朱倩麗，趙官濤，王 露，何 翔，張洋洋，王常清，聶江山，陳秀蓉

（甘肅亞盛農(nóng)業(yè)研究院有限公司, 甘肅 蘭州 730030）

玉米莖基腐病在全國各玉米(Zea mays)產(chǎn)區(qū)均有危害，大田發(fā)病率一般在10%～15%，嚴(yán)重地塊在80%以上，幾近絕收[1]，已成為繼大、小斑病和絲黑穗病之后我國玉米生產(chǎn)上又一重要的玉米病害[2]。而引起玉米莖基腐病的病原菌比較復(fù)雜，已報道的病原菌有20 余種，我國玉米莖基腐病主要病原菌有鐮孢菌(Fusariumsp.)和腐霉菌(Pythiumsp.)兩大類[3]，不同地區(qū)或不同生態(tài)區(qū)的主要病原菌種類有很大差異。其中禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)在我國玉米種植區(qū)普遍存在，早在20 世紀(jì)80 年代，陜西省、山東省就報道了禾谷鐮刀菌是引起當(dāng)?shù)赜衩浊o基腐病的主要病原菌[4-5]，后來類似的情況在東北地區(qū)及吉林、遼寧、江蘇、新疆等省陸續(xù)出現(xiàn)[6-10]，近年來在甘肅、河南、云南及安徽省也發(fā)現(xiàn)有禾谷鐮刀菌引起玉米莖基腐病[11-15]。

玉米莖基腐病通常從灌漿至乳熟期開始發(fā)病，從始見病葉到全株發(fā)病一般僅7 d 左右，短的只有2～3 d，前期地上部分無明顯癥狀，顯癥時根部早已被病原菌侵染，田間化學(xué)防治效果有限，影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)[16]。由于玉米莖基腐病顯癥晚、病程快，而帶菌種子又是翌年的主要侵染源之一[7]，若想從源頭減少該病害的傳播，前期的種子帶菌快速檢測顯得尤為重要，但目前針對玉米莖基腐病的分子生物學(xué)研究主要是對病原菌的分子鑒定[13,17]及發(fā)病組織中的病原菌類型檢測[18-19]，而種子帶菌的檢測技術(shù)幾乎沒有報道。已有報道中，植物病原菌檢測中應(yīng)用最廣泛的是ITS-PCR (Internal Transcribed Spacer-Polymerase Chain Reaction)技術(shù)[20]，該技術(shù)利用真菌的核糖體基因ITS 序列在種間的高度變異性和種內(nèi)的穩(wěn)定性[21-23]，針對ITS 區(qū)設(shè)計特異引物進行特異性PCR 擴增，可直接通過分析ITS 序列對真菌進行分類鑒定[24-26]；也可針對ITS 序列設(shè)計特異性引物進行特定病原菌檢測[27-28]，是國際上對病原真菌分類鑒定、監(jiān)測及病害診斷使用最廣泛的分子技術(shù)[20]。但有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，ITS 序列并不是鐮刀菌屬鑒定的最優(yōu)基因序列選擇，存在鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確的情況[29]；本研究也曾針對禾谷鐮刀菌的ITS 序列設(shè)計引物進行了PCR 擴增，但因為鐮刀菌屬的核糖體DNA 高度保守，同屬不同種ITS 序列中的堿基間差異不是很大，所以引物的特異性不高，不能從多種鐮刀菌屬菌株中準(zhǔn)確區(qū)分出禾谷鐮刀菌。

為解決上述問題，本研究將突破點轉(zhuǎn)向了巢式PCR (Nested PCR)技術(shù)，該技術(shù)是一種常規(guī)PCR 技術(shù)的改良模式。常規(guī)PCR 只使用一對特異性引物進行擴增，但巢式PCR 由外引物和內(nèi)引物兩對特異性引物組成，降低了擴增多個靶位點的可能性，極大地提高了特異性和靈敏性，多用于檢測癥狀不明顯、寄主內(nèi)病原物采用普通檢測方法難檢測的真菌病害[20]，是建立快速、靈敏且高度特異種子檢測的理想方法，故本研究基于巢式PCR 分子技術(shù)，針對禾谷鐮刀菌設(shè)計特異性引物，構(gòu)建了玉米種子攜帶禾谷鐮刀菌的檢測體系，為該病的早期診斷和及時防治提供技術(shù)支持和理論依據(jù)，以期減少該病造成的經(jīng)濟損失，也為其他作物同類致病菌的早期診斷提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：禾谷鐮刀菌(TS-3)及其他參試菌株(表1)均來源于實驗室分離。另于田間采集種子樣品16 份備用。

表1 參試菌株及來源Table 1 Source of tested isolates

以上供試菌株均為實驗室分離后得到的菌株，已結(jié)合形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定后確認了菌株類型。選擇供試菌株的依據(jù)：由于本研究是針對禾谷鐮刀菌的檢測體系，故另外又選擇了6 種鐮刀菌屬的菌株作為對照；同時還選用了玉米種子上較為常見的青霉菌(Penicilliumsp.)和鏈格孢菌(Alternariasp.)以及玉米內(nèi)生真菌球毛殼菌(Chaetomium globosum)；除上述9 種子囊菌外，另外選用了一種半知菌-菜豆殼球孢(Macrophomina phaseolina)；以上參試菌株均作為特異性檢測對照菌株。

1.2 主要試劑和設(shè)備

2 × Taq PCR Master Mix II (TIANGEN，版本號：180813)、T-Vector pMDTM19 (Simple)連 接 試 劑 盒(TAKARA Code：3271)購于甘肅儀泰克科技服務(wù)有限公司，膠回收試劑盒(BW-DC3511)購于杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司，TreliefTM5α Chemically Competent Cell (目錄號：TSC-C01)購于北京擎科生物科技有限公司。

Buffer A：100 mmol·L-1NaOH，2% Tween 20，現(xiàn)配現(xiàn)用。

Buffer B：100 mmol·L-1Tris-HCl，2 mmol·L-1EDTA，pH = 2.0。

PCR 擴增儀(伯樂，T100)、電泳儀電源(北京六一儀器廠，DYY-6D)、水平電泳槽(北京六一儀器廠，DYCP-31DN)、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠，WD-9413B)。

1.3 供試菌的處理及DNA 提取

將菌株活化后，在PSA 平板上25 ℃暗培養(yǎng)5 d，小心收集菌絲體，使用真菌基因組DNA 提取試劑盒(OMEGA Fungal DNA Kit)提取菌絲DNA，方法按試劑盒說明書進行。

參試菌株也可用NaOH 裂解法[30]快速提取DNA：取適量菌絲至PCR 管中，加入50 μL Buffer A 溶液，PCR 儀內(nèi)95 ℃溫育10 min，向PCR 管內(nèi)加入50 μL Buffer B 溶液，輕輕震蕩混勻，得到含有g(shù)DNA 的溶液，不可長時間保存(不能超過14 d)，應(yīng)盡快使用。

1.4 禾谷鐮刀菌PCR 產(chǎn)物測序

以劉金華等[19]報道的禾谷鐮刀菌的特異性引物HG-F/R (如表2)對菌株TS-3 進行PCR 擴增，擴增體系(參照2 × Taq PCR Master Mix II 說明書)為25.0 μL：2 × Taq Master Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，補足滅菌水至25.0 μL。擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸23 s，共35 個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min；4 ℃保存。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences

參照膠回收試劑盒(BW-DC3511)試劑盒說明書先將PCR 擴增產(chǎn)物回收純化，再按照pMD19-T vector 連接試劑盒說明書及感受態(tài)細胞(TreliefTM5α Chemically Competent Cell)說明書將回收純化后的擴增產(chǎn)物連接到T 載體上轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞中，經(jīng)培養(yǎng)篩選到PCR 擴增驗證正確的陽性菌落后送至北京擎科生物科技有限公司測序。

1.5 特異性引物的設(shè)計與合成

以HG-F/R 為內(nèi)引物，根據(jù)內(nèi)引物在菌株TS-3的擴增測序結(jié)果，在GenBank 中進行序列比對，根據(jù)比對結(jié)果定位其在整個基因組中的位置，并根據(jù)該位置向兩側(cè)延伸至擴增產(chǎn)物為600～1 000 bp，設(shè)計特異性外引物。設(shè)計所用到的軟件為SnapGene，引物序列如表3，引物位置如(圖1)。設(shè)計的引物均由北京擎科生物科技有限公司合成并純化。

圖1 巢式PCR 體系引物示意圖Figure 1 Schematic Diagram of Primers used in Nested PCR System

表3 巢式PCR 擴增引物Table 3 Amplification primers for nested PCR

1.6 巢式PCR 反應(yīng)體系

擴增體系同1.4。首先用外引物hg1/hg11 擴增，反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，57 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸54 s，共35 個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min；4 ℃保存。

將擴增后的產(chǎn)物稀釋500 倍后取1 μL 為模板，以內(nèi)引物HG-F/HG-R 進行第2 輪擴增，反應(yīng)程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸20 s，共32 個循環(huán)；72 ℃總延伸5 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。

1.7 特異性檢測

以巢式PCR 反應(yīng)體系分別擴增各參試菌株，無菌水作陰性對照，同時以巢式PCR 反應(yīng)體系中的第2 輪擴增反應(yīng)作為常規(guī)PCR 對照，與巢式PCR 反應(yīng)體系對比效果，PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。試驗重復(fù)3 次。

1.8 靈敏度檢測

將菌株TS-3 所提取的gDNA 濃度稀釋至13.2 ng·μL-1作為模板1，再將其5 倍梯度稀釋分別得到濃 度為2.64 ng·μL-1、0.528 ng·μL-1、0.105 6 ng·μL-1、21.12 pg·μL-1、4.224 pg·μL-1、0.844 8 pg·μL-1的模板gDNA，用巢式PCR 和常規(guī)PCR 反應(yīng)體系分別進行擴增，以檢驗和分析其靈敏度。試驗重復(fù)3 次。

1.9 模擬玉米帶菌種子檢測

樣品制備：菌株TS-3 活化后培養(yǎng)15 d 后制備孢子懸浮液，濃度約為3 × 104個·mL-1孢子。取15 g健康玉米種子(約45 粒)放入50 mL 離心管中，分別加入200、100、80、60、40、20、10、5、1 μL 孢子懸浮液，震蕩混勻，完成接菌。

樣品總DNA 的提?。合蜓b15 g 帶菌玉米種子及裝有15 g 健康玉米種子的50 mL 離心管中分別加入滅菌水至40 mL 刻度線，震蕩均勻后浸泡4 h，然后將浸出液于3 000 r·min-1離心10 min，棄上清取離心后的沉淀，以NaOH 裂解法(參照1.3)快速提取DNA。

巢式PCR 體系檢測：取沉淀提取的含gDNA 的溶液各1 μL，以菌株TS-3 提取的gDNA 為陽性對照，無菌水為陰性對照，用1.6 中所述巢式PCR 反應(yīng)體系進行擴增。

PCR 擴增產(chǎn)物分析：PCR 產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測，結(jié)束后在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并拍照。試驗重復(fù)3 次。

1.10 田間玉米種子檢測

在田間不同地塊采集當(dāng)年的玉米種子16 份，每份取適量種子進行巢式PCR 體系檢測。樣品總DNA 提取、巢式PCR 體系檢測及PCR 擴增產(chǎn)物分析等步驟同1.9。

1.11 田間玉米種子樣品PCR 產(chǎn)物序列分析

將田間玉米種子樣品PCR 擴增產(chǎn)物送至北京擎科進行測序，并將測序結(jié)果在GenBank 中進行BLAST 分析以驗證其特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷鐮刀菌PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果

以禾谷鐮刀菌的特異性引物HG-F/R (表2)進行PCR 擴增，經(jīng)連接轉(zhuǎn)化單克隆后測序，得到分子量大小為328 bp 的序列，具體如下：

>GCAGGGTTTGAATCCGAGACTTCAGAACG GTTTCGCCAATCGTTTGTCATGTTGTGCTTTGTTT GGAGCTTTGATGTGAAAACGGAGCTATTCCGAA GGGAAGTCCGGGGATGATGCAGCTTTATCGGAG ATGTTCCTATACGATCACGTGGAGAGTCCAAAG CGGTTAGTTGCTTCGCTCGTGGGGTAACATGGG GAGGCAGCTTTCGTCTGGTCGAGATGAAAACAA TAATTTACTTTATGCAAACAATTTCTAACTAAAT TATGATAGACCAATTCCAACCCATTTGCTACGCT GTCACTGCCACGCCGTTGGTAGCTCCATTCT//

2.2 特異性檢測結(jié)果

將菌株TS-3 與另外10 種參試菌株(表1)用巢式PCR 反應(yīng)體系進行擴增，同時用該體系第2 輪PCR 擴增作為常規(guī)PCR 對照，從圖2a 可以看出常規(guī)PCR 特異性差，除TS-3 有條帶之外，還有Fusarium verticillioides、F.acuminatum、Macrophomina phaseolina都擴增出了約330 bp 大小的條帶，而巢式PCR 反應(yīng)體系特異性強(圖2b)，只有菌株TS-3 有328 bp 大小的明亮條帶，其他參試菌株均無條帶。

2.3 靈敏度檢測結(jié)果

將菌株TS-3 所提取的gDNA 濃度稀釋至13.2 ng·μL-1作為模板1，再將其5 倍梯度稀釋后用巢式PCR 反應(yīng)體系和常規(guī)PCR 反應(yīng)體系分別進行擴增，以檢驗和分析其靈敏度。結(jié)果顯示：常規(guī)PCR 反應(yīng)體系在模板濃度為0.105 6 ng·μL-1時只能看到隱約條帶(圖3a)，而巢式PCR 反應(yīng)體系在模板濃度為4.224 pg·μL-1還能檢測出明亮條帶(圖3b)，其明亮程度同常規(guī)PCR 在濃度為13.2 ng·μL-1時相近；根據(jù)模板濃度計算可得，巢式PCR 反應(yīng)體系較常規(guī)PCR 反應(yīng)體系的靈敏度提高了25 倍，從條帶亮度對比來看，巢式反應(yīng)體系的靈敏度較常規(guī)PCR 反應(yīng)體系大有提高。

圖3 常規(guī)PCR 反應(yīng)體系(a)和巢式PCR 體系(b)靈敏度測試對比圖Figure 3 Comparison of sensitivity of conventional PCR reaction system (a) and nested PCR system (b)

2.4 模擬玉米帶菌種子檢測結(jié)果

在15 g 健康玉米種子(約45 粒)中分別接種濃度約為3 × 104個·mL-1的孢子懸浮液200、100、80、60、40、20、10、5、1 μL，即分別攜帶約6 000、3 000、2 400、1 800、1 200、600、300、150、30 個孢子(表4)，結(jié)果顯示：以上接種量的玉米種子均可檢測出明亮的目的條帶，而未接菌的健康種子未檢測出條帶(圖4)，說明當(dāng)15 g 玉米種子(約45 粒)攜帶約30 個孢子時即可被巢式PCR 反應(yīng)體系成功檢測。

圖4 巢式PCR 體系檢測不同接菌量的種子電泳圖Figure 4 Electrophoretic images of seeds with different amounts of inoculation as detected by nested PCR system

表4 健康玉米種子接菌量Table 4 Inoculation amounts in heathy maize seeds

2.5 玉米種子檢測結(jié)果和序列分析

將田間采集的16 份玉米種子用巢式PCR 體系檢測，結(jié)果顯示有2 份呈陽性反應(yīng)(編號X1及W2)，陽性檢出率為12.5%，將這2 種PCR 產(chǎn)物進行測序，測序結(jié)果在GenBank 中進行BLAST 分析，結(jié)果(圖5)顯示2 種PCR 產(chǎn)物測序結(jié)果一致，且該序列與Fusarium graminearum相似度均為100%。測序結(jié)果進一步驗證了檢測引物的特異性和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時也表明本研究從田間樣品中檢出的確實屬于禾谷鐮刀菌的相關(guān)DNA 片段。

圖5 巢式PCR 體系檢測田間種子樣品電泳圖Figure 5 Electrophoretic diagram of field seed samples as detected by nested PCR system

3 討論與結(jié)論

據(jù)報道，劉金華等[19]發(fā)現(xiàn)通過對禾谷鐮刀菌基因組中的特異序列SCARs 片段[31]進行常規(guī)PCR 技術(shù)擴增，可檢測霉變玉米、玉米穗腐病、莖腐病組織中的禾谷鐮刀菌。本研究對該報道中涉及到的引物進行了特異性檢測，但結(jié)果顯示其不僅在禾谷鐮刀菌中可擴增出陽性條帶，在輪枝鐮刀菌(Fusarium verticillioides)、銳頂鐮刀菌(Fusarium acuminatum)和菜豆殼球孢(Macrophomina phaseolina)中也能擴增出片段大小相似的陽性條帶，這還只是本研究中所涉及到的參試菌株，說明該報道中的引物特異性不是很強，且常規(guī)PCR 檢測存在假陽性的結(jié)果，誤檢的可能性較大。想要建立快速、靈敏、高度特異的檢測體系需要更為精準(zhǔn)的技術(shù)，巢式PCR 技術(shù)就是理想的選擇之一，其在病害檢測方面的應(yīng)用近年來有不少報道，如劉曉妹等[32]利用巢式PCR 技術(shù)建立了杧果露水斑病主要致病菌Cladosporium cladosporioides的快速準(zhǔn)確檢測方法，比常規(guī)PCR靈敏度提高了1 萬倍，且能實現(xiàn)對潛伏期果實的特異性檢測；陳杰和朱天輝[33]利用巢式PCR 技術(shù)建立了引起核桃枝枯病的小新殼梭孢Neofusicoccum parvum檢測體系，靈敏度達30 fg·μL-1，為核桃枝枯病的田間檢測提供了新思路。

基于以上報道，本研究針對禾谷鐮刀菌加入了另一對特異性引物，建立了一種快速、靈敏、高度特異的巢式PCR 檢測體系，并將檢測范圍擴大至前期的種子檢測，不僅解決了常規(guī)PCR 中存在的假陽性和誤檢的問題，還提高了檢測的靈敏性；同時，本研究還優(yōu)化了檢測流程，在種子檢測時采用NaOH 裂解法快速提取DNA，進一步縮短了檢測時間，是國內(nèi)首次基于巢式PCR 技術(shù)對玉米莖基腐病病原菌-禾谷鐮刀菌進行種子檢測的報道，為玉米種子帶菌檢測提供了新方法、新思路。

近年來，對禾谷鐮刀菌的其他分子檢測方法也有報道。史亞娟等[34]建立了引起玉米穗腐病的兩種鐮孢菌的雙重PCR 快速檢測體系，DNA 模板的檢測靈敏度為6.25 ng·μL-1，可一次性檢測出禾谷鐮刀菌和擬輪枝鐮孢菌，節(jié)約了檢測時間和成本，但也不可避免因DNA 濃度較低、易受污染、條件控制不好的缺點，從而導(dǎo)致結(jié)果不理想；王芝涵等[35]建立了引起玉米穗腐病的禾谷鐮刀菌LAMP 快速檢測方法，靈敏度可達100 pg·μL-1，該方法操作簡便，檢出效率高，用時短，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，但是容易造成假陽性現(xiàn)象；本研究建立了基于巢式PCR技術(shù)對禾谷鐮刀菌的檢測體系，進一步提高了檢測靈敏度，可檢濃度達4.224 pg·μL-1，相對于其他分子檢測方法更為準(zhǔn)確，也將檢測范圍從發(fā)病組織擴大至玉米種子，在實驗室可實現(xiàn)精準(zhǔn)檢測。