程 紅,嚴定策*,武利慶,徐 俊

1. 華中科技大學分析測試中心,湖北 武漢 430074 2. 中國計量科學研究院前沿計量科學中心,北京 100029 3. 華中科技大學能源與動力工程學院,湖北 武漢 430074

引 言

在自然界中,手性是生物分子如蛋白質、氨基酸、碳水化合物、核酸等本身固有的屬性[1-2]。圓二色(circular dichroism,CD)光譜作為一項用于研究手性分子的光譜技術,在這些物質的研究中被廣泛應用,其中以蛋白質尤為突出。通過CD光譜學對蛋白質進行分析,可以鑒定和評估其二級結構[3-4],檢測細微或顯著的構象變化,研究蛋白質動態(tài)變化和/或配體結合效應等[5-6],以獲得關于所研究蛋白質的快速和全局結構信息,因此CD光譜學被世界各地的研究人員用作結晶學、核磁共振和分子動力學的補充技術[7]。

在CD光譜中,遠紫外區(qū)域(通常為180～260 nm)的光譜可以給出蛋白質二級結構含量的總體指示,因為該區(qū)域的主要生色團是分子的肽主鏈。在蛋白質的規(guī)則二級結構中,肽鍵是高度有規(guī)律排列的,排列的方向性決定了肽鍵能級躍遷的分裂情況[8]。對遠紫外CD光譜進行解卷積,可以提供二級結構組成的定量估計,但普通生物制藥緩沖液和賦形劑可能會產生干擾,糖基化、聚糖綴合、其他翻譯后變化或異常氨基酸組成也會影響[9]。用CD方法獲得的結構信息有時會受到原始CD數據質量的影響。正如Miles和Wallace所述,在任意兩臺儀器中進行的CD測量,即使在可比較的條件下,相同樣品的光譜幅度(elipticity橢圓度,CD scale,也稱圓二色值)或波長也可能存在細微差異。光源、最終的光度輸出和各個儀器之間入射光偏振的微小差異是導致圓二色值或波長產生差異的可能原因。為了避免這些差異導致數據的不可比性,在采集CD數據之前,必須對CD儀器進行校準,包括圓二色值和波長,因為CD解卷積分析強烈依賴于圓二色值。

最近,人們認識到蛋白質的高階結構要得到更好的表征,必須重視這些數據的客觀比較[10-11]。要輸出統計上有效的數據,就需要清楚地了解光譜不確定性的來源、如何糾正它們以及其對結果有效性的影響。Maurice等[12]采用一次國際比對的數據利用摩爾橢圓度討論了蛋白質的圓二色光譜譜圖的不確定度;Jones[13]比較了一個公共數據庫(protein circular dichroism data bank,PCDDB)中108個d-10-樟腦磺酸的校準數據,對這些光譜位于290和190 nm附近的峰進行了統計評估,發(fā)現儀器之間峰波長的平均值差異顯著;Victor等[14]采用蒙特卡羅模型(Monte Carlo-like model)評估了使用CDSSTR、Selcon 3和ContinLL算法對肌紅蛋白的理論CD譜進行二級結構預測的不確定度。本工作以一種α-螺旋為主導的蛋白質—細胞色素C為實驗對象,考察了圓二色光譜測定蛋白質實際測試過程中圓二色值θ的不確定度。圓二色光譜是為一段波長下橢圓度θ的測量值,通常θ的單位用mdeg表示。一般情況下,θ值和CD吸光度的差值(ΔA)不在實驗室之間或實驗室內進行比較[12],但是本實驗中考慮所用比色皿的光程長度、儀器的校準狀態(tài)和溶液的濃度,期望通過特定蛋白質在特定濃度下的θ值不確定度的評估,找出影響測量結果的主要因素,可以設法消除或降低這些因素的影響,改進測量方法,提高CD數據的可比性和可靠性,為進一步進行實驗室間比對提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器設備

日本Jasco公司J-810型圓二色光譜儀;波蘭RADWAG公司AS 60/220 R2型分析天平(經湖北省計量測試技術研究院檢定合格,在檢定合格有效期內使用);法國Millipore公司Milli-QAcademic型純水機(經湖北省計量測試技術研究院檢定合格,在檢定合格有效期內使用);德國Eppendorf公司Researchplus單道可調式移液器,20～200 μL,100～1 000 μL(經湖北省計量測試技術研究院檢定合格,在檢定合格有效期內使用);光程長為10 mm的石英比色皿1支、光程長為1 mm的石英比色皿3支 (Starna Scientific Ltd. Hainault,Essex IG6 3UT,UK);10 mL容量瓶一支(經湖北省計量測試技術研究院檢定合格,在檢定合格有效期內使用)。

1.2 樣品

d-10-樟腦磺酸銨(ACS,購自日本Jasco公司,部件號:0730-0358,純度99%);細胞色素C(5 mg,棕色玻璃瓶裝,購自中國國家標準物質資源共享平臺,中國計量科學研究院研制二級標準物質,GBW(E)100153。在樣品有效期內使用。)實驗用水為超純水(電阻率為18 MΩ·cm)。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

精確稱取樟腦磺酸銨樣品6.77 mg,使用移液器精密加入1.13 mL超純水,完全溶解后,使用移液器精密移取1 mL,置10 mL容量瓶,使用超純水定容至刻度線,濃度為0.6 mg·mL-1。

在細胞色素C樣品瓶中精密加入超純水1 mL,完全溶解后精密移取100 μL至離心管,再精密加入900 μL超純水稀釋,搖勻,精密移取該溶液400 μL至離心管,再精密加入3 600 μL超純水,搖勻,濃度為0.05 mg·mL-1,平行配制兩次。

將所有樣品溶液放置在冰箱(4 ℃)中。在進行CD測量之前,讓溶液在此溫度下平衡至少一整夜。

1.3.2 儀器校準

從冰箱中取出樟腦磺酸銨樣品溶液,在室溫[(23±2)℃]下平衡1 h,并在進行CD測量之前將樣品裝入光程長為10 mm的石英比色皿內,根據如下參數測量樣品的CD光譜:

掃描范圍:200～400 nm

累積次數:1次

響應時間:1 s

帶寬:1 nm

靈敏度:Standard(100 mdeg)

步長:1 nm

掃描速度:50 nm·min-1

根據樟腦磺酸銨溶液的出峰情況調整儀器,使291 nm附近譜峰的圓二色值為(190.4±1) mdeg。記錄6個重復光譜。

1.3.3 樣品溶液的測試

在完成儀器校準當天,將細胞色素C樣品溶液從冰箱中取出,在室溫[(23±2)℃]下平衡1小時。在進行CD測量之前,先測試溶劑空白-超純水在光程長為1 mm的石英比色皿的圓二色光譜圖,然后將樣品裝入同一個比色皿內進行CD測量,測試中保持樣品測試與空白測試時比色皿的方向一致。根據如下參數測量樣品的遠紫外CD光譜。記錄樣品的6個重復光譜(連續(xù)測定,重復測量不重新裝樣)。2個平行溶液分別使用3支比色皿測試,共測試36次。

掃描范圍:190～260 nm

累積次數:6次

響應時間:1 s

帶寬:1 nm

靈敏度:Standard(100 mdeg)

步長:1 nm

掃描速度:50 nm·min-1

1.4 測試結果

1.4.1 儀器校準結果

根據291 nm附近的譜峰圓二色值的情況調整后,重復六次的結果見表1。

表1 0.6 mg·mL-1樟腦磺酸銨水溶液的圓二色值Table 1 CD magnitude of ammonium d-10-camphorsulfonate (ACS) with a concentration of 0.6 mg·mL-1 in pure water

由于儀器測得的圓二色值不是絕對值,本文只考慮這些值的可比性的實際要求。雖然我們將CD儀器使用樟腦磺酸銨校準到參考CD值(190.4±1) mdeg @(290±1) nm,但這個賦值沒有相關不確定度,且不可溯源。CD測量的可溯源性至今仍是一個挑戰(zhàn),不在本文討論的范圍。此外,即使是在參考波長291 nm對儀器進行了充分校準,也無法斷定在所有波長下的響應都是相同的,因此受到當前方法的限制,假設儀器響應曲線為平直線,即響應值與波長無關。在以下建立的不確定度模型也是基于這樣的假設。

1.4.2 細胞色素C的測試結果

對2個平行樣品溶液使用3支光程長1 mm比色皿裝樣,每個重復6次測量,總計測量36次,得到的CD譜圖經過平滑處理后,以250～260 nm附近的平直譜線為基線,記錄譜圖中222 nm附近的峰高值,即為圓二色值,見表2,單位用mdeg表示,數據精確到小數點后兩位。

表2 0.05 mg·mL-1細胞色素C水溶液的圓二色值Table 2 CD magnitude of Cytochrome C with a concentration of 0.05 mg·mL-1 in pure water

2 結果與討論

2.1 模型的建立

光學活性物質對于左旋圓偏振光和右旋圓偏振光的吸收是不同的,吸光度的差值與吸光度同樣符合Beer-Lambert定律。

ΔA=c×l×Δε

(1)

式(1)中,ΔA為左、右吸光度值的差值;c為溶液濃度,單位為mol·dm-3;l為比色皿光程長,單位為cm;Δε為左、右摩爾吸光系數的差值,單位為mol-1·dm3·cm-1。

儀器給出的原值即圓二色值,是光學活性物質吸收左、右圓偏振光后形成的橢圓偏振光的橢圓度,與吸光度差值的關系為

θ=32.982×ΔA

(2)

聯合式(1)和式(2),可以得出式(3)

θ=32.982×c×l×Δε

(3)

θ的單位為毫度(millidegree,縮寫為mdeg),是一種非標準的平面角單位,被廣泛用于CD光譜學領域[15]。1 mdeg等于10-3度或約17.4 μrad。

2.2 不確定度來源分析

根據式(3)中的函數關系,圓二色值的不確定度來源主要有以下幾個方面:測量重復性;樣品溶液濃度;比色皿光程長;左、右摩爾吸光系數的差值。2.3節(jié)對以上幾個方面的不確定度進行計算。

2.3 A類不確定度評定

與CD相關測量的不確定度很大程度來源于儀器本身,潛在的噪聲源包括光源、光電倍增管、光電調制器、鎖定放大器等,這些與儀器性能相關的標準不確定度可以通過多次重復測試使用統計學方法進行評估。環(huán)境溫、濕度的影響也包含在重復性測量中,下述不再考慮該因素。

對表2中的數據進行統計分析,36次平行測試0.05 mg·mL-1的細胞色素C的圓二色值平均值為-4.527 mdeg,A類標準不確定度為

由重復性引入的相對標準不確定度為

2.4 B類不確定度評定

2.4.1 蛋白溶液濃度的不確定度

細胞色素C樣品溶液濃度的不確定度由細胞色素C的含量不確定度以及配置儲備液及稀釋過程引入,以下分別進行計算。

(1) 查細胞色素C標準物質證書,相對分子量標準值為12 355,擴展不確定度為16,通過相對分子量推算得其純度的相對標準不確定度為

(2) 溶液配置過程為:在細胞色素C樣品瓶中精密加入超純水1 mL,完全溶解后精密移取100 μL至離心管,再精密加入900 μL超純水稀釋,搖勻,精密移取該溶液400 μL至離心管,再精密加入3 600 μL超純水,最終濃度0.05 mg·mL-1。查單道可調式移液器檢定證書,得1 000 μL容量允差為±1.0%,200 μL容量允差為±1.5%,100 μL容量允差為±2%。配置過程中使用1 000 μL移液器6次,使用200 μL移液器2次,100 μL移液器1次,按三角形分布計算標準不確定度,配置過程引入的相對標準不確定度為

=0.015 6

(3) 蛋白樣品溶液濃度的相對標準不確定度為

=0.015 6

2.4.2 左、右摩爾吸光系數差值的不確定度

儀器經過校準,假定校準因子與波長無關,引入校準因子后的溶液吸光度值公式為:

ΔΑ0=xc0l0Δε0

(4)

ΔΑi=xciliΔεi

(5)

式(4)和式(5)中,校準因子x相等,因此可得蛋白樣品溶液左、右摩爾吸光系數差值Δεi為

(6)

式(6)中,Δε0為校準樣品d-10-樟腦磺酸銨的左、右摩爾吸光系數差值,是一個指定的文獻值,沒有相關不確定度[12]。

ΔA0和ΔAi分別為校準樣品和蛋白樣品的左、右摩爾吸光度,其標準不確定度是由儀器性能決定的,因此是一個統計值,在重復性的不確定度中已經進行評估。

c0和ci分別表示校準溶液的濃度和蛋白樣品的濃度,溶液濃度的不確定度由樣品的純度及稀釋過程引入,分別進行計算。ci的相對不確定度上文已經給出,同理計算c0的不確定度為

l0和li分別為校準溶液和蛋白溶液的比色皿光程長,其相對不確定度使用數據的相對標準偏差表示,li含有3個比色皿的數據,取其中最大值進行計算。

=0.057

2.5 0.05 mg·mL-1細胞色素C水溶液的圓二色值的合成標準不確定度

上述測定中各不確定度分量互不相關,則0.05 mg·mL-1細胞色素C水溶液的圓二色值的合成標準不確定度uθ(X)為

=0.270 mdeg

2.6 擴展不確定度U

取置信概率P=95%,包含因子kp=2,則其擴展不確定度為U=kp×uθ(X)=2×0.270=0.54 mdeg。

2.7 測定結果的表示

結果保留小數點后兩位,0.05 mg·mL-1細胞色素C水溶液的圓二色值表示為:θ=(-4.53±0.54) mdeg,k=2,P=95%。將以上不確定度分量列于表3。

表3 不確定度分量列表Table 3 List of uncertainty components

通過表3可以看出,不確定分量最大的是1 mm比色皿光程長不確定度,在本文中該值使用測試數據的相對標準偏差進行計算,涉及譜圖中譜峰強度和基線噪音,譜圖的平滑等。真實的光程長可以用兩種方法來測量[10,12],一是使用鉻酸鉀溶液在273 nm的吸收,二是干涉法,將比色皿放置在光譜儀中,并計算兩個波長和之間的完整干涉條紋的數量。無論哪種方法測得,最終的光程長會受到樣品粘度的影響。比色皿基線可能會受到殘留的蛋白污染,如果譜圖中基線偏移大于5 mdeg,則需要清洗比色皿后再行測試。30%鹽酸+70%乙醇溶液,發(fā)煙硝酸或重鉻酸鉀-硫酸洗液均可以用來清洗比色皿中殘留蛋白污染物[10]。選擇高質量的比色皿也是獲得高質量譜圖的關鍵。

為了降低1 mm比色皿光程長不確定度,首先要使用高質量的或者有計量合格證書的比色皿;第二,在測試蛋白樣品前,先測試空白溶液的CD譜,確認比色皿干凈、基線偏移小于5 mdeg后再開始測試蛋白樣品溶液;第三,選擇合適的蛋白溶液濃度,不能過高也不宜過低。過高的濃度導致蛋白質分子間的聚集,但如果太稀,在樣品溶液與玻璃移液管和試管接觸中可能會因吸附在玻璃表面而導致蛋白質損失,影響測試的準確性。一般CD測量是在相對稀釋的蛋白質溶液(0.01～0.2 mg·mL-1)上進行的,樣品在感興趣波長范圍內的最大吸光度值不得超過2,最佳值為在信噪比最大的波長處吸光度值0.87;第四,保持CD光譜采集參數一致且合適,為了防止光譜變形,推薦經驗的儀器參數設置選擇為:掃描速度×響應時間<帶寬(band width)<光譜特征寬度(一般蛋白質的寬度為15 nm)/ 10。比如本文采用的測試參數為:掃描速度50 nm·min-1,響應時間1 s,帶寬1 nm。第五,保持處理CD光譜的參數一致。直接采集到無需處理的高質量CD光譜耗時較長,一般情況下,CD光譜需要經過平滑降噪處理后進行二級結構計算、解卷積分析或其他的比較。

另外一個較大的分量為溶液的不確定度,其中貢獻占比大的是校準溶液和蛋白溶液的配置和稀釋過程。在這個溶液配置過程中,盡量減少稀釋次數,使用檢定合格的容量瓶或移液器等可以減少其對不確定度的貢獻。

3 結 論

CD光譜學是一種廣泛使用的評估蛋白質的二級結構的技術,計算結果的可靠性與CD原始光譜圖的質量直接相關。建立了CD光譜測試的簡單模型,并使用它來評估一個α-螺旋主導蛋白質—細胞色素C在固定濃度0.05 mg·mL-1下的圓二色值的不確定度。這些不確定度既與隨機因素有關,可以從重復測量中得出(A型評估),也與測試過程相關,只能采用非統計學方法進行評估(B型評估)。總體考慮了儀器性能、蛋白溶液濃度、校準溶液濃度、比色皿的光程長、左、右摩爾吸光系數帶來的不確定度,并使用可靠的校正因子k=2,在對儀器進行校準的情況下,評估了0.05 mg·mL-1細胞色素C在波長為222 nm處的圓二色值不確定度,為±0.54 mdeg。通過不確定度的評定,找出影響測量結果準確性的主要因素,其中較為顯著的不確定度分量為1 mm比色皿光程長不確定度和溶液配置、稀釋過程引入的不確定度,設法消除或降低這些因素的影響,可以改進測量方法。以測量不確定度的評定為工具,解剖分析測量過程,探討CD數據的可比性和可靠性,為準確評估蛋白質的二級結構奠定基礎,并為進一步開展CD光譜的實驗室間比對提供實驗參考。