖維降解率的影響Table 3 Effects of silage oak leaves with different fermentation additives on degradability of dry matter, crude protein and neutral detergent fiber of rumen fermentation in vitro in Yanbian yellow cattle%

2.2 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛瘤胃體外發(fā)酵微生物菌群的影響

2.2.1 瘤 胃內(nèi)容物PCR 擴(kuò)增結(jié)果

試驗電泳PCR 結(jié)果如圖1 所示，片段大小約為500 bp，條帶清晰明亮，可以滿足瘤胃微生物高通量測序的要求。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 結(jié)果Figure 1 PCR results detected by agarose gel electrophoresis

2.2.2 瘤胃液樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

對21 份樣本的16S rRNA 基因V3 和V4 區(qū)進(jìn)行高通量測序共獲得1 610 208 對有效序列，并進(jìn)行了質(zhì)控和優(yōu)化，完全能夠滿足高通量測序要求。通過對各階段樣品序列數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計及數(shù)據(jù)處理，得到的各樣品測序數(shù)據(jù)評估結(jié)果如表4 所列。LW 組的有效序列數(shù)顯著高于EM 組(P< 0.05)，其余各組間差異均不顯著(P> 0.05)；。

表4 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛體外發(fā)酵瘤胃液樣品測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估Table 4 Quality evaluation of sequencing data of in vitro-fermented rumen fluid samples of Yanbian yellow cattle by silage oak leaves with different fermentation additives

2.2.3 瘤胃微生物OTU 豐度、豐富度和多樣性

如圖2 所示，不同樣品的OTU 個數(shù)隨測序深度的增加而增加，細(xì)菌群落稀釋性曲線逐漸平緩，OTU 個數(shù)達(dá)到飽和，表明本研究用于測序的數(shù)據(jù)量足夠大，測序結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映延邊黃牛瘤胃微生物物種多樣性。通過擴(kuò)增子測序，在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類后，各試驗組間得到的細(xì)菌群落OTU 個數(shù)為897～909，各試驗組間OTU 個數(shù)與對照組無顯著差異(P> 0.05)，表明不同發(fā)酵添加劑對延邊黃牛瘤胃細(xì)菌群落OTU 個數(shù)影響不顯著(P> 0.05)。

圖2 細(xì)菌群落稀釋性曲線Figure 2 Dilution curve of bacterial community

如表5 所列，各組的OTUs 和α 多樣性指數(shù)無顯示差異，說明不同的青貯發(fā)酵添加劑處理后對瘤胃微生物豐度和多樣性的影響不顯著(P> 0.05)。

表5 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛體外發(fā)酵瘤胃細(xì)菌群落分類操作單元數(shù)(OTUs)和α 多樣性指數(shù)統(tǒng)計的影響Table 5 Effects of silage oak leaves with different fermentation additives on the number of classified operating units (OTUs) and α diversity index of the rumen bacterial community in the in vitro-fermentation of Yanbian yellow cattle

2.2.4 瘤 胃 細(xì) 菌 群 落 結(jié) 構(gòu)

不同發(fā)酵添加劑的延邊黃牛瘤胃細(xì)菌群落在門水平和屬水平上的相對豐度居于前10 的物種如圖3 和圖4 所示。7 種不同處理的樣品共檢測到細(xì)菌分屬于11 門、16 綱、40 目、83 科和179 屬。

圖3 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛瘤胃細(xì)菌群落門水平物種相對豐度的影響Figure 3 Effects of silage oak leaves with different fermentation additives on the relative abundances of phyla in the rumen bacterial community of Yanbian yellow cattle

圖4 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛瘤胃細(xì)菌群落屬水平物種相對豐度的影響Figure 4 Effects of silage oak leaves with different fermentation additives on the relative abundances of genera in the rumen bacterial community of Yanbian yellow cattle

細(xì)菌門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)和彎曲桿菌門(Campylobacterota)為各組的優(yōu)勢菌門，其相對豐度分別為27.36%～36.87%、 21.06%～37.58%、21.64%～38.56%和3.99%～16.08% (圖3)。與對照組相比，各試驗組的變形菌門相對豐度有所增加；與對照組相比，擬桿菌門相對豐度僅EM-M 組中增加，其余組則降低；LAB-M 組、EM 組和LAB 組的厚壁菌門相對豐度比對照組多，其余試驗組則少。在各個組中LW 組的彎曲桿菌門的相對豐度比其他菌門都高。

細(xì)菌屬水平上，不動桿菌屬(Acinetobacter)、普氏菌屬(Prevotella)、弓形桿菌屬(Arcobacter)和理研菌科RC9 腸道群(Rikenellaceae_RC9_gut_group)為各試驗組的優(yōu)勢菌屬，其相對豐度分別為19.45%～32.03%、9.46%～17.09%、3.63%～15.78%和4.41%～6.64% (圖4)。與對照組相比，除LAB-M 組和EM 組的不動桿菌屬相對豐度有所降低外，其余組均增加；普氏菌屬相對豐度在各試驗組中均有所降低；弓形桿菌屬相對豐度在LW 組和M 組中分別升高，而余下4 組分別降低。

為進(jìn)一步明確各試驗組間在群落物種組成上的差異性，采用PCoA 分析不同發(fā)酵添加劑的延邊黃牛體外發(fā)酵瘤胃細(xì)菌群落組間差異。如圖5 可知，細(xì)菌群落PC1 和PC2 的累計貢獻(xiàn)率達(dá)81.86%，即根據(jù)主成分分析表明，細(xì)菌群落PC1 和PC2 分別可解釋總變異的34.34%和47.52%。不同試驗組間物種組成存在差異。其中，LW 組和其他組在圖中距離較遠(yuǎn)，表明該組和其他各組組間差異較大。而余下6 組樣品在圖中強(qiáng)烈聚類，表明這幾組樣品組內(nèi)重復(fù)性較好，且組間差異較小。

圖5 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)PCoA 聚類分析圖Figure 5 PCoA cluster analysis of bacterial community structure

2.2.5 瘤胃細(xì)菌群落微生物功能分布差異

為探究不同處理組微生物群落在功能分布上的差異，對細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測。結(jié)果如圖6 所示，細(xì)菌群落功能預(yù)測共有6 大類，其中，對照組中新陳代謝的功能分豐度大于其他各組，但無顯著差異(P> 0.05)。

圖6 延邊黃牛瘤胃細(xì)菌群落的功能預(yù)測Figure 6 Functional prediction of the rumen bacterial community of Yanbian yellow cattle

2.2.6 瘤胃微生物相關(guān)性分析

因前期已做過不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉發(fā)酵品質(zhì)和瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)的影響，在此探究不同發(fā)酵添加劑處理后的微生物相關(guān)性分析。如圖7 和圖8 所示，在門水平上，理化因子1 (青貯品質(zhì)和青貯營養(yǎng)成分)和理化因子2 (瘤胃體外發(fā)酵特性)分別解釋了為60.99%和49.00%的變異。如圖7 所示，在青貯品質(zhì)和青貯營養(yǎng)成分中影響細(xì)菌群落的主要理化因子是ASH、NH3-N/TN 和pH；如圖8 可知，在瘤胃體外發(fā)酵特性中影響細(xì)菌群落的主要理化因子是pH、AA 和總產(chǎn)氣量。

圖7 細(xì)菌群落門水平群落結(jié)構(gòu)與青貯品質(zhì)和青貯營養(yǎng)成分的理化因子RDA 分析Figure 7 RDA analysis of physicochemical factors of bacterial community structure at the phylum level, silage quality, and nutrient composition

圖8 細(xì)菌群落門水平群落結(jié)構(gòu)與細(xì)菌群落門水平群落結(jié)構(gòu)與瘤胃體外發(fā)酵特性的理化因子RDA 分析Figure 8 RDA analysis of physicochemical factors of the phylum level community structure and in vitro rumen fermentation characteristics

通過對門水平上的優(yōu)勢菌門即變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和彎曲桿菌門與理化因子青貯品質(zhì)、青貯營養(yǎng)成分和瘤胃體外發(fā)酵特性進(jìn)行了斯皮爾曼等級分析。結(jié)果如圖9 和圖10所示，在青貯品質(zhì)和青貯營養(yǎng)成分上，擬桿菌門相對豐度與AA 和WSC 分別顯著或極顯著正相關(guān)(P< 0.05)，而與DM 和ASH 分別顯著或極顯著負(fù)相關(guān)(P< 0.05)；彎曲桿菌門相對豐度與pH 和NH3-N 顯著正相關(guān)(P<0.01)；變形菌門相對豐度僅與ASH 具有顯著正相關(guān)(P< 0.01)。在瘤胃體外發(fā)酵特性上，4 個優(yōu)勢菌門中僅彎曲桿菌門相對豐度與pH 具有極顯著相關(guān)性且為正相關(guān)。厚壁菌門與各個理化因子均無顯著的相關(guān)性。

圖9 青貯品質(zhì)和青貯營養(yǎng)成分與細(xì)菌群落門水平相關(guān)性熱圖Figure 9 Heat map of the correlation between silage quality, silage nutrient composition and bacterial community phylum level

圖10 瘤胃體外發(fā)酵特性與細(xì)菌群落門水平相關(guān)性熱圖Figure 10 Heat map of the correlation between the in vitro rumen fermentation characteristics and phylum level of the bacterial community

3 討論

3.1 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛瘤胃降解率的影響

飼料的營養(yǎng)價值可通過營養(yǎng)物質(zhì)的降解率來評定。瘤胃微生物的健康生長關(guān)系著瘤胃的正常發(fā)酵，而瘤胃微生物生長和蛋白合成所需的氮源主要來自于飼料中的粗蛋白[19]。瘤胃發(fā)酵則反映了反芻動物利用瘤胃中微生物對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵和分解的能力[20]。粗蛋白降解率除了與蛋白質(zhì)的來源有關(guān)外，還與其結(jié)構(gòu)有關(guān)[21]。同時，還取決于飼料蛋白質(zhì)發(fā)酵的難易程度和在瘤胃內(nèi)滯留時間[22]。此外，粗蛋白降解率也與發(fā)酵條件有關(guān)，如體外發(fā)酵會造成粗蛋白降解率的降低[23]。反芻動物蛋白質(zhì)的需要量可以通過瘤胃蛋白質(zhì)的降解率來進(jìn)行評估[24]。飼料中干物質(zhì)和中性洗滌纖維降解率是影響飼料營養(yǎng)成分在反芻動物體內(nèi)消化和吸收效率的重要因素[25]。木質(zhì)素是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的中性洗滌纖維，瘤胃微生物無法將其有效利用，因此，木質(zhì)素在中性洗滌纖維中的比例是影響中性洗滌纖維降解率的主要因素[19]。已有些研究表明在青貯飼料中，添加乳酸菌提高了中性洗滌纖維降解率[25-27]。DM 降解率會影響到DM 采食量，瘤胃DM 降解率又與飼料的來源有關(guān)。瘤胃微生物利用DM 的能力，可用DM 降解率來評估，DM 降解率越高，瘤胃發(fā)酵效果就越好[28]。瘤胃中DM 降解率與粗飼料的種類和培養(yǎng)時間有關(guān)，培養(yǎng)時間越長，不同種類粗飼料DM 降解率增加的程度和幅度不一致[29]。越成熟的植物，其DM 降解率就越低，這主要是由植物細(xì)胞內(nèi)容物增加，可消化細(xì)胞壁含量降低引起的[30]。目前，青貯添加劑種類較多，試驗條件無法完全一致，青貯添加劑對瘤胃降解率影響的結(jié)論還未完全統(tǒng)一。本研究中，不同發(fā)酵添加劑組的營養(yǎng)物質(zhì)降解率也有顯著差異(P< 0.05)，各青貯柞樹葉試驗組的DM、粗蛋白質(zhì)以及中性洗滌纖維的降解率均較對照組有顯著升高(P< 0.05)，與Silva 等[31]在青貯柱花草試驗中添加纖維素酶和乳酸菌，可有效地提高瘤胃降解速率的結(jié)果一致。這可能是因為纖維素酶可將植物細(xì)胞的細(xì)胞壁降解成如單糖等更易被瘤胃吸收的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)一步提高了瘤胃降解率。乳酸菌是青貯發(fā)酵促進(jìn)劑，通過增加乳酸菌的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)水溶性碳水化合物(water soluble carbohydrate, WSC)被乳酸菌利用而產(chǎn)生更多的乳酸，青貯內(nèi)環(huán)境迅速酸化，對有害微生物進(jìn)行抑制，可減少青貯飼料中干物質(zhì)的損失，這可能有利于瘤胃微生物對干物質(zhì)的利用。因此，WSC 在青貯過程中微生物的能量代謝起著關(guān)鍵作用。大量乳酸菌發(fā)酵利用部分纖維而導(dǎo)致青貯飼料的中性洗滌纖維降低，也可能是初期細(xì)胞呼吸和酶解過程所導(dǎo)致，進(jìn)一步提高了瘤胃中性洗滌纖維的降解率[32]。酶菌之間存在協(xié)同作用，可進(jìn)一步促進(jìn)青貯飼料的發(fā)酵，改善飼料營養(yǎng)價值。馮鵬等[33]通過對玉米秸稈和馬鈴薯渣混貯飼料進(jìn)行酶、菌和酶菌復(fù)合處理后提高了反芻動物瘤胃對營養(yǎng)物質(zhì)的降解效率，與本研究結(jié)果一致。其中，酶菌復(fù)合處理組效果最佳，酶處理組次之，最后為菌處理組。因此，后期可進(jìn)一步考慮酶菌復(fù)合處理青貯飼料的相關(guān)研究。Mordenti 等[34]認(rèn)為，糖蜜有利于反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，該試驗中添加糖蜜后發(fā)現(xiàn)顯著升高了DM、粗蛋白質(zhì)以及中性洗滌纖維的降解率(P< 0.05)。EM 組和EM-M 組降解率增加顯著，說明EM 處理和EM + 糖蜜處理能夠有效提高飼料利用率。EM 菌是一種混合菌一般包括光合菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌類。本研究中EM 組 和EM-M 組 的 降 解 率 有 顯 著 差 異(P< 0.05)，說明EM 菌與糖蜜可能存在疊加效應(yīng)。推測可能是EM 菌如酵母菌與瘤胃內(nèi)微生物具有協(xié)同效應(yīng)，刺激瘤胃中分泌纖維素酶微生物的生長，促進(jìn)瘤胃內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的消化，糖蜜則是為瘤胃中的微生物提供能量促進(jìn)發(fā)酵微生物的生長增殖，讓瘤胃內(nèi)容物可以更充分發(fā)酵。益生菌有利于緩解反芻動物的酸中毒癥狀，主要是因為益生菌通過穩(wěn)定pH 和為瘤胃微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)對瘤胃環(huán)境具有積極作用[35]。潘峰等[36]通過在肉牛日糧中添加酵母培養(yǎng)物和糖蜜后提高了中性洗滌纖維的表觀消化率，但兩者混合添加對改善肉牛消化率并無疊加效應(yīng)，引起差異的原因除了最主要的測定指標(biāo)不同外，還可能是動物品種，日糧結(jié)構(gòu)和發(fā)酵環(huán)境差異等。關(guān)于營養(yǎng)物質(zhì)的表觀消化率和體外瘤胃降解率的確切關(guān)系目前還不清楚，并且將體外實驗結(jié)果外推到體內(nèi)條件是有局限性的，后續(xù)還需研究。

3.2 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛體外發(fā)酵的瘤胃微生物OTU 豐度、豐富度、多樣性和功能分布差異的影響

瘤胃是反芻動物消化道中體積最大的一部分，它包含復(fù)雜的微生物生態(tài)系統(tǒng)，微生物菌群種類繁多，一般主要包括細(xì)菌、原蟲和真菌[37]。在瘤胃微生物區(qū)系中細(xì)菌占優(yōu)勢菌的主導(dǎo)地位，它們對飼料的消化和微生物蛋白的合成有著非常突出的貢獻(xiàn)[38]。微生物多樣性與飼糧有關(guān)，飼糧組成越復(fù)雜，微生物多樣性就越高[39]。龐凱悅等[40]發(fā)現(xiàn)，全混合日糧舍飼和放牧的牦牛瘤胃內(nèi)非纖維物質(zhì)的降解菌以及半纖維降解菌屬的相對豐度存在差異，說明飼養(yǎng)方式對瘤胃微生物菌群具有影響。有研究表明，微生物的菌群種類和豐富度與動物的年齡有關(guān)[41]。解彪等[42]發(fā)現(xiàn)隨著反芻動物年齡的增長變形菌門的豐富度會逐漸下降至最初的1/8，而在每個樣品中卻可以檢測到豐富的擬桿菌門。斷奶前后犢牛的瘤胃中除擬桿菌門外，厚壁菌門也比其他菌門類豐富[43]。動物的生理狀態(tài)也影響著菌群多樣性和豐度，有研究表明正常組牦牛犢牛的菌群多樣性和豐度均高于腹瀉組[44]。細(xì)菌豐度也與瘤胃的pH 有關(guān)，降低環(huán)境pH，革蘭氏陰性菌的豐度也會減少[45]。菌群相對豐度與發(fā)酵時間有關(guān)，張林等[46]發(fā)現(xiàn)，在門和屬水平優(yōu)勢菌群的相對豐度隨發(fā)酵時間顯著變化，說明優(yōu)勢細(xì)菌種類發(fā)生了變化，但在菌群種類未受飼糧和發(fā)酵時間的影響。有些研究表明，品種對瘤胃細(xì)菌群落組成也有影響。劉開朗等[47]通過比較分析后發(fā)現(xiàn)，牛的品種對瘤胃微生物群落組成的影響大于日糧或其他因素。瘤胃微生物發(fā)酵的初期階段，不同品種牛不光是細(xì)菌的數(shù)量、發(fā)生率和種類有顯著變化，真菌亦是如此[48]。但也有一些研究表明，品種對瘤胃微生物的影響并不明顯，所以有學(xué)者提出品種影響瘤胃微生物群落組成和數(shù)量，需在日糧、動物健康、環(huán)境等條件相同的情況下。由上所述可知眾多因素影響著瘤胃微生物的相對豐度，所以反芻動物瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢菌群種類并不是絕對的，目前關(guān)于反芻動物瘤胃優(yōu)勢微生物排序是無法完全確定的。相同物種豐度的情況下，Simpson 指數(shù)值越小，Shannon 指數(shù)值越大，說明樣品的物種多樣性越高[49]。在本研究中，不同處理組中的瘤胃細(xì)菌群落分類操作單元數(shù)(OTUs)和α 多樣性指數(shù)均顯著性差異，說明不同青貯發(fā)酵添加劑處理對瘤胃細(xì)菌群落無顯著影響。

3.3 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對延邊黃牛瘤胃細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響

瘤胃的消化與菌群數(shù)量的變化有著密切的關(guān)系[50]。本研究中，瘤胃微生物組成方面，各組門水平上變形菌門和擬桿菌門以及厚壁菌門是反芻動物瘤胃內(nèi)的主要微生物菌群，這與趙夢迪[51]和王祖艷等[52]的結(jié)論一致。在育肥羔羊瘤胃內(nèi)，這3 種主要微生物菌群的變化與粗纖維含量有關(guān)。李希等[53]通過探究提高飼糧纖維水平對育肥羔羊瘤胃微生物組成及多樣性的影響后發(fā)現(xiàn)，在門水平上，粗纖維水平增加前以擬桿菌門和變形菌門為主，粗纖維水平增加后，瘤胃微生物以擬桿菌門和厚壁菌門為主。各組屬水平優(yōu)勢菌群為不動桿菌屬、普氏菌屬、弓形桿菌屬和理研菌科RC9 腸道群。普氏菌屬屬于擬桿菌門，其可以對蛋白質(zhì)進(jìn)行降解，促進(jìn)非纖維多糖和果膠的降解[54]。有研究表明，普氏菌屬有直接降解纖維或協(xié)作降解纖維的能力[55]。本研究中，不同青貯發(fā)酵添加劑降低了普氏菌屬的相對豐度，但是卻顯著提高了中性洗滌纖維降解率，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是普氏菌屬相對豐度降低的效果并不顯著，并不會影響到其他瘤胃微生物對中性洗滌纖維的整體降解效率或各種菌屬在不同的個體中的主要作用是有差異的。有結(jié)果顯示，理研菌科RC9 腸道群在維護(hù)腸道健康方面有重要作用[56-57]。本研究中，LAB-M 組和EM 組的中性洗滌纖維降解率顯著高于其他組，可能與理研菌科RC9 腸道群相對豐度的增加有關(guān)。瘤胃中超過一半的脲酶由變形菌門產(chǎn)生[58]。在本研究中，與對照組相比，各試驗組中的變形菌相對豐度均有所增加。植食性動物能夠充分消化利用植物來源的食物，與腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門有關(guān)，因此，在植食性動物的腸道微生物群落中厚壁菌門和擬桿菌門的含量較高，這也是此類動物自身的一種特征[59]。有研究表明，碳水化合物和蛋白質(zhì)的水解與合成和厚壁菌門與擬桿菌門共同作用有關(guān)[60-61]。反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和能量的存儲與各種菌門的相對豐度比值有關(guān)，如厚壁菌門與擬桿菌門這兩類微生物對動物的營養(yǎng)吸收和能量儲存起到了共同促進(jìn)的作用[44]。反芻動物瘤胃菌群豐度的變化因為影響著動物自身對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，所以對動物的生產(chǎn)性能具有影響。反芻動物日增重與厚壁菌門的豐度存在顯著的相關(guān)性，反芻動物飼料利用效率又受菌群豐度的影響[62]。厚壁菌門和擬桿菌門對改善反芻動物機(jī)體脂肪的沉積影響較大[63]。本研究中，與對照組相比，EM-M 組中的擬桿菌相對豐度增加，可能是EM 菌與擬桿菌具有協(xié)同效應(yīng)，說明EM + 糖蜜處理可促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。對于厚壁菌門而言，與對照組相比，LABM 組、EM 組和LAB 組中其相對豐度分別增加，而余下的3 個試驗組的相對豐度降低，差不多與擬桿菌門相對豐度的變化相反，這可能與瘤胃的pH 有關(guān)。Hook 等[64]通過研究亞急性瘤胃酸中毒(SARA)的適應(yīng)和恢復(fù)對高谷物喂養(yǎng)后瘤胃細(xì)菌密度和多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，瘤胃pH 的變化對瘤胃微生物具有影響，當(dāng)pH 降低時會減少擬桿菌門的數(shù)量，卻增加了厚壁菌門的數(shù)量。有研究表明，在飼糧中添加酵母培養(yǎng)物、糖蜜、或同時添加都影響了擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度[36]。但在本研究中，僅EM-M 組高了擬桿菌門的相對豐度，并降低了厚壁菌門的相對豐度，而M 組和LAB-M 組卻不是這樣的變化，這可能與動物、飼糧組成和發(fā)酵條件有關(guān)，如動物的生理狀態(tài)和飼糧中的抗?fàn)I養(yǎng)因子也會對微生物造成影響。趙夢迪[51]通過在青貯野火球中添加低水平縮合單寧后發(fā)現(xiàn)，低水平的縮合單寧對革蘭氏陽性菌活性和分解纖維素類物質(zhì)的微生物豐度具有抑制作用。柞樹葉中主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子為單寧，筆者前期的試驗結(jié)果也已表明不同青貯添加劑顯著降低了柞樹葉青貯飼料的縮合單寧含量[13]。厚壁菌門屬于分解纖維類物質(zhì)微生物，但本研究中相對于對照組而言LAB-M 組、EM 組和LAB 組卻增加了厚壁菌門相對豐度，這可能是與發(fā)酵時間和各組中降低后的柞樹葉青貯飼料中的縮合單寧含量多少有關(guān)。同時，適量的單寧可提高動物的生產(chǎn)性能，有研究表明在湖羊日糧中添加單寧可提高湖羊的平均日增重、屠宰率和免疫力，并降低料肉比且對器官發(fā)育無不良影響[65]。動物的生理狀態(tài)也影響著厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度，當(dāng)動物腹瀉時會降低擬桿菌門和厚壁菌門的相對豐度占比[44]。反芻動物瘤胃中桿菌門相對豐度的提高，有利于動物對纖維素的降解消化。

在PCoA 分析中發(fā)現(xiàn)，LW 組的延邊黃牛瘤胃細(xì)菌群落組成與對照組以及其他試驗組有較大差異。瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、發(fā)酵狀態(tài)和瘤胃微生物正常生長繁殖與瘤胃pH 有關(guān)[66]。有研究表明，反芻動物瘤胃液的pH 正常范圍是6.5～7.5。從門水平上看，LW 組的彎曲菌門的相對豐度是最高的，彎曲菌門是革蘭氏陰性菌，而瘤胃中降低pH，會減少革蘭氏陰性菌的豐度[43]。石灰水呈堿性，其添加可能提高了pH，從而對瘤胃微生物產(chǎn)生了一定影響(如提高了LW 組的彎曲菌門的相對豐度)，造成LW 組與其它組的瘤胃細(xì)菌群落組成有較大差異，這可能也是所有試驗組中，LW 組與CK 組瘤胃降解率相差最小的原因。Liu 等[67]以碳酸氫銨與石灰的混合物作為熏蒸劑幾乎沒有對土壤微生物活性和群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不利影響。當(dāng)然反芻動物瘤胃微生物和土壤微生物還是有一定的差異的，但目前關(guān)于石灰水對動物體內(nèi)微生物影響的相關(guān)研究較少。相較通過宏基因組研究，PICRUSt 功能分析具有方便、成本低和結(jié)果可靠性高等優(yōu)點(diǎn)[68]。本研究將高通量測序結(jié)果進(jìn)行PICRUSt 功能預(yù)測分析。結(jié)果表明，不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉處理的延邊黃牛瘤胃細(xì)菌主要涉及新陳代謝、遺傳信息處理和環(huán)境信息處理等6 個生物代謝通路。其中，各個組均是新陳代謝的功能豐度占比最大，說明瘤胃發(fā)酵過程中大多數(shù)細(xì)菌都參與了瘤胃內(nèi)食糜的代謝，也正是多種微生物的生長代謝促進(jìn)了反芻動物對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收與利用。

3.4 不同發(fā)酵添加劑的青貯柞樹葉對青貯品質(zhì)、青貯營養(yǎng)成分和瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)與瘤胃微生物的相關(guān)性研究

前期已做過不同發(fā)酵添加劑對青貯柞樹葉發(fā)酵品質(zhì)及青貯營養(yǎng)成分的影響[13]。本研究通過青貯品質(zhì)、青貯營養(yǎng)成分和瘤胃體外發(fā)酵參數(shù)與瘤胃微生物的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AA、DM、pH、NH3-N 和ASH、WSC 與瘤胃微生物相對豐度呈顯著或極顯著相關(guān)，但厚壁菌門與各個理化因子均無顯著的相關(guān)性。有研究表明，在不同飼養(yǎng)方式下NH3-N 濃度與瘤胃微生物菌群之間無顯著相關(guān)性[40]。厚壁菌門的許多成員都是有益菌，瘤胃球菌屬是厚壁菌門的成員之一。蒲小寧等[69]探究了小尾寒羊母羊不同繁殖階段瘤胃發(fā)酵功能及微生物菌群變化特征對其繁殖性能的影響，將屬水平上的前20 優(yōu)勢物種與NH3-N 等理化因子進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明瘤胃球菌屬與NH3-N 存在顯著正相關(guān)性，與本研究結(jié)果不一致，這可能是試驗動物和進(jìn)行分析的微生物水平不同造成的。不同的理化因子可能對瘤胃微生物的相對豐度具有影響，但反芻動物的瘤胃是一個非常復(fù)雜的系統(tǒng)，理化因子對微生物的影響也不是單一的，如各個理化因子之間或不同微生物之間可能存在的互作效應(yīng)等，所以綜合性的相關(guān)分析仍需進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

通過在柞樹葉青貯過程中不同青貯添加劑的使用，在一定程度上改善了瘤胃發(fā)酵環(huán)境，提高了瘤胃降解率。各試驗組對于延邊黃牛瘤胃微生物整體區(qū)系構(gòu)成、微生物多樣性以及微生物的豐度均無顯著影響。綜合各項指標(biāo)進(jìn)行評價，各組改善了瘤胃發(fā)酵環(huán)境效果從高到低依次表現(xiàn)為EM-M 組 >LAB-M 組 > M 組 > EM 組 > LAB 組 > LW 組 >CK 組，即EM-M 組提升瘤胃發(fā)酵環(huán)境效果最優(yōu)。