丁飛艷, 鄭茗冉, 吳振, 王立強(qiáng), 侯志勇,3

(1. 華僑大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)學(xué)院, 福建 泉州 362021;2. 廈門大學(xué) 藥學(xué)院, 福建 廈門 361102;3.中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第962醫(yī)院, 黑龍江 哈爾濱 150086)

血清尿酸鹽濃度過高是痛風(fēng)發(fā)生的最重要因素,人的血尿酸飽和閾值是0.408 moL·L-1,臨床診斷的高尿酸血癥(HUA)即血尿酸濃度達(dá)到或超過飽和閾值.當(dāng)血尿酸濃度持續(xù)超過飽和閾值,且沒有及時(shí)治療時(shí),血漿中會析出尿酸鈉晶體,高尿酸血癥會進(jìn)一步導(dǎo)致慢性痛風(fēng)[1].在中藥復(fù)方治療HUA的應(yīng)用中,不僅可以通過辨證下藥給患者提供多元化治療選擇,而且配伍加減可以在很大程度上增強(qiáng)治療效果,減少可能存在的副作用[2-3].柏苓湯劑是國內(nèi)醫(yī)院院內(nèi)制劑,全方由黃柏、蒼術(shù)、土茯苓、薏苡仁、雞血藤、忍冬藤、甘草與牛膝組成,黃柏、蒼術(shù)清濕熱、除實(shí)火為君藥,薏苡仁、土茯苓祛濕除痹為臣藥,忍冬藤、雞血藤祛風(fēng)通絡(luò)、清熱活血為佐藥,甘草、牛膝補(bǔ)益肝腎為使藥.全方共奏祛風(fēng)除濕、退痹通絡(luò)之效,是治療HUA與急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的復(fù)方制劑.為改善柏苓湯劑的應(yīng)用性,本文對柏苓顆粒的降尿酸效果及其初步作用機(jī)制進(jìn)行研究.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

柏苓顆粒(實(shí)驗(yàn)室自制);氧嗪酸鉀(上海市穎心實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn));非布司他(浙江省杭州市朱養(yǎng)心藥業(yè)有限公司);黃嘌呤氧化酶(XOD)試劑盒、腺苷脫氨酶(ADA)檢測試劑盒、尿酸(SUA)試劑盒、肌酐(Cr)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒(江蘇省南京市建成科技有限公司);羧甲基纖維素鈉(安徽省淮南市山河藥輔有限公司);乙醚(上海市國藥集團(tuán));質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的水合氯醛、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)試劑盒、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(OAT1)抗體、尿酸陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體1(URAT1)抗體(廣東省深圳市華諾生物科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)試劑盒、放射免疫沉淀(RIPA)裂解液(強(qiáng))、5×蛋白上樣緩沖液、增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ELC)試劑盒(河南省鄭州市普利萊生物科技有限公司);快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、脫脂奶粉、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(北京市莊盟國際生物基因科技有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

TGL-16型臺式高速冷凍離心機(jī)(上海市亞速旺公司);InfiniteM 200型多功能酶標(biāo)儀(瑞士帝肯公司);DYY-74型電泳儀(北京市六一儀器廠);LC-SFJ-10型手持式高速勻漿機(jī)(上海市力辰邦西儀器科技有限公司);凝膠成像儀(北京市大龍儀器有限公司).

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠質(zhì)量為(200±20) g(福建省福州市吳氏實(shí)驗(yàn)動物貿(mào)易有限公司),許可證號為SCXK(京)2019-0008.

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 溶液的配制

柏苓顆粒的人用劑量為70.00 g·d-1,大鼠臨床等效劑量為6.30 g·kg-1(根據(jù)體表面積等效劑量折算表[4]),柏苓顆粒高、中和低劑量組劑量分別按大鼠臨床等效劑量的4,2和1倍進(jìn)行設(shè)置,分別為25.20,12.60,6.30 g·kg-1.氧嗪酸鉀與非布司他不溶于水,均使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%(稱取6.00 g羧甲基纖維素鈉,加熱攪拌溶解于500 mL蒸餾水)的羧甲基纖維素鈉溶液制成混懸液給藥.稱取3.00 g氧嗪酸鉀,溶于100 mL的羧甲基纖維素鈉溶液,制得氧嗪酸鉀混懸液,以0.30 g·kg-1劑量給藥.將非布司他研碎成細(xì)粉末,稱取0.18 g非布司他粉末.溶于500 mL的羧甲基纖維素鈉溶液,制得非布司他混懸液,以0.003 6 g·kg-1劑量給藥.所有藥物均當(dāng)天現(xiàn)配.

2.2 分組與造模給藥

將42只雄性大鼠隨機(jī)分為7組,分別為空白組、模型組、陽性對照組(非布司他組)、柏苓湯劑組、柏苓顆粒高、中、低劑量組.大鼠HUA模型建立如下：給空白組大鼠灌胃蒸餾水,其余各組大鼠灌胃氧嗪酸鉀混懸液,每天給藥1次,連續(xù)造模10 d;最后一次灌胃1 h后,使用乙醚麻醉,對眼眶進(jìn)行采血并檢測SUA濃度;統(tǒng)計(jì)分析后,確定造模成功,即所有模型組大鼠的SUA濃度與空白組大鼠的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),停止造模并開始給藥;給空白組和模型組大鼠灌胃蒸餾水,給其余實(shí)驗(yàn)組大鼠灌胃相應(yīng)劑量的藥物,每天給藥1次,連續(xù)14 d.

2.3 狀況的觀察

從實(shí)驗(yàn)造模開始,在第1,10,17,24天稱取大鼠的體質(zhì)量,同時(shí)觀察大鼠的活動、行為狀態(tài),飲食飲水量及尿液糞便排泄情況.

2.4 血清尿酸濃度的測定

造模第10 d,給大鼠灌胃氧嗪酸鉀1 h后,使用乙醚麻醉,采用0.05 mm毛細(xì)管取1 mL的眼眶血,常溫條件下靜置2 h,析出血清,于3 500 r·min-1低速離心10 min(4 ℃),分離得到血清,參照SUA試劑盒說明,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,平行測定3次血清給藥前SUA濃度并取平均值.

末次分組灌胃給藥后,各組大鼠禁食不禁水過夜,按大鼠體質(zhì)量每100 g腹腔注射水合氯醛1 mL進(jìn)行麻醉,心臟取血后,靜置2 h,于3 500 r·min-1低速離心10 min(4 ℃),分離得到血清,參照SUA試劑盒說明,將每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,平行測定3次血清給藥后SUA濃度并取平均值.

2.5 血清ADA和XOD活性的測定

參照ADA和XOD試劑盒說明,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,平行測定3次血清ADA和XOD活性并取平均值.

2.6 肝臟ADA,XOD與HGPRT活性的測定

將肝組織用磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液)洗去表面血漬,將肝組織與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%生理鹽水按質(zhì)量體積比為1∶9的比例進(jìn)行混合,在冰上充分勻漿,于3 500 r·min-1分離兩次,每次5 min.取上清液,參照XOD,ADA與HGPRT試劑盒說明,分別測定肝組織上清液OD值,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,平行測定3次肝臟給藥后XOD,ADA與HGPRT活性并取平均值.

2.7 血清Cr和BUN濃度的測定

參照肌酐(Cr)與尿素氮(BUN)試劑盒說明,每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,分別平行測定3次血清Cr和BUN濃度并取平均值.

2.8 腎臟OAT1和URAT1蛋白相對表達(dá)水平的測定

將腎組織與裂解液按質(zhì)量體積比為1∶10的比例混合,于冰上裂解,再使用勻漿機(jī)進(jìn)行間隔10 s勻漿3～5 s的處理,充分裂解30 min,置于3 500 r·min-1(4 ℃)條件下離心兩次,每次5 min,取上清液勻漿蛋白,總蛋白質(zhì)量濃度使用BCA試劑盒測定.將各樣品與蛋白上樣緩沖液按質(zhì)量體積比為4∶1的比例混勻,煮沸10 min,變性后,放于4 ℃保存.按照凝膠制備試劑盒的使用說明制膠,并以120 μg蛋白上樣量進(jìn)行蛋白凝膠電泳,并采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜.使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉室溫封閉膜1 h,加入一抗,于4 ℃下孵育過夜;再次洗膜后,加入HRP標(biāo)記的二抗充分覆蓋膜表面,室溫孵育1 h;最后,使用 ECL進(jìn)行發(fā)光顯影,用ImageJ軟件分析各目標(biāo)條帶的灰度值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用β-actin作為內(nèi)參蛋白,觀察并計(jì)算各組OAT1和URAT1蛋白相對表達(dá)水平.

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 大鼠狀況

實(shí)驗(yàn)過程中,各組大鼠行為活潑,反應(yīng)迅速,精神良好,毛發(fā)光潔干燥,進(jìn)食、飲水量保持正常.造模期間,所有大鼠糞便軟硬程度適中,除空白組外,灌胃氧嗪酸鉀的大鼠尿液偏黃,尿液增多.在給藥期間,所有大鼠糞便軟硬程度適中,除模型組大鼠尿液偏黃外,其他組大鼠尿液顏色正常.實(shí)驗(yàn)期間,所有大鼠體質(zhì)量有所增長.大鼠體質(zhì)量的變化情況,如圖1所示.圖1中：m為大鼠質(zhì)量;t為天數(shù);高、中、低劑量組分別為柏苓顆粒高、中、低劑量組.由圖1可知：在同一時(shí)間內(nèi),與空白組相比的模型組、非布司他組、柏苓湯劑組及柏苓顆粒高、中、低劑量組大鼠體質(zhì)量差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),說明各實(shí)驗(yàn)組用藥對大鼠的生存狀況沒有明顯影響.

圖1 大鼠體質(zhì)量的變化情況Fig.1 Changes in body mass of rats

3.2 柏苓顆粒對給藥前后血清尿酸濃度的影響

各組大鼠給藥前、后血清SUA濃度,如表1所示.表1中：n為大鼠數(shù)量;c0(SUA)為給藥前SUA濃度;c1(SUA)為給藥后SUA濃度.

表1 各組大鼠的給藥前、后血清SUA濃度Tab.1 Concentration of SUA in serum of each group of rats before and after administration

由表1可知：經(jīng)氧嗪酸鉀灌胃造模的其他組大鼠血清尿酸極顯著高于空白組大鼠,說明HUA模型建立成功;模型組大鼠血清SUA濃度極顯著高于空白組大鼠,說明結(jié)果有意義,具有參考價(jià)值;非布司他組大鼠及柏苓顆粒高、中劑量組大鼠的給藥后SUA濃度極顯著低于模型大鼠,柏苓湯劑組大鼠與柏苓顆粒低劑量組大鼠的給藥后SUA濃度顯著低于模型組大鼠,柏苓顆粒劑組大鼠的給藥后SUA濃度呈劑量性降低趨勢,說明柏苓顆粒與柏苓湯劑都具有顯著的降尿酸效果,且高、中劑量柏苓顆粒的降尿酸效果比柏苓湯劑更顯著,與非布司他相當(dāng).

3.3 柏苓顆粒對血清XOD和ADA活性的影響

各組大鼠的給藥后血清XOD與ADA活性,如表2所示.表2中：zs(XOD)/nkat·L-1為給藥后血清XOD活性;zs(ADA)/nkat·L-1為給藥后血清ADA活性.

表2 各組大鼠的給藥后血清XOD與ADA活性Tab.2 Activity of XOD and ADA in serum of each group of rats after administration

由表2可知：模型組大鼠的血清XOD和ADA活性極顯著高于空白組大鼠,非布司他組大鼠的血清XOD活性的影響對比模型組大鼠極顯著下降,而對血清ADA無明顯影響;柏苓湯劑組、柏苓顆粒高、中劑量組大鼠的血清XOD,ADA活性對比模型組大鼠極顯著下降,柏苓顆粒低劑量組大鼠的血清XOD,ADA活性顯著下降,說明柏苓顆粒能顯著抑制血清XOD和ADA活性.

3.4 柏苓顆粒對肝臟XOD,ADA和HGPRT活性的影響

各組大鼠的給藥后肝臟XOD, ADA與HGPRT活性,如表3所示.表3中：zl(XOD)為給藥后肝臟XOD活性;zl(ADA)給藥后肝臟ADA活性;zl(HGPRT)為給藥后肝臟HGPRT活性.

表3 各組大鼠的給藥后肝臟XOD, ADA與HGPRT活性Tab.3 Liver XOD, ADA, and HGPRT activity in each group of rats after administration

由表3可知：模型組大鼠的肝臟XOD和ADA活性極顯著高于空白組大鼠,其中,非布司他組、柏苓顆粒高、中劑量組大鼠的肝臟XOD活性對比模型組大鼠極顯著下降,柏苓顆粒低劑量組大鼠的肝臟XOD活性顯著下降;除非布司他組大鼠外,其他給藥組大鼠的肝臟ADA活性均極顯著低于模型組大鼠;模型組大鼠的肝臟HGPRT活性較空白組大鼠有下降趨勢,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,柏苓顆粒組大鼠的肝臟HGPRT活性有呈劑量上升趨勢,但與模型組大鼠相比,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明柏苓顆粒能顯著降低XOD與ADA活性,對HGPRT活性無明顯影響.因此,柏苓顆粒對嘌呤代謝酶具有選擇性,而XOD與ADA是其主要作用靶點(diǎn),降尿酸作用也與XOD,ADA作用靶點(diǎn)有一定相關(guān)性.

3.5 柏苓顆粒對BUN和Cr濃度的影響

BUN和Cr是評估腎功能的兩個(gè)指標(biāo),能反映腎小球的濾過率,當(dāng)腎小球?yàn)V過功能損壞,腎功能降低時(shí),血清BUN和Cr濃度會異常升高.各組大鼠的血清BUN和Cr濃度,如圖2所示.圖2中：c(BUN)為BUN濃度;c(Cr)為Cr濃度.由圖2可知：各組大鼠的血清BUN和Cr的濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明氧嗪酸鉀造模方法不會損害大鼠腎臟,以及柏苓顆粒與柏苓湯劑對HUA 大鼠無腎損傷,安全性良好.

(a) BUN (b) Cr圖2 各組大鼠的血清BUN和Cr濃度Fig.2 Concentrations of BUN and Cr in serum of each group of rats

3.6 柏苓顆粒對OAT1 和URAT1蛋白相對表達(dá)水平的影響

OAT1和URAT1蛋白免疫印跡條帶圖,如圖3所示.各組大鼠的腎臟OAT1與URAT1蛋白相對表達(dá)水平,如圖4所示.由圖4可知：高劑量柏苓顆粒與非布司他、柏苓湯劑對比模型組能極顯著上調(diào)腎臟OAT1蛋白相對表達(dá)水平,中劑量柏苓顆粒能顯著上調(diào)OAT1蛋白相對表達(dá)水平,低劑量柏苓顆粒對OAT1蛋白相對表達(dá)水平的影響不顯著;對比模型組,高、中劑量柏苓顆粒與柏苓湯劑均有極顯著抑制效果,非布司他與低劑量柏苓顆粒對URAT1相對表達(dá)水平均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.因此,高劑量柏苓顆粒對OAT1和URAT1蛋白相對表達(dá)水平的影響與柏苓湯劑相當(dāng),其促進(jìn)尿酸排泄機(jī)制可能與促進(jìn)尿酸的分泌與重吸收的OAT1及URAT1蛋白有關(guān).

圖3 OAT1和URAT1蛋白免疫印跡條帶圖Fig.3 Western blot band diagram of OAT1 and URAT1 proteins

(a) OAT1 (b) URAT1圖4 各組大鼠的腎臟OAT1與URAT1蛋白相對表達(dá)水平Fig.4 Relative expression levels of proteins of OAT1 and URAT1 in kidneys of each group of rats

4 結(jié)論

氧嗪酸鉀作為尿酸酶的競爭性抑制劑,它能結(jié)合大鼠體內(nèi)的尿酸酶并顯著降低尿酸酶活性,從而阻礙尿酸分解.采用灌胃氧嗪酸鉀持續(xù)10 d,建立HUA模型,效果顯著.但由于后續(xù)14 d的給藥期間停止造模,除空白組外其他組大鼠血尿酸都有所下降,說明結(jié)果有意義,具有參考價(jià)值.

肝臟是嘌呤合成及回收的主要部位,嘌呤堿基在肝臟中可直接合成產(chǎn)生尿酸的原料(嘌呤核苷酸).催化嘌呤分解代謝的酶主要分為抑制尿酸合成酶與促進(jìn)尿酸合成酶兩類,HGPRT是肝臟中一種抑制尿酸的生成的主要代謝酶,能促進(jìn)鳥嘌呤與次黃嘌呤回收,防止嘌呤堿潴留[5].HGPRT參與嘌呤回收過程并控制尿酸的合成,HGPRT質(zhì)量分?jǐn)?shù)升高,可增加嘌呤堿回收量,進(jìn)而減少尿酸合成的機(jī)會,相反地,HGPRT質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少,嘌呤堿回收減少,尿酸合成的原料增多,血尿酸水平亦隨之升高.ADA和XOD是嘌呤代謝過程中促尿酸合成的關(guān)鍵酶,分別限制著腺嘌呤與黃嘌呤形成尿酸的速率,其活性越高,尿酸合成水平隨之升高.HGPRT,ADA與XOD的活性相對反應(yīng)了鳥嘌呤、腺嘌呤與次黃嘌呤代謝生成尿酸的情況.柏苓顆粒對肝臟HGPRT濃度無顯著影響,而抑制了ADA這一合成尿酸前產(chǎn)物次黃嘌呤核苷的關(guān)鍵酶活性,以及抑制了生成尿酸的XOD的活性,說明柏苓顆粒降尿酸的靶點(diǎn)可能與抑制XOD與ADA活性有關(guān),而與HGPRT無關(guān).

除了抑制尿酸生成的關(guān)鍵酶外,增加尿酸的排泄量是另一降尿酸的途徑.大部分尿酸鹽的排泄需經(jīng)過腎小管上皮的尿酸重吸收與排泄轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[6].OAT1蛋白是腎臟中一個(gè)與尿酸分泌密切相關(guān)的蛋白[7],其相對表達(dá)水平增加可促使體內(nèi)尿酸排出體外,而達(dá)到降低尿酸的作用.URAT1蛋白位于腎臟近曲小管,是介導(dǎo)大部分尿酸重吸收的蛋白,也是目前研究較為廣泛的尿酸排泄蛋白[8].實(shí)驗(yàn)主要研究了柏苓顆粒對大鼠腎臟中控制尿酸鹽重吸收及排泄的URAT1與OAT1蛋白的影響.在中醫(yī)的理論中,濕熱是痛風(fēng)發(fā)作的致病因素,而清利濕熱的方劑是用藥首選,其中,利水祛濕的中藥能顯著增加尿酸排泄的效果[2],柏苓顆粒中的土茯苓、薏苡仁都有利水滲濕的功效,能促進(jìn)尿酸經(jīng)腎臟排泄,且對腎臟有一定保護(hù)作用[9-12].因此,柏苓顆粒降尿酸效果良好,無明顯毒副作用,其作用機(jī)制與抑制ADA與XOD的活性及減少URAT1蛋白相對表達(dá)水平、增加OAT1蛋白相對表達(dá)水平相關(guān).