陶貝貝,吳寧寧,王海波

信陽師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,信陽市功能納米材料生物分析重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 信陽 464000

引 言

蘆丁是一類重要的黃酮類化合物,在蕎麥植物中廣泛存在,具有抗腫瘤、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗糖尿病、抗脂肪、降血壓、稀釋血液等多種生理功能[1-2]。蘆丁可能存在于多種草藥復(fù)方制劑中,是臨床應(yīng)用的治療劑原料藥。蘆丁具有多種生理和藥理作用,近年來受到人們的廣泛關(guān)注。因此開發(fā)簡(jiǎn)便、靈敏、高效的蘆丁檢測(cè)方法仍然是一項(xiàng)具有重要意義的工作。

目前,傳統(tǒng)的分析方法,包括液相色譜法、分光光度法、毛細(xì)管電泳法、化學(xué)發(fā)光分析法、電化學(xué)方法等[3-7],已經(jīng)用于蘆丁的定量檢測(cè)。傳統(tǒng)方法大都需要昂貴的儀器,復(fù)雜而費(fèi)時(shí)的操作。這些缺陷可能會(huì)限制這些方法的實(shí)際應(yīng)用。相比而言,熒光分析方法具有靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、成本低、易于實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)。

在熒光分析方法中,熒光信號(hào)單元主要包含有機(jī)熒光分子或發(fā)光納米材料?？紤]到對(duì)化學(xué)發(fā)光效率的要求,發(fā)光納米材料如量子點(diǎn)和貴族金屬納米團(tuán)簇受到了廣泛關(guān)注。由于重金屬離子(如鉛、鎘)的存在,量子點(diǎn)材料的使用可能對(duì)生物系統(tǒng)有潛在毒性[8]。而金屬納米團(tuán)簇具有類似分子的特性,優(yōu)良的光學(xué)穩(wěn)定性,較大的斯托克斯位移。與量子點(diǎn)相比,金屬納米團(tuán)簇具有較低的環(huán)境毒性,在各種化學(xué)物質(zhì)的敏感識(shí)別等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9-12]。開發(fā)生物相容性好、經(jīng)濟(jì)實(shí)用的金屬納米團(tuán)簇材料具有重要意義。與金納米簇、銀納米簇相比,銅納米簇的原料價(jià)格相對(duì)低廉,已經(jīng)用于化學(xué)、生物傳感等領(lǐng)域的研究。例如,許多研究報(bào)道了銅納米團(tuán)簇的多種合成策略,使用了不同的分子模板,如蛋白質(zhì)[13],聚乙烯亞胺[14]和谷胱甘肽[15]。然而,由于暴露在空氣中銅的表面快速氧化而產(chǎn)生不穩(wěn)定或聚集的顆粒,其光學(xué)穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。因此開發(fā)高穩(wěn)定性的發(fā)光銅納米團(tuán)簇仍然具有挑戰(zhàn)性。

內(nèi)濾效應(yīng)屬于熒光光譜的非輻射能量轉(zhuǎn)換,是檢測(cè)系統(tǒng)中的吸收器吸收了激發(fā)和/或發(fā)射光[16]。利用分析吸收信號(hào)轉(zhuǎn)化為熒光信號(hào),基于內(nèi)濾效應(yīng)的傳感策略能夠提高檢測(cè)的靈敏度和選擇性[17]。此外,基于內(nèi)濾效應(yīng)的傳感方法不涉及納米材料表面的復(fù)雜修飾,不需要在受體和熒光基團(tuán)之間形成任何共價(jià)鍵,在傳感方法的設(shè)計(jì)中更加簡(jiǎn)便和靈活。

采用谷胱甘肽穩(wěn)定的銅納米簇作為熒光探針,構(gòu)建了一種非標(biāo)記型的熒光傳感新方法,實(shí)現(xiàn)了蘆丁的高靈敏和高選擇性檢測(cè)。其設(shè)計(jì)原理如如圖1所示。本研究以谷胱甘肽作為穩(wěn)定劑,抗壞血酸作為還原劑,采用簡(jiǎn)便的一步綠色法合成了GSH-CuNCs。在365 nm的激發(fā)波長(zhǎng)下,GSH-CuNCs在420 nm處發(fā)射較強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)目標(biāo)物蘆丁存在時(shí),GSH-CuNCs的熒光信號(hào)被顯著猝滅。這可能是由于蘆丁的吸收光譜與GSH-CuNCs的熒光激發(fā)光譜有較大的重疊,引發(fā)內(nèi)濾效應(yīng)所致。通過GSH-CuNCs熒光強(qiáng)度的變化,該方法實(shí)現(xiàn)了蘆丁的高靈敏和高選擇性檢測(cè)。

圖1 基于GSH-CuNCs介導(dǎo)的內(nèi)濾效應(yīng)熒光檢測(cè)Rutin示意圖Fig.1 Schematic illustration of GSH-CuNCs mediated inter filter effect for rutin detection

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

谷胱甘肽,抗壞血酸,購自生工生物工程(上海)股份有限公司。CuSO4·5H2O,蘆丁購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。實(shí)驗(yàn)所用水均為去離子水。

F-7000熒光光譜儀(Hitachi,日本)熒光激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為365 nm,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均設(shè)置為5 nm;UH4150紫外可見近紅外分光光度計(jì)(Hitachi,日本),掃描范圍設(shè)置為200～600 nm。樣品池為石英比色皿,光程長(zhǎng)為10 mm。

1.2 GSH-CuNCs的合成

通過對(duì)文獻(xiàn)[18]的合成方法,合成了谷胱甘肽穩(wěn)定的銅納米簇。首先,125 μL CuSO4溶液(50 mmol·L-1)與40 mL谷胱甘肽溶液(0.21 mmol·L-1)在攪拌下混合5 min,混合溶液逐漸混濁。然后將900 μL抗壞血酸(100 mmol·L-1)注入到上述溶液中,在65 ℃水浴中攪拌4 h。反應(yīng)結(jié)束后,混濁液變?yōu)榍宄?。最?將溶液冷卻至室溫,并在16 000 r·min-1離心10 min,上清液即為制得的GSH-CuNCs。純化后的GSH-CuNCs儲(chǔ)存在4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蘆丁的檢測(cè)

在100 μL反應(yīng)體系中,將10 μL不同濃度的蘆丁溶液,20 μL 20 mmol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.5),10 μL制備好的GSH-CuNCs溶液和60 μL去離子水混勻,室溫下反應(yīng)10 min后對(duì)其進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 GSH-CuNCs的光譜表征及實(shí)驗(yàn)的可行性分析

圖2(a)中曲線a和b分別為GSH-CuNCs熒光激發(fā)和熒光發(fā)射光譜圖,其最大激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)在420 nm處。圖2(b)是水介質(zhì)中GSH-CuNCs的典型紫外-可見吸收光譜。如圖2(b)所示,GSH-CuNCs在紫外光區(qū)域有強(qiáng)烈的吸收,但在可見光區(qū)域沒有明顯的吸收,表明合成的GSH-CuNCs具有類似分子的性質(zhì),并且不存在較大的銅納米顆粒。圖2(c)中曲線a和曲線b分別是不存在和存在蘆丁時(shí)銅納米簇的熒光發(fā)射光譜?？梢钥闯霎?dāng)蘆丁存在時(shí),銅簇的熒光被顯著猝滅。以上結(jié)果證實(shí)了采用GSH-CuNCs作為探針用來檢測(cè)蘆丁是可行的。

圖2 (a) GSH-CuNCs的熒光激發(fā)光譜(a)和發(fā)射光譜圖(b);(b) GSH-CuNCs的紫外-可見吸收光譜圖;(c) GSH-CuNCs不存在(a)和存在(b)蘆丁時(shí)的熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 (a) Fluorescence excitation (a) and emission (b) spectra of GSH-CuNCs;(b) UV-Vis absorption spectra of GSH-CuNCs;(c) Fluorescence emission spectra of GSH-CuNCs in the absence (a) and presence (b) of Rutin

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

圖3(a)為緩沖溶液的pH值對(duì)蘆丁猝滅效果檢測(cè)的影響,在pH 7.5時(shí)猝滅效果較為明顯。圖3(b)為孵育時(shí)間對(duì)猝滅效果的影響,當(dāng)孵育時(shí)間為10 min時(shí),GSH-CuNCs的熒光最大程度的被猝滅,且10 min后猝滅效果沒有明顯變化。因此,選擇pH 7.5,孵育時(shí)間為10 min用于蘆丁的檢測(cè)。

圖3 (a) 在不同pH值條件下,GSH-CuNCs不存在(a)和存在(b)Rutin時(shí)的熒光強(qiáng)度;(b) 在不同孵育時(shí)間下,GSH-CuNCs不存在(a)和存在(b)Rutin時(shí)的熒光強(qiáng)度Fig.3 (a) Fluorescence intensity of GSH-CuNCs without (a) and with (b) Rutin under different pH values;(b) Fluorescence intensity of GSH-CuNCs in absence (a) and presence (b) of Rutin under different incubation time

2.3 Rutin的檢測(cè)

在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下,在傳感系統(tǒng)中加入不同濃度的Rutin溶液并測(cè)定其熒光發(fā)射光譜。由圖4(a)可知,GSH-CuNCs的熒光強(qiáng)度隨Rutin濃度的增加而降低。在圖4(b)中,當(dāng)蘆丁濃度達(dá)到250 nmol·L-1,對(duì)GSH-CuNCs的猝滅效率為81%[圖4(b)],且蘆丁濃度高于250 nmol·L-1時(shí),猝滅效率基本不變。圖4(c)表明,F0/F和蘆丁在1.00～200 nmol·L-1濃度之間有良好的線性關(guān)系,R2=0.990 5,檢出限為0.300 nmol·L-1(S/N=3)。F0和F分別為不加入和加入蘆丁時(shí)GSH-CuNCs的熒光強(qiáng)度。與已報(bào)道的方法相比,該方法測(cè)定蘆丁具有更高的靈敏度(如表1所示)。

表1 基于各種熒光納米材料檢測(cè)蘆丁方法的比較Table 1 Comparison of various fluorescent nanomaterials based methods for Rutin detection

圖4 (a) 存在不同濃度(0～400 nmol·L-1) Rutin時(shí)GSH-CuNCs熒光發(fā)射光譜;(b) 熒光強(qiáng)度(F0-F)與蘆丁濃度(0～800 nmol·L-1)之間的關(guān)系;(c) 線性關(guān)系圖;(d) 選擇性考察,蘆丁和他干擾分析物的濃度均為250 nmol·L-1Fig.4 (a) Fluorescence emission spectra of GSH-CuNCs with different concentrations (0～400 nmol·L-1) of Rutin;(b) Fluorescence emission intensity F0-F versus the Rutin concentrations from 0 to 800 nmol·L-1;(c) Linear plot of F0/F versus the Rutin concentrations;(d) The selectivity of GSH-CuNCs for of Rutin analytes. The concentrationos of Rutin and other interfering analytes are both 250 nmol·L-1

為了研究該方法對(duì)Rutin的選擇性,在同一實(shí)驗(yàn)體系下,將相同濃度的其他干擾物質(zhì)引入到熒光探針中進(jìn)行熒光強(qiáng)度的測(cè)量。如圖4(d)所示,GSH-CuNCs 只對(duì)蘆丁有明顯的熒光響應(yīng)。表明該方法對(duì)Rutin檢測(cè)具有良好的選擇性。

2.4 實(shí)際樣品中蘆丁含量的分析

以蕎麥茶樣品為研究對(duì)象,采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對(duì)建立的檢測(cè)策略進(jìn)行實(shí)用性評(píng)價(jià),實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。檢測(cè)回收率在98.7%～102.1%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在3.3%～4.2%之間,表明該方法能夠用于實(shí)際樣品中蘆丁含量的測(cè)定。

表2 蕎麥茶樣品中蘆丁含量的測(cè)定Table 2 Detection of rutin content in buckwheat tea samples

2.5 Rutin猝滅GSH-CuNCs熒光的機(jī)理研究

圖5(曲線c)為Rutin的紫外吸收光譜,在352 nm處有最大吸收峰,其紫外吸收光譜與GSH-CuNCs的激發(fā)光譜(曲線a)有很大程度的重疊,與(曲線c)基本無關(guān),證實(shí)了蘆丁猝滅GSH-CuNCs的熒光可能是由于發(fā)生內(nèi)濾效應(yīng)(IFE)所致。

圖5 GSH-CuNCs熒光激發(fā)光譜(a)和發(fā)射光譜(b),及蘆丁的紫外可見吸收光譜(c)Fig.5 Fluorescence excitation (a) and emission (b) spectra of GSH-CuNCs and UV-Vis absorption (c) spectrum of Rutin

3 結(jié) 論

以GSH-CuNCs為熒光探針,建立了一種簡(jiǎn)便、可靠的熒光傳感新方法,實(shí)現(xiàn)了蘆丁含量的靈敏檢測(cè)。該熒光分析方法主要依賴于GSH-CuNCs與Rutin之間內(nèi)濾效應(yīng)引起的熒光猝滅。該方法操作簡(jiǎn)單,樣品消耗少,無需修飾。更重要的是,與傳統(tǒng)的分析方法相比,該方法具有更高的靈敏度。這一策略為檢測(cè)蘆丁開辟了新的途徑,在生物樣品分析中有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。