朱為坤 張喜奎 林雅銀 陳全文 林艷藍(lán) 李靈輝

慢性腎衰竭(Chronic renal failure,CRF)是腎臟及腎臟相關(guān)性疾病的最終歸宿,相當(dāng)于慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)的4～5期。腎纖維化(Renal fibrosis,RIF)包括腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化,是各種腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰的共同病理基礎(chǔ)和必要環(huán)節(jié)。對于RIF的治療,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)尚無突破性進(jìn)展,臨床觀察發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在改善RIF,延緩CRF方面有一定療效,其機(jī)制值得深入研究。桃核承氣湯出自《傷寒雜病論》,具有活血化瘀、通腑泄?jié)嶂?用于治療瘀熱蘊(yùn)結(jié)下焦之證,其病機(jī)與RIF相符。本項(xiàng)目以5/6腎切除大鼠CRF模型為載體,通過檢測Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin等蛋白含量及光鏡觀察腎組織,研究桃核承氣湯對CRF大鼠Wnt4/β-catenin通路中p-GSK-3β的影響,探討該方改善RIF、延緩CRF的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔級雄性 Wistar大鼠100只(上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司),7周齡,體質(zhì)量 180～200 g,飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物注射用青霉素鈉,400萬IU/支(華北制藥股份有限公司);水合氯醛(青島宇龍海藻有限公司),配成10%濃度[桃核承氣湯:福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院提供中藥飲片,桃仁12 g,生大黃(后下)12 g,桂枝6 g,炙甘草6 g,芒硝(沖)6 g],煎煮并濃縮為42 g/100 ml的溶液。

1.3 主要試劑Wnt4抗體(北京bioss公司,批號20785R);β-catenin 抗體 (美國ABCAM公司,批號32572);p-GSK-3β抗體(北京bioss公司,批號5368R);β-actin 抗體(武漢proteintech公司,批號66009-1-Ig)。

1.4 主要儀器光學(xué)顯微鏡(德國Leica公司);APC300電泳儀(美國BIO-RAD公司);Bio-rad Trans-Blot 小型轉(zhuǎn)印槽轉(zhuǎn)膜儀(美國BIO-RAD公司);ChemiDocXRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 分組與造模100只Wistar大鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)l周后,隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、模型組、治療組,每組25只。參照王瑞強(qiáng)等[1]建模方法,模型組與治療組均行5/6腎切除手術(shù)大鼠麻醉后俯臥位固定在鼠臺(tái)上,手術(shù)切除2/3的左腎組織,術(shù)后注射青霉素,連用3 d。1周后進(jìn)行第2次手術(shù),切除全右腎,同樣予青霉素注射3 d。假手術(shù)組的手術(shù)過程同模型組,但不切除腎組織,僅做雙腎被膜剝離。正常組不做任何處理。術(shù)后3周,各組大鼠眼底靜脈叢采血,檢測血清肌酐(Scr)。結(jié)果顯示,與正常組和假手術(shù)組對比,治療組、模型組的Scr水平明顯增高,提示造模成功。

1.5.2 給藥干預(yù)術(shù)后4周每天上午9時(shí)給藥:治療組予桃核承氣湯4.2 g/kg灌胃,正常組、假手術(shù)組、模型組分別予等量生理鹽水灌胃,劑量均根據(jù)臨床上成人每公斤體質(zhì)量用量的6倍換算而成,給藥時(shí)間共為8周。每周給大鼠稱重1次,并根據(jù)最新體質(zhì)量調(diào)整藥量。

1.6 標(biāo)本采集

1.6.1 血液給藥后第57天上午,大鼠麻醉后采集腹主動(dòng)脈血液,用于測定血常規(guī)中紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和腎功能中Scr、尿素氮(BUN)。

1.6.2 腎組織采血后,取出大鼠左腎(模型組和治療組為左殘余腎),一部分行蘇木精-伊紅(HE)染色,用于光鏡觀察;另一部分用于檢測腎組織Wnt4、p-GSK-3β和β-catenin的蛋白含量。

1.7 檢測方法

1.7.1 Western Blot將腎組織剪切成小塊裝入EP管中加入RIPA裂解液及蛋白酶/磷酸酶抑制劑,研磨組織,收集蛋白上清液,BCA法測定蛋白濃度,100 ℃煮樣5 min使蛋白變性。配制10%SDS-PAGE電泳凝膠,加入各組蛋白樣品,經(jīng)電泳分離蛋白后,采用半干式電轉(zhuǎn)儀將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,TBST清洗,室溫封閉1 h后加入一抗(Wnt4、β-catenin、p-GSK-3β抗體稀釋濃度比例分別為:1∶1000、1∶5000、1∶1000),4 ℃ 搖床孵育過夜。TBST充分洗膜后,加入相應(yīng)HRP標(biāo)記的二抗(1∶3000),搖床室溫孵育1 h。TBST充分洗膜后,暗室中滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光劑(ECL發(fā)光劑)于膜上,曝光、顯影、定影,Quantity One圖像分析系統(tǒng)檢測各目的蛋白光密度值,以β-actin為內(nèi)參,對比分析各目的蛋白表達(dá)水平。

1.7.2 腎組織觀察將大鼠腎組織修剪后脫水,石蠟包埋,而后切成每片厚2 μm的薄片,置于載玻片上,于60 ℃恒溫箱烤片1 h,HE染色,中性樹膠封片,光鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 26.0軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示;各組間比較采用單因素方差分析;如各組間存在差異,則繼續(xù)組間兩兩比較,方差齊采用LSD法,方差不齊采用Games-Howell法。從P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況觀察正常組和假手術(shù)組:精神狀態(tài)良好,反應(yīng)靈敏,皮毛有光澤,能正常進(jìn)食、飲水,二便正常。模型組:精神較為萎靡,反應(yīng)遲鈍,體質(zhì)量增長緩慢,體毛干枯無光澤且易脫落。治療組大鼠的各項(xiàng)情況介于正常組和模型組之間。

2.2 各組大鼠存活情況比較各組大鼠在實(shí)驗(yàn)過程中,出現(xiàn)不同程度的死亡,模型組死亡數(shù)量最多,治療組次之,正常組死亡最少。主要死亡原因可能是手術(shù)過程中麻醉過量、大出血或傷口感染,部分可能因灌胃不當(dāng)或腎衰竭死亡。見表1。

表1 各組大鼠存活情況比較 (只,%)

2.3 各組大鼠血常規(guī)結(jié)果RBC計(jì)數(shù)及Hb含量,與正常比較,假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組、治療組顯著降低(P<0.05)。RBC計(jì)數(shù)及Hb含量,治療組比模型組顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血常規(guī)比較 (只,

2.4 各組大鼠腎功能比較血清Scr、BUN含量,與正常比較,假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組、治療組顯著升高(P<0.05)。血清Scr、BUN含量,治療組比模型組顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎功能比較 (只,

2.5 各組大鼠Western Blot法檢測比較Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin 蛋白含量,與正常組比較,假手術(shù)組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);模型組、治療組顯著升高(P<0.05)。Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin 蛋白含量,治療組比模型組顯著降低(P<0.05)。見圖1,表4。

圖1 各組大鼠Wnt4 p-GSK-3β β-catenin蛋白表達(dá)水平

表4 各組大鼠Wnt4 p-GSK-3β β-catenin蛋白含量比較 (只,

2.6 各組大鼠腎組織比較正常組、假手術(shù)組:腎組織形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整,均未見腎小球、腎小管及間質(zhì)的病理改變。模型組:腎組織結(jié)構(gòu)紊亂,可見大量炎癥細(xì)胞浸潤,腎小球結(jié)構(gòu)固縮,基膜增厚,腎小管擴(kuò)張,腎間質(zhì)纖維增生嚴(yán)重。治療組:部分腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,部分出現(xiàn)病理改變,程度介于正常組和模型組之間。見圖2。

圖2 腎組織HE染色光鏡圖(400×)

3 討論

桃核承氣湯出自《傷寒雜病論》,其第106條言:“太陽病不解,熱結(jié)膀胱,其人如狂,血自下,下者愈。其外不解者,尚未可攻,當(dāng)先解其外,外解已,但少腹急結(jié)者,乃可攻之,宜桃核承氣湯”。該方主治瘀熱結(jié)于下焦證,臨床上可見少腹疼痛、脹滿、拘急、煩躁不安、發(fā)狂等證候。桃核承氣湯由桃仁、大黃、芒硝、桂枝、炙甘草組成。桃仁苦甘平,活血祛瘀、潤腸通便,《神農(nóng)本草經(jīng)》謂其可“去瘀血、血閉、癥瘕、邪氣”,《本草經(jīng)疏》言其“性善破血,散而不收,瀉而無補(bǔ)”;大黃苦寒,瀉下攻積、清熱瀉火解毒、化瘀止血,《神農(nóng)本草經(jīng)》言其可“下瘀血、血閉寒熱,破癥瘕積聚,蕩滌腸胃,推陳致新……安和五臟”,《藥品化義》載:“大黃氣味重濁,直降下行,走而不守,有斬關(guān)奪門之力……用此開導(dǎo)陽邪,宣通澀滯,奏功獨(dú)勝”,二者合用,氣血通行,使瘀熱從下而走,共為君藥。芒硝咸苦寒,《珍珠囊》言:“其用有三,去實(shí)熱……滌腸中宿垢……破堅(jiān)積熱塊”,可助大黃泄熱通便;桂枝辛甘溫,《本經(jīng)疏證》言:“其能和營、通陽、利水、下氣、行水、補(bǔ)中”,可助桃仁活血化瘀、通利血脈,又防大黃、芒硝苦寒太過,二者為臣。炙甘草甘平為佐使,既可調(diào)和寒溫諸藥之用,又能補(bǔ)中護(hù)中,防止偏性之品損傷中氣?！秱畞硖K集》言:“氣留不行,故君大黃之走而不守者,以行其逆氣;甘草之甘平者,以調(diào)和其正氣;血結(jié)而不行,故用芒硝之咸以軟之,桂枝之辛以散之,桃仁之苦以泄之”。全方共奏活血化瘀,通腑泄?jié)嶂Α?/p>

腎位于下焦,RIF屬于中醫(yī)“水腫、溺毒”等范疇[2],兩者之間具有正相關(guān)性[3]。CRF存在高凝狀態(tài),與凝血因子水平異常,血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、抗凝系統(tǒng)等功能異常相關(guān)。桃核承氣湯中桃仁、大黃、桂枝有活血化瘀、行氣通脈的作用,能夠改善RIF,延緩CRF。CRF與RIF均存在腎小球?yàn)V過率(GFR)下降的病理變化,導(dǎo)致Scr、BUN、胺類、酚類等毒素在體內(nèi)蓄積,影響全身各系統(tǒng)功能。這些毒素屬于中醫(yī)“濁毒”范疇。桃核承氣湯中大黃、芒硝、桃仁均能促進(jìn)排便,使體內(nèi)的毒素從大便而出,起到降濁祛毒的功效。臨床觀察發(fā)現(xiàn),在西醫(yī)基礎(chǔ)治療的前提下,加用核桃承氣湯輔治早中期CRF,比單純的西醫(yī)治療,能更好地改善中醫(yī)證候積分、腎功能,降低CRP、IL-6、TNF-α、MDA等,升高Ccr、TAC、SOD等,提高臨床療效[4]。桃核承氣湯聯(lián)合中藥灌腸,可有效緩解CRF患者臨床癥狀,改善機(jī)體營養(yǎng)狀況,降低IL-1、IL-6、hs-CRP、TNF-α等炎性因子水平、改善腎功能[5]。

RIF與Wnt/β-catenin信號通路密切相關(guān)。β-catenin蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡[6],促進(jìn)RIF。Wnt蛋白減少時(shí),降解復(fù)合物中的GSK-3β將β-catenin磷酸化,使其含量下降,阻止了信號傳導(dǎo);Wnt蛋白增多時(shí),激活GBP蛋白,使其與GSK-3β結(jié)合,形成無活性的p-GSK-3β,從而抑制β-catenin的降解,使其含量增多,促進(jìn)信號通路傳導(dǎo)。Wnt4可以激活β-catenin依賴的Wnt信號通路[7],參與RIF進(jìn)程,且RIF的程度與p-GSK-3β蛋白表達(dá)相關(guān)[8]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)桃核承氣湯可改善CRF大鼠腎功能,降低血Scr、BUN,降低腎小球硬化指數(shù),改善RIF,從而延緩CRF的進(jìn)程[9]。另有研究發(fā)現(xiàn),桃核承氣湯對RIF大鼠的保護(hù)作用機(jī)制可能與抑制腎組織中Wnt/β-catenin和Notch-Hes1信號通路相關(guān)[10], 也可能與調(diào)節(jié)磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶1(PCK1)等蛋白,影響AMPK、Fox O/Wnt、PPAR、HIF-1等信號通路相關(guān)[11]。

本團(tuán)隊(duì)圍繞“桃核承氣湯治療CRF的作用機(jī)制”開展了系列研究,發(fā)現(xiàn)在以5/6腎切除CRF大鼠模型為載體的實(shí)驗(yàn)研究中,桃核承氣湯能改善腎微炎癥狀態(tài),改善RIF,延緩CRF發(fā)展進(jìn)程,其機(jī)制可能是上調(diào)BMP-7、MMP-2,下調(diào)TIMP-2;也可能與調(diào)控腎的TGF-β1/Smad信號通路和Wnt/β-catenin信號通路有關(guān)[12,13]。但是桃核承氣湯對CRF大鼠Wnt4/β-catenin通路中p-GSK-3β是否有影響,尚不明確。通過本研究發(fā)現(xiàn),桃核承氣湯對CRF大鼠的影響主要有以下幾個(gè)方面:①提高RBC計(jì)數(shù)和Hb含量水平,有效改善貧血;②抑制Scr、BUN的升高,調(diào)節(jié)腎功能;③抑制Wnt4、p-GSK-3β和β-catenin 蛋白的升高;④腎組織觀察,治療組部分腎組織形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,部分出現(xiàn)病理改變,程度介于正常組和模型組之間,說明在改善RIF,減輕炎癥,延緩CRF等方面,桃核承氣湯具有一定療效。由此可以推測,其機(jī)制可能是通過抑制Wnt4、p-GSK-3β、β-catenin蛋白來調(diào)節(jié)Wnt4/β-catenin信號通路。