肖 江,聶志奎,周圣驕,劉 杰,聶 波,廖海兵,胡騰飛

(江西新瑞豐生化股份有限公司,江西 新干 331300)

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是一種與植物激素具有相似生理和生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì),可以有效調(diào)節(jié)作物的生長(zhǎng)發(fā)育過程,達(dá)到穩(wěn)產(chǎn)增產(chǎn)、改善品質(zhì)、提高作物抗逆性等目的[1-3]。作為目前使用最廣泛的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑之一,赤霉素(GAs)參與許多植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程[4-5]。赤霉素是一類雙萜類化合物,目前已發(fā)現(xiàn)136種不同結(jié)構(gòu)的赤霉素類化合物[6],而不同結(jié)構(gòu)的赤霉素可以調(diào)節(jié)植物不同部位的生長(zhǎng)。如GA3主要調(diào)節(jié)植物莖葉的生長(zhǎng),且生物活性最強(qiáng);GA4主要對(duì)植物果實(shí)細(xì)胞的伸長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用最明顯,在一定程度上打破某些植物種子的休眠、提高座果率、防止果裂和果銹等;GA7主要用于核果類植物的開花期,調(diào)節(jié)植物的開花數(shù)量,從而保證果實(shí)質(zhì)量[7-8]。GA4是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一種非常重要的植物調(diào)節(jié)劑,目前GA4主要通過微生物發(fā)酵生產(chǎn),但發(fā)酵液中含有大量難以去除的有機(jī)雜質(zhì),造成GA4提取困難。鑒于此,作者開發(fā)一種新的GA4提取工藝,為工業(yè)化生產(chǎn)GA4開辟一條廉價(jià)環(huán)保的途徑。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

GA4發(fā)酵液,江西新瑞豐生化股份有限公司;ZX-767型針劑用活性炭,江蘇竹溪活性炭有限公司。

“1231”破乳劑(含量≥99.0%),安徽奔馬先端科技有限公司;乙酸乙酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%,其中乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.5%),工業(yè)級(jí);乙醇(體積分?jǐn)?shù)≥95.0%),工業(yè)用二級(jí);鹽酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥31.0%),工業(yè)用合格品。

RE-300A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;LC-20型全自動(dòng)液相色譜儀,島津;NFS8040-30/10型一級(jí)濃縮納濾膜設(shè)備;增強(qiáng)聚丙烯壓濾機(jī),浙江榮源環(huán)境科技股份有限公司。

1.2 GA4的提取

用液堿調(diào)節(jié)GA4發(fā)酵液的pH值至6.5～7.0,經(jīng)過板框過濾,濃縮液水洗后再次經(jīng)過板框過濾,合并濾液;濾液經(jīng)過分子截留量為5×104～8×104的卷式超濾膜,濃縮約60倍;超濾濃縮液經(jīng)過反滲透卷式膜進(jìn)行快速低倍濃縮,濃縮約2～3倍,得到反滲透濃縮液;按0.8∶1比例將乙酸乙酯加入到反滲透濃縮液中,開啟攪拌,調(diào)節(jié)pH值至4.2～4.6,并加入約0.15%的“1231”破乳劑,攪拌,離心分離后得到萃取液;取2.0 L左右萃取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,真空濃縮(溫度50 ℃左右、真空度在-0.08 MPa以下),待乙酸乙酯全部蒸干后,迅速加入200 mL乙醇,加熱至50 ℃左右;再加入5%的活性炭,攪拌,并保持料液溫度在40 ℃左右,攪拌0.5 h,過濾,得到脫色液;緩慢加入脫色液3倍體積的去離子水,靜置0.5 h后,過濾,干燥,即得GA4結(jié)晶粉末。

1.3 GA4效價(jià)的測(cè)定

1.3.1 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:稱取GA4標(biāo)準(zhǔn)品0.025 g于容量瓶中,用少量甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得標(biāo)準(zhǔn)溶液。

樣品溶液的配制:稱取GA4結(jié)晶粉末樣品0.025 g于燒杯中,用少量甲醇溶解并定容至刻度,搖勻,即得樣品溶液。

1.3.2 色譜條件

ODS-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-水-甲酸(體積比67∶33∶0.05),使用前超聲波脫氣;流速0.75 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm;進(jìn)樣量20 μL。

1.3.3 GA4效價(jià)的計(jì)算

待高效液相色譜儀基線穩(wěn)定后,連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)準(zhǔn)溶液,計(jì)算各針相對(duì)響應(yīng)值的重復(fù)性,待相鄰兩針的相對(duì)響應(yīng)值變化小于1.5%時(shí),按標(biāo)準(zhǔn)溶液、樣品溶液、樣品溶液、標(biāo)準(zhǔn)溶液的順序進(jìn)行測(cè)定。按式(1)計(jì)算GA4效價(jià)(X):

(1)

1.4 GA4收率的計(jì)算

按式(2)計(jì)算GA4收率:

(2)

2 結(jié)果與討論

2.1 不同萃取液體積下的結(jié)晶效果(表1)

表1 不同萃取液體積下的結(jié)晶效果Tab.1 Crystallization effect under different volumes of extract liquid

從表1可以看出,針對(duì)不同體積的萃取液,該提取工藝具有普適性,但對(duì)于不同體積的萃取液,GA4收率有一定差距,可能是由于GA4提取工藝未優(yōu)化到最佳。

2.2 GA4提取工藝優(yōu)化

2.2.1 活性炭加量對(duì)GA4收率的影響(表2)

表2 活性炭加量對(duì)GA4收率的影響Tab.2 Effect of activated carbon dosage on GA4 yield

從表2可以看出,當(dāng)活性炭加量為5%時(shí),GA4收率最高。因此,最佳活性炭加量為5%。

2.2.2 水加量對(duì)GA4收率的影響(表3)

表3 水加量對(duì)GA4收率的影響Tab.3 Effect of water dosage on GA4 yield

從表3可以看出,隨著水加量的增加,GA4收率先逐漸升高后略有降低;當(dāng)水加量V水∶V脫色液增至(2～3)∶1時(shí),GA4收率較為穩(wěn)定,保持在71%左右。因此,最佳水加量V水∶V脫色液為(2～3)∶1。

2.2.3 結(jié)晶時(shí)攪拌對(duì)GA4收率的影響(表4)

表4 結(jié)晶時(shí)攪拌對(duì)GA4收率的影響Tab.4 Effect of stirring during crystallization on GA4 yield

從表4可以看出,結(jié)晶時(shí)開啟攪拌,GA4收率為73.8%;而不開啟攪拌時(shí),GA4收率僅68.0%。

綜上,確定GA4最佳提取工藝為:活性炭加量為5%、水加量V水∶V脫色液為(2～3)∶1、結(jié)晶時(shí)開啟攪拌,在此條件下,GA4收率達(dá)到73.8%。

2.3 傳統(tǒng)提取工藝評(píng)價(jià)

GA4的傳統(tǒng)提取工藝流程為:GA4發(fā)酵液經(jīng)過前處理后,蒸出大部分乙酸乙酯,再加入正丙醇和N-甲基芐胺,生成N-甲基芐胺鹽沉淀;將N-甲基芐胺鹽分離后用甲醇溶液溶解,加酸、加水使GA4結(jié)晶析出。不同萃取液體積下傳統(tǒng)提取工藝的試劑加量及結(jié)晶效果見表5。

表5 不同萃取液體積下傳統(tǒng)提取工藝的試劑加量及結(jié)晶效果 Tab.5 Reagent dosage and crystallization effect of traditional extraction process under different volumes of extract liquid

比較表1、表5數(shù)據(jù)可以看出,相同體積的萃取液,采用傳統(tǒng)提取工藝時(shí)的GA4收率略高于采用新提取工藝時(shí)的;但傳統(tǒng)提取工藝不僅需要使用價(jià)格昂貴的N-甲基芐胺、正丙醇、草酸等試劑,還涉及到成鹽化學(xué)反應(yīng),工藝冗長(zhǎng)且復(fù)雜[9],難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求[10-12]。

3 結(jié)論

開發(fā)了一種新的GA4提取工藝,該工藝流程為:GA4發(fā)酵液經(jīng)過前處理后,再經(jīng)過板框過濾、超濾和反滲透濃縮后得到反滲透濃縮液;用乙酸乙酯進(jìn)行萃取分離,將GA4轉(zhuǎn)入到有機(jī)相再進(jìn)行真空濃縮,將乙酸乙酯全部蒸出后,再轉(zhuǎn)入乙醇,加入活性炭攪拌進(jìn)行脫色處理;加入去離子水進(jìn)行重結(jié)晶,過濾,干燥,得到GA4結(jié)晶粉末。該提取工藝避免了繁瑣的操作步驟,有機(jī)溶劑使用量少,成本低,更加環(huán)保和綠色,適用于GA4的工業(yè)化生產(chǎn)。