程 紅,嚴(yán)定策*,武利慶,徐 俊

1. 華中科技大學(xué)分析測(cè)試中心,湖北 武漢 430074 2. 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院前沿計(jì)量科學(xué)中心,北京 100029 3. 華中科技大學(xué)能源與動(dòng)力工程學(xué)院,湖北 武漢 430074

引 言

在自然界中,手性是生物分子如蛋白質(zhì)、氨基酸、碳水化合物、核酸等本身固有的屬性[1-2]。圓二色(circular dichroism,CD)光譜作為一項(xiàng)用于研究手性分子的光譜技術(shù),在這些物質(zhì)的研究中被廣泛應(yīng)用,其中以蛋白質(zhì)尤為突出。通過(guò)CD光譜學(xué)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,可以鑒定和評(píng)估其二級(jí)結(jié)構(gòu)[3-4],檢測(cè)細(xì)微或顯著的構(gòu)象變化,研究蛋白質(zhì)動(dòng)態(tài)變化和/或配體結(jié)合效應(yīng)等[5-6],以獲得關(guān)于所研究蛋白質(zhì)的快速和全局結(jié)構(gòu)信息,因此CD光譜學(xué)被世界各地的研究人員用作結(jié)晶學(xué)、核磁共振和分子動(dòng)力學(xué)的補(bǔ)充技術(shù)[7]。

在CD光譜中,遠(yuǎn)紫外區(qū)域(通常為180～260 nm)的光譜可以給出蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)含量的總體指示,因?yàn)樵搮^(qū)域的主要生色團(tuán)是分子的肽主鏈。在蛋白質(zhì)的規(guī)則二級(jí)結(jié)構(gòu)中,肽鍵是高度有規(guī)律排列的,排列的方向性決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況[8]。對(duì)遠(yuǎn)紫外CD光譜進(jìn)行解卷積,可以提供二級(jí)結(jié)構(gòu)組成的定量估計(jì),但普通生物制藥緩沖液和賦形劑可能會(huì)產(chǎn)生干擾,糖基化、聚糖綴合、其他翻譯后變化或異常氨基酸組成也會(huì)影響[9]。用CD方法獲得的結(jié)構(gòu)信息有時(shí)會(huì)受到原始CD數(shù)據(jù)質(zhì)量的影響。正如Miles和Wallace所述,在任意兩臺(tái)儀器中進(jìn)行的CD測(cè)量,即使在可比較的條件下,相同樣品的光譜幅度(elipticity橢圓度,CD scale,也稱圓二色值)或波長(zhǎng)也可能存在細(xì)微差異。光源、最終的光度輸出和各個(gè)儀器之間入射光偏振的微小差異是導(dǎo)致圓二色值或波長(zhǎng)產(chǎn)生差異的可能原因。為了避免這些差異導(dǎo)致數(shù)據(jù)的不可比性,在采集CD數(shù)據(jù)之前,必須對(duì)CD儀器進(jìn)行校準(zhǔn),包括圓二色值和波長(zhǎng),因?yàn)镃D解卷積分析強(qiáng)烈依賴于圓二色值。

最近,人們認(rèn)識(shí)到蛋白質(zhì)的高階結(jié)構(gòu)要得到更好的表征,必須重視這些數(shù)據(jù)的客觀比較[10-11]。要輸出統(tǒng)計(jì)上有效的數(shù)據(jù),就需要清楚地了解光譜不確定性的來(lái)源、如何糾正它們以及其對(duì)結(jié)果有效性的影響。Maurice等[12]采用一次國(guó)際比對(duì)的數(shù)據(jù)利用摩爾橢圓度討論了蛋白質(zhì)的圓二色光譜譜圖的不確定度;Jones[13]比較了一個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(protein circular dichroism data bank,PCDDB)中108個(gè)d-10-樟腦磺酸的校準(zhǔn)數(shù)據(jù),對(duì)這些光譜位于290和190 nm附近的峰進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)評(píng)估,發(fā)現(xiàn)儀器之間峰波長(zhǎng)的平均值差異顯著;Victor等[14]采用蒙特卡羅模型(Monte Carlo-like model)評(píng)估了使用CDSSTR、Selcon 3和ContinLL算法對(duì)肌紅蛋白的理論CD譜進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)的不確定度。本工作以一種α-螺旋為主導(dǎo)的蛋白質(zhì)—細(xì)胞色素C為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,考察了圓二色光譜測(cè)定蛋白質(zhì)實(shí)際測(cè)試過(guò)程中圓二色值θ的不確定度。圓二色光譜是為一段波長(zhǎng)下橢圓度θ的測(cè)量值,通常θ的單位用mdeg表示。一般情況下,θ值和CD吸光度的差值(ΔA)不在實(shí)驗(yàn)室之間或?qū)嶒?yàn)室內(nèi)進(jìn)行比較[12],但是本實(shí)驗(yàn)中考慮所用比色皿的光程長(zhǎng)度、儀器的校準(zhǔn)狀態(tài)和溶液的濃度,期望通過(guò)特定蛋白質(zhì)在特定濃度下的θ值不確定度的評(píng)估,找出影響測(cè)量結(jié)果的主要因素,可以設(shè)法消除或降低這些因素的影響,改進(jìn)測(cè)量方法,提高CD數(shù)據(jù)的可比性和可靠性,為進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器設(shè)備

日本Jasco公司J-810型圓二色光譜儀;波蘭RADWAG公司AS 60/220 R2型分析天平(經(jīng)湖北省計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院檢定合格,在檢定合格有效期內(nèi)使用);法國(guó)Millipore公司Milli-QAcademic型純水機(jī)(經(jīng)湖北省計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院檢定合格,在檢定合格有效期內(nèi)使用);德國(guó)Eppendorf公司Researchplus單道可調(diào)式移液器,20～200 μL,100～1 000 μL(經(jīng)湖北省計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院檢定合格,在檢定合格有效期內(nèi)使用);光程長(zhǎng)為10 mm的石英比色皿1支、光程長(zhǎng)為1 mm的石英比色皿3支 (Starna Scientific Ltd. Hainault,Essex IG6 3UT,UK);10 mL容量瓶一支(經(jīng)湖北省計(jì)量測(cè)試技術(shù)研究院檢定合格,在檢定合格有效期內(nèi)使用)。

1.2 樣品

d-10-樟腦磺酸銨(ACS,購(gòu)自日本Jasco公司,部件號(hào):0730-0358,純度99%);細(xì)胞色素C(5 mg,棕色玻璃瓶裝,購(gòu)自中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)資源共享平臺(tái),中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院研制二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),GBW(E)100153。在樣品有效期內(nèi)使用。)實(shí)驗(yàn)用水為超純水(電阻率為18 MΩ·cm)。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

精確稱取樟腦磺酸銨樣品6.77 mg,使用移液器精密加入1.13 mL超純水,完全溶解后,使用移液器精密移取1 mL,置10 mL容量瓶,使用超純水定容至刻度線,濃度為0.6 mg·mL-1。

在細(xì)胞色素C樣品瓶中精密加入超純水1 mL,完全溶解后精密移取100 μL至離心管,再精密加入900 μL超純水稀釋,搖勻,精密移取該溶液400 μL至離心管,再精密加入3 600 μL超純水,搖勻,濃度為0.05 mg·mL-1,平行配制兩次。

將所有樣品溶液放置在冰箱(4 ℃)中。在進(jìn)行CD測(cè)量之前,讓溶液在此溫度下平衡至少一整夜。

1.3.2 儀器校準(zhǔn)

從冰箱中取出樟腦磺酸銨樣品溶液,在室溫[(23±2)℃]下平衡1 h,并在進(jìn)行CD測(cè)量之前將樣品裝入光程長(zhǎng)為10 mm的石英比色皿內(nèi),根據(jù)如下參數(shù)測(cè)量樣品的CD光譜:

掃描范圍:200～400 nm

累積次數(shù):1次

響應(yīng)時(shí)間:1 s

帶寬:1 nm

靈敏度:Standard(100 mdeg)

步長(zhǎng):1 nm

掃描速度:50 nm·min-1

根據(jù)樟腦磺酸銨溶液的出峰情況調(diào)整儀器,使291 nm附近譜峰的圓二色值為(190.4±1) mdeg。記錄6個(gè)重復(fù)光譜。

1.3.3 樣品溶液的測(cè)試

在完成儀器校準(zhǔn)當(dāng)天,將細(xì)胞色素C樣品溶液從冰箱中取出,在室溫[(23±2)℃]下平衡1小時(shí)。在進(jìn)行CD測(cè)量之前,先測(cè)試溶劑空白-超純水在光程長(zhǎng)為1 mm的石英比色皿的圓二色光譜圖,然后將樣品裝入同一個(gè)比色皿內(nèi)進(jìn)行CD測(cè)量,測(cè)試中保持樣品測(cè)試與空白測(cè)試時(shí)比色皿的方向一致。根據(jù)如下參數(shù)測(cè)量樣品的遠(yuǎn)紫外CD光譜。記錄樣品的6個(gè)重復(fù)光譜(連續(xù)測(cè)定,重復(fù)測(cè)量不重新裝樣)。2個(gè)平行溶液分別使用3支比色皿測(cè)試,共測(cè)試36次。

掃描范圍:190～260 nm

累積次數(shù):6次

響應(yīng)時(shí)間:1 s

帶寬:1 nm

靈敏度:Standard(100 mdeg)

步長(zhǎng):1 nm

掃描速度:50 nm·min-1

1.4 測(cè)試結(jié)果

1.4.1 儀器校準(zhǔn)結(jié)果

根據(jù)291 nm附近的譜峰圓二色值的情況調(diào)整后,重復(fù)六次的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 0.6 mg·mL-1樟腦磺酸銨水溶液的圓二色值Table 1 CD magnitude of ammonium d-10-camphorsulfonate (ACS) with a concentration of 0.6 mg·mL-1 in pure water

由于儀器測(cè)得的圓二色值不是絕對(duì)值,本文只考慮這些值的可比性的實(shí)際要求。雖然我們將CD儀器使用樟腦磺酸銨校準(zhǔn)到參考CD值(190.4±1) mdeg @(290±1) nm,但這個(gè)賦值沒(méi)有相關(guān)不確定度,且不可溯源。CD測(cè)量的可溯源性至今仍是一個(gè)挑戰(zhàn),不在本文討論的范圍。此外,即使是在參考波長(zhǎng)291 nm對(duì)儀器進(jìn)行了充分校準(zhǔn),也無(wú)法斷定在所有波長(zhǎng)下的響應(yīng)都是相同的,因此受到當(dāng)前方法的限制,假設(shè)儀器響應(yīng)曲線為平直線,即響應(yīng)值與波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。在以下建立的不確定度模型也是基于這樣的假設(shè)。

1.4.2 細(xì)胞色素C的測(cè)試結(jié)果

對(duì)2個(gè)平行樣品溶液使用3支光程長(zhǎng)1 mm比色皿裝樣,每個(gè)重復(fù)6次測(cè)量,總計(jì)測(cè)量36次,得到的CD譜圖經(jīng)過(guò)平滑處理后,以250～260 nm附近的平直譜線為基線,記錄譜圖中222 nm附近的峰高值,即為圓二色值,見(jiàn)表2,單位用mdeg表示,數(shù)據(jù)精確到小數(shù)點(diǎn)后兩位。

表2 0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C水溶液的圓二色值Table 2 CD magnitude of Cytochrome C with a concentration of 0.05 mg·mL-1 in pure water

2 結(jié)果與討論

2.1 模型的建立

光學(xué)活性物質(zhì)對(duì)于左旋圓偏振光和右旋圓偏振光的吸收是不同的,吸光度的差值與吸光度同樣符合Beer-Lambert定律。

ΔA=c×l×Δε

(1)

式(1)中,ΔA為左、右吸光度值的差值;c為溶液濃度,單位為mol·dm-3;l為比色皿光程長(zhǎng),單位為cm;Δε為左、右摩爾吸光系數(shù)的差值,單位為mol-1·dm3·cm-1。

儀器給出的原值即圓二色值,是光學(xué)活性物質(zhì)吸收左、右圓偏振光后形成的橢圓偏振光的橢圓度,與吸光度差值的關(guān)系為

θ=32.982×ΔA

(2)

聯(lián)合式(1)和式(2),可以得出式(3)

θ=32.982×c×l×Δε

(3)

θ的單位為毫度(millidegree,縮寫(xiě)為mdeg),是一種非標(biāo)準(zhǔn)的平面角單位,被廣泛用于CD光譜學(xué)領(lǐng)域[15]。1 mdeg等于10-3度或約17.4 μrad。

2.2 不確定度來(lái)源分析

根據(jù)式(3)中的函數(shù)關(guān)系,圓二色值的不確定度來(lái)源主要有以下幾個(gè)方面:測(cè)量重復(fù)性;樣品溶液濃度;比色皿光程長(zhǎng);左、右摩爾吸光系數(shù)的差值。2.3節(jié)對(duì)以上幾個(gè)方面的不確定度進(jìn)行計(jì)算。

2.3 A類(lèi)不確定度評(píng)定

與CD相關(guān)測(cè)量的不確定度很大程度來(lái)源于儀器本身,潛在的噪聲源包括光源、光電倍增管、光電調(diào)制器、鎖定放大器等,這些與儀器性能相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度可以通過(guò)多次重復(fù)測(cè)試使用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行評(píng)估。環(huán)境溫、濕度的影響也包含在重復(fù)性測(cè)量中,下述不再考慮該因素。

對(duì)表2中的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,36次平行測(cè)試0.05 mg·mL-1的細(xì)胞色素C的圓二色值平均值為-4.527 mdeg,A類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

由重復(fù)性引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.4 B類(lèi)不確定度評(píng)定

2.4.1 蛋白溶液濃度的不確定度

細(xì)胞色素C樣品溶液濃度的不確定度由細(xì)胞色素C的含量不確定度以及配置儲(chǔ)備液及稀釋過(guò)程引入,以下分別進(jìn)行計(jì)算。

(1) 查細(xì)胞色素C標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū),相對(duì)分子量標(biāo)準(zhǔn)值為12 355,擴(kuò)展不確定度為16,通過(guò)相對(duì)分子量推算得其純度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

(2) 溶液配置過(guò)程為:在細(xì)胞色素C樣品瓶中精密加入超純水1 mL,完全溶解后精密移取100 μL至離心管,再精密加入900 μL超純水稀釋,搖勻,精密移取該溶液400 μL至離心管,再精密加入3 600 μL超純水,最終濃度0.05 mg·mL-1。查單道可調(diào)式移液器檢定證書(shū),得1 000 μL容量允差為±1.0%,200 μL容量允差為±1.5%,100 μL容量允差為±2%。配置過(guò)程中使用1 000 μL移液器6次,使用200 μL移液器2次,100 μL移液器1次,按三角形分布計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)不確定度,配置過(guò)程引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

=0.015 6

(3) 蛋白樣品溶液濃度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

=0.015 6

2.4.2 左、右摩爾吸光系數(shù)差值的不確定度

儀器經(jīng)過(guò)校準(zhǔn),假定校準(zhǔn)因子與波長(zhǎng)無(wú)關(guān),引入校準(zhǔn)因子后的溶液吸光度值公式為:

ΔΑ0=xc0l0Δε0

(4)

ΔΑi=xciliΔεi

(5)

式(4)和式(5)中,校準(zhǔn)因子x相等,因此可得蛋白樣品溶液左、右摩爾吸光系數(shù)差值Δεi為

(6)

式(6)中,Δε0為校準(zhǔn)樣品d-10-樟腦磺酸銨的左、右摩爾吸光系數(shù)差值,是一個(gè)指定的文獻(xiàn)值,沒(méi)有相關(guān)不確定度[12]。

ΔA0和ΔAi分別為校準(zhǔn)樣品和蛋白樣品的左、右摩爾吸光度,其標(biāo)準(zhǔn)不確定度是由儀器性能決定的,因此是一個(gè)統(tǒng)計(jì)值,在重復(fù)性的不確定度中已經(jīng)進(jìn)行評(píng)估。

c0和ci分別表示校準(zhǔn)溶液的濃度和蛋白樣品的濃度,溶液濃度的不確定度由樣品的純度及稀釋過(guò)程引入,分別進(jìn)行計(jì)算。ci的相對(duì)不確定度上文已經(jīng)給出,同理計(jì)算c0的不確定度為

l0和li分別為校準(zhǔn)溶液和蛋白溶液的比色皿光程長(zhǎng),其相對(duì)不確定度使用數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表示,li含有3個(gè)比色皿的數(shù)據(jù),取其中最大值進(jìn)行計(jì)算。

=0.057

2.5 0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C水溶液的圓二色值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

上述測(cè)定中各不確定度分量互不相關(guān),則0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C水溶液的圓二色值的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uθ(X)為

=0.270 mdeg

2.6 擴(kuò)展不確定度U

取置信概率P=95%,包含因子kp=2,則其擴(kuò)展不確定度為U=kp×uθ(X)=2×0.270=0.54 mdeg。

2.7 測(cè)定結(jié)果的表示

結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位,0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C水溶液的圓二色值表示為:θ=(-4.53±0.54) mdeg,k=2,P=95%。將以上不確定度分量列于表3。

表3 不確定度分量列表Table 3 List of uncertainty components

通過(guò)表3可以看出,不確定分量最大的是1 mm比色皿光程長(zhǎng)不確定度,在本文中該值使用測(cè)試數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算,涉及譜圖中譜峰強(qiáng)度和基線噪音,譜圖的平滑等。真實(shí)的光程長(zhǎng)可以用兩種方法來(lái)測(cè)量[10,12],一是使用鉻酸鉀溶液在273 nm的吸收,二是干涉法,將比色皿放置在光譜儀中,并計(jì)算兩個(gè)波長(zhǎng)和之間的完整干涉條紋的數(shù)量。無(wú)論哪種方法測(cè)得,最終的光程長(zhǎng)會(huì)受到樣品粘度的影響。比色皿基線可能會(huì)受到殘留的蛋白污染,如果譜圖中基線偏移大于5 mdeg,則需要清洗比色皿后再行測(cè)試。30%鹽酸+70%乙醇溶液,發(fā)煙硝酸或重鉻酸鉀-硫酸洗液均可以用來(lái)清洗比色皿中殘留蛋白污染物[10]。選擇高質(zhì)量的比色皿也是獲得高質(zhì)量譜圖的關(guān)鍵。

為了降低1 mm比色皿光程長(zhǎng)不確定度,首先要使用高質(zhì)量的或者有計(jì)量合格證書(shū)的比色皿;第二,在測(cè)試蛋白樣品前,先測(cè)試空白溶液的CD譜,確認(rèn)比色皿干凈、基線偏移小于5 mdeg后再開(kāi)始測(cè)試蛋白樣品溶液;第三,選擇合適的蛋白溶液濃度,不能過(guò)高也不宜過(guò)低。過(guò)高的濃度導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子間的聚集,但如果太稀,在樣品溶液與玻璃移液管和試管接觸中可能會(huì)因吸附在玻璃表面而導(dǎo)致蛋白質(zhì)損失,影響測(cè)試的準(zhǔn)確性。一般CD測(cè)量是在相對(duì)稀釋的蛋白質(zhì)溶液(0.01～0.2 mg·mL-1)上進(jìn)行的,樣品在感興趣波長(zhǎng)范圍內(nèi)的最大吸光度值不得超過(guò)2,最佳值為在信噪比最大的波長(zhǎng)處吸光度值0.87;第四,保持CD光譜采集參數(shù)一致且合適,為了防止光譜變形,推薦經(jīng)驗(yàn)的儀器參數(shù)設(shè)置選擇為:掃描速度×響應(yīng)時(shí)間<帶寬(band width)<光譜特征寬度(一般蛋白質(zhì)的寬度為15 nm)/ 10。比如本文采用的測(cè)試參數(shù)為:掃描速度50 nm·min-1,響應(yīng)時(shí)間1 s,帶寬1 nm。第五,保持處理CD光譜的參數(shù)一致。直接采集到無(wú)需處理的高質(zhì)量CD光譜耗時(shí)較長(zhǎng),一般情況下,CD光譜需要經(jīng)過(guò)平滑降噪處理后進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)計(jì)算、解卷積分析或其他的比較。

另外一個(gè)較大的分量為溶液的不確定度,其中貢獻(xiàn)占比大的是校準(zhǔn)溶液和蛋白溶液的配置和稀釋過(guò)程。在這個(gè)溶液配置過(guò)程中,盡量減少稀釋次數(shù),使用檢定合格的容量瓶或移液器等可以減少其對(duì)不確定度的貢獻(xiàn)。

3 結(jié) 論

CD光譜學(xué)是一種廣泛使用的評(píng)估蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的技術(shù),計(jì)算結(jié)果的可靠性與CD原始光譜圖的質(zhì)量直接相關(guān)。建立了CD光譜測(cè)試的簡(jiǎn)單模型,并使用它來(lái)評(píng)估一個(gè)α-螺旋主導(dǎo)蛋白質(zhì)—細(xì)胞色素C在固定濃度0.05 mg·mL-1下的圓二色值的不確定度。這些不確定度既與隨機(jī)因素有關(guān),可以從重復(fù)測(cè)量中得出(A型評(píng)估),也與測(cè)試過(guò)程相關(guān),只能采用非統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行評(píng)估(B型評(píng)估)。總體考慮了儀器性能、蛋白溶液濃度、校準(zhǔn)溶液濃度、比色皿的光程長(zhǎng)、左、右摩爾吸光系數(shù)帶來(lái)的不確定度,并使用可靠的校正因子k=2,在對(duì)儀器進(jìn)行校準(zhǔn)的情況下,評(píng)估了0.05 mg·mL-1細(xì)胞色素C在波長(zhǎng)為222 nm處的圓二色值不確定度,為±0.54 mdeg。通過(guò)不確定度的評(píng)定,找出影響測(cè)量結(jié)果準(zhǔn)確性的主要因素,其中較為顯著的不確定度分量為1 mm比色皿光程長(zhǎng)不確定度和溶液配置、稀釋過(guò)程引入的不確定度,設(shè)法消除或降低這些因素的影響,可以改進(jìn)測(cè)量方法。以測(cè)量不確定度的評(píng)定為工具,解剖分析測(cè)量過(guò)程,探討CD數(shù)據(jù)的可比性和可靠性,為準(zhǔn)確評(píng)估蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ),并為進(jìn)一步開(kāi)展CD光譜的實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)提供實(shí)驗(yàn)參考。