雷 琳 蔣巧萍 雷志鈞 湯六凱 王志琪 王丹艷

鼻炎分為慢性鼻炎、急性鼻炎、藥物性鼻炎、 萎縮性鼻炎[1],其中慢性鼻炎最為常見,按病理分類,慢性鼻炎有變應(yīng)性鼻炎(AR)和非變應(yīng)性鼻炎(NAR)2種[2]。AR又稱過敏性鼻炎,目前尚無療效確切、不良作用少的藥物和療法[3]。反復(fù)遷延發(fā)作的AR和NAR都會形成慢性鼻炎,這是一種鼻部常見的慢性炎癥性疾病。流行病學(xué)資料顯示,慢性鼻炎和AR呈相同的趨勢增長,兩者存在某些內(nèi)在聯(lián)系以及類似炎癥機制[4]。

鼻靈散是趙俊欣[5]繼承師父張大昌的傳驗方,進一步結(jié)合自己的臨床經(jīng)驗組方而成,該方使用多年,治愈者不勝枚舉,取得了可重復(fù)性的治療效果。鼻靈散由辛夷、柴胡、桔梗、葶藶子組成,組方平和,臨床治療頑固性鼻竇炎效果頗佳,適用于慢性鼻竇炎,頭痛(包括額、眼等部位疼痛),鼻流膿性涕、黏液性涕,鼻塞等癥。

中醫(yī)藥成分復(fù)雜、配伍靈活的特點使其治療慢性疾病有一定的優(yōu)勢,但也存在著起效較緩、治療機制不明確等問題。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法,從藥物的物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā),從整體角度分析鼻靈散治療鼻炎的分子機制,通過大數(shù)據(jù)分析和“多成分-多靶點-全方位”的研究,為中藥作用機制研究提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點的篩選借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)檢索鼻靈散中的中藥化學(xué)成分及其相應(yīng)的藥效學(xué)參數(shù)[6]。在Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中將化合物的作用靶點進行規(guī)范。結(jié)合檢索結(jié)果建立鼻靈散的化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫。

1.2 疾病相關(guān)靶點獲取以“rhinitis”“allergic rhinitis”“nasosinusitis”等為關(guān)鍵詞,在GeneCards[7]、OMIM數(shù)據(jù)庫[8]中進行檢索,并在DRUGBANK數(shù)據(jù)庫[9]中尋找治療鼻炎的臨床一線西藥作用靶點予以補充。

1.3 藥物-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建通過Venny 2.1.0將鼻靈散的靶點與鼻炎的靶點取交集,所得交集靶點集為鼻靈散的活性成分作用于鼻炎的潛在核心靶點。通過CytoScape 3.7.1構(gòu)建鼻靈散“藥物-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,利用CytoScape 3.7.1內(nèi)置工具分析有效成分及靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù),并根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù)對核心靶點及發(fā)揮藥效的主要活性成分進行分析。

1.4 鼻靈散成分-鼻炎靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將潛在核心靶點集提交至STRING 11.0數(shù)據(jù)庫[10],設(shè)置生物種類為“Homosapiens”,構(gòu)建蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)模型,并將結(jié)果導(dǎo)入CytoScape 3.7.1中,使用內(nèi)置工具對靶點的網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)進行分析。

1.5 靶點功能與通路的富集分析Metascape平臺 擁有全面的注釋功能并且每月更新基因注釋的數(shù)據(jù)資料。將鼻靈散治療鼻炎的潛在核心靶點集錄入Metascape平臺,設(shè)置P<0.01,進行基因本體分析和途徑分析,包括生物過程(BP)、分子功能(MF)和細胞成分(CC)。

1.6 分子對接為了初步考察網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果的準確性,對1.3項下鼻靈散“中藥-活性成分-鼻炎靶點”網(wǎng)絡(luò)圖中網(wǎng)絡(luò)結(jié)點度值(Degree)≥10的活性成分和靶點蛋白進行分子對接。先獲取化合物與靶點蛋白的3D結(jié)構(gòu);再使用AutoDock Tools軟件將小分子和蛋白質(zhì)的3D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換為“PDBQT”格式;最后使用AutoDock vina軟件進行分子對接。打分系統(tǒng)使用結(jié)合自由能(Predicted binding affinity),Affinity的絕對值越大,表示預(yù)測的配體與蛋白質(zhì)分子之間的結(jié)合性越好。

2 結(jié)果

2.1 鼻靈散活性成分靶點的獲取在TCMSP數(shù)據(jù)庫中,以O(shè)B>30%,DL≥0.18為篩選條件,初步篩選得到柴胡活性成分13種,桔?；钚猿煞?種,葶藶子10種,辛夷15種;從相關(guān)文獻中補充鼻靈散化合物26種,其中柴胡含7種化合物,葶藶子含14種化合物,辛夷含5種化合物。同時通過知網(wǎng)等論文大數(shù)據(jù)整理,有些化合物雖然DL<0.18,但含量較高,仍納入。綜合上述結(jié)果并刪除重復(fù)項,一共收集了58種鼻靈散化合物。

用TCMSP數(shù)據(jù)庫提供的化合物靶點預(yù)測的功能接口對化合物進行靶點預(yù)測。辛夷對應(yīng)靶點48個,柴胡對應(yīng)靶點206個,桔梗對應(yīng)靶點70個,葶藶子對應(yīng)靶點190個,合并后刪除重復(fù)值共得到靶點250個。

2.2 鼻炎相關(guān)靶點獲取根據(jù)Genecards、OMIM、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫挖掘鼻炎相關(guān)基因,去掉重復(fù)值后有1323個,將鼻炎基因與藥物靶點基因取交集,最終獲得58個鼻靈散與鼻炎的靶基因。

2.3 主要成分-作用靶點網(wǎng)路構(gòu)建運用CytoScape 3.7.1構(gòu)建鼻靈散“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,共有437條邊,116個節(jié)點。柴胡和葶藶子的共有活性成分:異鼠李素、山奈酚、槲皮素。通過CytoScape 3.7.1中的Network Analyzer分析鼻靈散治療鼻炎網(wǎng)絡(luò)拓撲學(xué)參數(shù),得到核心成分及核心作用靶點。見表1。

表1 鼻靈散主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點特征參數(shù)

2.4 蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析將鼻靈散與鼻炎的58個交集基因提交至STRING 11.0平臺,得到鼻靈散靶點PPI網(wǎng)絡(luò)及相關(guān)數(shù)據(jù)。為了更直觀地分析蛋白質(zhì)相互作用程度,將所得數(shù)據(jù)導(dǎo)入CytoScape 3.7.1,通過Network Analyzer分析,可知蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點平均連接度數(shù)為20.38,以Degree>30為核心靶點的篩選條件,共篩選出15個靶點,這些靶點與其他蛋白的相互作用更強,在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

2.5 核心靶點富集分析與可視化采用Metascape數(shù)據(jù)庫對鼻靈散治療鼻炎的主要靶點進行GO和KEGG分析,通過Venny 2.1.0對結(jié)果進行可視化。

GO-BP分析結(jié)果表明,鼻靈散主要參與的生物學(xué)過程包括細胞因子介導(dǎo)的信號通路(Cytokine-mediated signaling pathway)、細胞對脂多糖的應(yīng)答(Response to lipopolysaccharide)、細胞對細菌起源分子的應(yīng)答(Response to molecule of bacterial origin)以及細胞對氮化合物的應(yīng)答(Cellular response to nitrogen compound)。

GO-MF分析結(jié)果顯示,相關(guān)靶點治療鼻炎的功能富集于與細胞因子受體結(jié)合(Cytokine receptor binding)、細胞因子活動(Cytokine activity)、受體調(diào)節(jié)活動(Receptor regulator activity)、受體配體活動(Receptor ligand activity)、G蛋白偶聯(lián)的乙酰膽堿受體活動(G protein-coupled acetylcholine receptor activity)。

KEGG分析顯示,其參與的通路主要有細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、癌癥通路(Pathways in cancer)、動脈粥樣硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、瘧疾(Malaria)、美洲錐蟲病(Chagas disease American trypanosomiasis)等。

2.6 分子對接模擬選擇2.3項中“中藥-活性成分-鼻炎靶點”Degree值>9的7個核心成分和Degree值>10的10個潛在蛋白靶點進行分子對接,并對蛋白靶點的原配體進行分析。保留結(jié)合自由能(Predicted binding affinity,kcal mol-1)最高絕對值的分子對接結(jié)果,并與原配體的對接結(jié)果進行比較,結(jié)合自由能的絕對值越高則代表配體與蛋白質(zhì)結(jié)合能力越強。數(shù)據(jù)經(jīng)熱圖分析,使用Paymol軟件對蛋白質(zhì)和活性化合物相互作用進行分析,發(fā)現(xiàn)核心成分與靶點之間具有良好的結(jié)合活性。

3 討論

3.1 成分分析通過數(shù)據(jù)挖掘初步篩選出鼻靈散治療鼻炎的活性成分有槲皮素、山奈酚、木犀草素、豆甾醇、β-谷甾醇、百里香酚、濱蒿內(nèi)酯等。有研究表明,槲皮素可以減輕大鼠變應(yīng)性鼻炎癥狀,山奈酚對肥大細胞所介導(dǎo)的過敏性鼻炎有一定的抑制效應(yīng),木犀草素可以通過多種途徑緩解炎癥反應(yīng)。分子對接驗證也表明,槲皮素、山奈酚、木犀草素與主要靶點(PTGS2、PTGS1、NOS2、RELA)的結(jié)合能力較強,因此推測鼻靈散BLS主要是通過槲皮素、山奈酚、木犀草素等活性成分來改善鼻炎癥狀。辛夷中木蘭脂素具有較強的抗過敏作用,對炎癥早期有明顯的抑制作用,可視為辛夷抗炎、抗過敏作用的活性成分。

目前數(shù)據(jù)挖掘得到的大部分中藥方劑主要成分皆為槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇等,這些成分具有抗病毒、抗炎、抗過敏等基本藥理作用,臨床配伍使用不同的引經(jīng)藥,即可將藥物的聯(lián)合功效引至機體相應(yīng)的部位、器官或系統(tǒng),起到“異病同治、同病異治”,治本的臨床效果,從而解釋中藥“多成分-多靶點-全方位”的作用原理。鼻靈散中辛夷作為引經(jīng)藥,能將上述藥物成分引入鼻部,起到治療作用。

3.2 作用靶點分析通過 PPI網(wǎng)絡(luò)分析與“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)相映射發(fā)現(xiàn)鼻靈散中活性成分可能通過調(diào)控 PTGS2、PTGS1、IL-6、IL1B、NOS2、GABRA2 等核心靶點干預(yù)鼻炎。PPI 網(wǎng)絡(luò)分析與“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)相映射的結(jié)果顯示,PTGS2 的連接度均排在前列,PTGS2 又稱環(huán)氧合酶 2(COX-2),是前列腺素E2(PGE2)生產(chǎn)中的關(guān)鍵步驟,其表達與機體免疫活性密切相關(guān),COX-2的過度表達會導(dǎo)致血管壁的炎性反應(yīng)。鼻靈散中存在 COX-2 抑制劑,推測通過降低 COX-2 表達發(fā)揮抗炎的效果。 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示IL-6 的連接度最高,IL-6 是一種具有廣泛生物學(xué)活性多功能的細胞因子,也是各種炎癥感染的關(guān)鍵細胞因子, 它促使疾病進展并維持免疫反應(yīng),在適應(yīng)性免疫和慢性炎癥等病理過程中起重要作用。

3.3 信號通路預(yù)測在對 BLS 作用靶點參與的生物學(xué)過程進行 KEGG 富集分析時發(fā)現(xiàn),鼻靈散治療鼻炎的通路主要有 IL-17 信號通路、TNF 信號通路。IL-17 是 TH17 細胞分泌的特征性細胞因子,在抵抗病原體入侵以及誘導(dǎo)和維持慢性炎癥的過程中發(fā)揮了重要的作用。TNF-α是一種促炎因子,具有重要的調(diào)控免疫,控制感染作用。分子對接結(jié)果顯示,鼻靈散治療鼻炎的主要活性成分槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇、豆甾醇與作用靶點PTGS2、NOS2、 GABRA2、PTGS1的結(jié)合活性均較強,與本研究結(jié)果吻合。

綜上所述,本研究通過數(shù)據(jù)挖掘,找到部分預(yù)測的活性成分和靶點關(guān)系:證明了鼻靈散的成分與AR或CRS的共同靶點之間存在良好的化學(xué)連接,鼻靈散可能通過調(diào)節(jié)細胞炎癥因子表達、介導(dǎo)物質(zhì)代謝、影響細胞存活/凋亡途徑等途徑來治療,且與細胞因子受體相互作用(Cytokine-cytokine receptor interaction)、IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)等信號通路密切相關(guān)。鼻靈散在臨床上治療頑固性的鼻炎-鼻竇炎有很好的療效,本項目組首次對該方進行研究,通過數(shù)據(jù)挖掘為中醫(yī)臨床治療慢性鼻炎的經(jīng)驗方提供了現(xiàn)代分子依據(jù)。