周 芳 楊建美 龔承先 郭玉飛 張 雪 屈銀宗

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)又稱非酒精性脂肪肝,是指除外酒精和其他明確的肝損害因素所致的,以彌漫性肝細胞大皰性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。其發(fā)病機制復雜,包括遺傳因素和表觀遺傳因素、飲食因素、胰島素抵抗、脂毒性、促炎因子以及腸道微生物組在內(nèi)的“多重打擊”學說被廣泛接受用于解釋NAFLD 的代謝及分子機制[1]。近年來,基于中醫(yī)“肝脾同病,肝病治脾”基礎理論,圍繞腸肝軸治療NAFLD的研究越來越多,但仍缺乏深入的分子生物學研究。本項目基于腸肝軸研究腸道菌群、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、肝細胞核因子 4α(Hepatocyte Nuclear Factor 4α,HNF4 α)與NAFLD(肝郁脾虛證)的相關性,為臨床疏肝健脾治療NAFLD(肝郁脾虛證)提供科學依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取45例2021年9月—2022年9月湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診的NAFLD(肝郁脾虛證) 患者,另設健康對照組45例,來源于湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院體檢中心健康體檢人群。NAFLD(肝郁脾虛證)組:男 31例,女14例;年齡(49±5.30)歲;身體質(zhì)量指數(shù)(24.51±2.37) kg·m-2。健康對照組:男30例,女15例;年齡 (50±4.80) 歲,身體質(zhì)量指數(shù)(25.03±2.09) kg·m-2。2組一般情況比較,差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。本研究經(jīng)湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院倫理委員會同意。所有患者均自愿加入本研究并簽署知情同意書。

1.2 診斷標準西醫(yī)診斷標準:西醫(yī)診斷標準及非酒精性脂肪性肝病輕、中、重度分級參照《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018更新版)》[2]擬定。中醫(yī)診斷標準:中醫(yī)診斷標準參照《非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》[3]中肝郁脾虛證標準擬定。

1.3 納入標準①符合NAFLD(肝郁脾虛證)中醫(yī)診斷標準和西醫(yī)診斷標準;②年齡18～65歲。

1.4 排除標準①合并有嚴重的心肝腎疾病;②近4周服用影響血脂代謝藥物;③近4周服用影響腸道菌群的藥物;④合并腸道疾病,如炎癥性腸病、腸易激綜合征等。

1.5 觀察指標

1.5.1 糞便菌群情況用統(tǒng)一發(fā)放的糞便采集杯分別無菌收集2組新鮮糞便樣本2～5 g,于-80 ℃冰箱保存。提取總RNA,在Illumina Hiseq2500測序平臺(廠家:Illumina,型號:2500)進行16S rRNA 高通量測序及腸道菌群多樣性分析,分別檢測2組大便腸球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌拷貝數(shù)。

1.5.2 血清5-HT水平分別采集2組空腹外周血5 ml,經(jīng)離心處理(2800 r/min)離心時間12 min,離心半徑9 cm,按照試劑盒要求采用酶聯(lián)免疫吸附法測定2組血清中5-HT的情況。

1.5.3 NAFLD(肝郁脾虛證)患者肝臟組織HNF4α的表達情況45例NAFLD(肝郁脾虛證)患者在超聲引導下經(jīng)皮肝臟穿刺吸取活組織,進行肝臟脂肪含量測定及病理檢查。根據(jù)肝臟脂肪含量測定結果參照《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018更新版)》[2]標準將NAFLD患者分為輕度、中度、重度3組。按照免疫組化染色試劑盒要求,在顯微鏡下10×10視野觀察各組標本,以細胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片鏡下隨時選取5個視野觀察陽性產(chǎn)物分布、染色情況。對每例切片,按照半定量積分法判斷結果。此部分將會由湖北省中西醫(yī)結合醫(yī)院2名經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)生閱片完成,2人結論一致時則記錄結果,當出現(xiàn)爭議結果的時候,則請第3名病理科醫(yī)生進行閱片,以2個意見相同者為準。

2 結果

2.1 2組患者腸道菌群拷貝數(shù)比較與健康對照組比較,NAFLD(肝郁脾虛證)組腸道中腸球菌、大腸桿菌明顯增多,乳酸桿菌及雙歧桿菌均明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者腸道菌群拷貝數(shù)比較

2.2 2組患者血清5-HT水平比較與健康對照組比較,NAFLD(肝郁脾虛證)組血清中5-HT的水平明顯更高,差異具有統(tǒng)計學意義 (P<0.05)。見表2。

表2 2組患者血清5-HT水平比較

2.3 NAFLD(肝郁脾虛證)組患者肝臟組織HNF4α表達比較根據(jù)肝臟組織學活檢將45例NAFLD(肝郁脾虛證)患者分為輕、中、重組,觀察各組肝臟組織HNF4α陽性積分,發(fā)現(xiàn)隨著NAFLD患者疾病嚴重程度的遞增,HNF4α陽性積分逐漸減少,NAFLD重度組與輕度組、中度組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),NAFLD中度組與輕度組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 NAFLD(肝郁脾虛證)與腸道菌群/5-HT/HNF4α的相關性分析NAFLD(肝郁脾虛證)患者腸道菌群與血清5-HT相關性分析發(fā)現(xiàn),腸球菌、大腸桿菌與5-HT呈正相關(r=0.7532,P<0.05;r=0.9216,P<0.05);乳酸桿菌、雙歧桿菌與5-HT呈負相關(r=-0.8228,P<0.05;r=-0.8543,P<0.05)。見圖1。腸道菌群與肝臟HNF4α相關性分析發(fā)現(xiàn),腸球菌、大腸桿菌與HNF4α呈負相關(r=-0.7567,P<0.05;r=-0.5628,P<0.05);乳酸桿菌、雙歧桿菌與HNF4α呈正相關(r=0.4235,P<0.05;r=0.4887,P<0.05)。見圖2。血清5-HT與肝臟HNF4α的相關性分析發(fā)現(xiàn),兩者呈負相關(r=-0.6858,P<0.05)。見圖3。提示,腸道菌群失調(diào)與血清5-HT分泌、肝臟HNF4α表達存在相關性。

圖1 NAFLD(肝郁脾虛證)患者腸道菌群與血清5-HT的相關性分析

圖2 NAFLD(肝郁脾虛證)患者腸道菌群與肝臟HNF4α的相關性分析

圖3 NAFLD(肝郁脾虛證)患者血清5-HT與肝臟HNF4α的相關性分析

3 討論

隨著人類飲食結構和生活習慣的改變,NAFLD的發(fā)病率逐漸升高,已經(jīng)成為全球最普遍的肝臟疾病之一。流行學研究表明:全球NAFLD患病率高達25.24%,當前中國患病率約為 29.2%,且年發(fā)病率約為 5.0%,處于不斷增長中[3]。因其臨床表現(xiàn)隱匿而不被人們重視,但其隨著疾病進展不僅能損害肝細胞功能,還對機體其他多個器官功能產(chǎn)生影響,逐漸發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭甚至肝癌等,嚴重威脅人類健康,也同時給社會經(jīng)濟帶來了沉重負擔,已經(jīng)成為全球主要的慢性肝病和公共衛(wèi)生問題。針對NAFLD的西醫(yī)治療,早先認為通過體育鍛煉及飲食控制即可,后逐漸認識到單純控制肝臟脂肪變是不能逆轉肝纖維化的發(fā)生,藥物治療無法代替,但所用藥物一般是保肝、降脂、抗氧化等藥物,缺乏抗肝纖維化或者逆轉肝纖維化功效。然而,中醫(yī)學能從整體出發(fā),在NAFLD的治療上具有獨特優(yōu)勢。

腸肝軸理論是1998年由馬歇爾教授首次提出,是指腸道微生物群和肝臟通過門靜脈循環(huán)相互交流的復雜網(wǎng)絡,該理論來源于胃腸道與肝臟之間密切的解剖及生理關系[4]。近年來,針對腸道微生物與肝臟疾病的研究越來越多,已經(jīng)成為未來肝病領域研究熱點。腸肝軸平衡的維系與腸道微生物及腸道屏障、膽汁酸代謝等密切相關,且各因素之間相輔相成[5]。一旦腸道微生態(tài)構成和功能改變,腸道黏膜的屏障功能受損,其通透性發(fā)生改變,腸道內(nèi)細菌及其代謝產(chǎn)物則可以通過門靜脈到達肝臟,干擾膽汁酸代謝,激活肝臟固有免疫系統(tǒng),進而釋放一系列炎性因子和血管活性物質(zhì),啟動氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,引起肝細胞變性壞死及凋亡[6-8],這些物質(zhì)亦會反向造成腸道黏膜損傷,由此形成惡性循環(huán),與NAFLD的發(fā)病及預后密切相關。其中腸道菌群產(chǎn)生的色氨酸代謝產(chǎn)物是微生物群落和宿主-微生物之間溝通的重要信號分子,可能有助于維持腸道和全身穩(wěn)態(tài)[9]。5-HT由色氨酸代謝而來,其可通過與腸道、肝臟等不同組織器官間各型5-HT受體(5-HT receptor,5-HTR)相結合發(fā)揮調(diào)控作用。當5-HT結合肝臟5-HTR后可降低如腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、 核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)等的水平、調(diào)節(jié)肝巨噬細胞的免疫,抑制炎癥反應,從而避免肝臟受到多種因素攻擊,是目前調(diào)控5-HT信號系統(tǒng)防治NAFLD的重要機制之一[10]。另外,5-HT也作為一種神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控著人體情緒,這與中醫(yī)“肝主疏泄,調(diào)情志”理論不謀而合。

HNF4a是一種配體依賴性轉錄因子,屬于高度保守的核受體超家族一員,在肝臟中強勢表達,是肝細胞重要的標志物[11]。在肝臟,HNF4α能夠參與肝臟結構形成以及膽汁、氨基酸、糖代謝、脂肪代謝等過程,維持肝腸穩(wěn)態(tài),防止飲食誘導的NAFLD形成和進展,其表達缺陷可引起肝細胞形態(tài)和功能分化的異常改變[12];在腸道, HNF4α又是重要的腸道黏膜屏障功能基因,可調(diào)控腸上皮細胞的增殖、分化、凋亡,維持腸道黏膜菌群的穩(wěn)態(tài)[13,14]。

中醫(yī)學中并沒有NAFLD的病名,屬于“肝著、痞滿”等范疇,中醫(yī)認為NAFLD的發(fā)病與飲食失調(diào)、情志失常、勞逸失度等因素有關,這些因素可導致肝失疏泄、脾運失健,痰濕內(nèi)蘊、瘀血阻絡,肝脾同病、肝郁、脾虛、痰濁、痰瘀為其基本病機,發(fā)病部位主要為肝、脾,治療上,《金匱要略》提出“肝病實脾”基礎理論。五行中肝屬木,脾屬土,兩者在生理上互相依賴,在病理上互相影響,肝主疏泄,脾主運化,只有脾氣健運,才能布散水谷精微,滋養(yǎng)肝臟,肝得以疏泄,痰濕、瘀血得散,因此強調(diào)在治肝的同時先調(diào)脾,肝脾同治。有研究表明,腸肝軸功能紊亂是肝脾同病的病理基礎,而中醫(yī)針對肝郁脾虛型NAFLD應用疏肝健脾法治療的現(xiàn)代機制或在于調(diào)節(jié)腸肝軸,通過腸肝軸這一靶點使水谷精微得以布散全身,進而調(diào)節(jié)全身脂質(zhì)代謝治療非酒精性脂肪性肝病[15,16]。

基于NAFLD腸肝軸功能紊亂,以及色氨酸代謝產(chǎn)物5-HT與肝臟HNF4α在腸道菌群、肝臟代謝的重要作用,推測肝臟HNF4α表達與腸道5-HT分泌的失調(diào)可能為腸肝軸功能紊亂的內(nèi)在機制。而腸肝軸作為肝脾同病的病理基礎,肝脾同病作為NAFLD的中醫(yī)發(fā)病基礎,亦推測NAFLD肝郁脾虛證可能與腸道菌群、5-HT、HNF4α存在必然關系,進而參與NAFLD(肝郁脾虛證)的發(fā)病。

本研究發(fā)現(xiàn),NAFLD(肝郁脾虛證)患者存在腸道菌群失調(diào),與健康對照組比較NAFLD(肝郁脾虛證)組血清中存在差異表達的5-HT(P<0.05),肝臟組織中HNF4α存在差異表達,并且差異表達的HNF4α隨著NAFLD嚴重程度的增加,肝臟HNF4α的表達是減少的(P<0.05)。相關性分析發(fā)現(xiàn),腸道菌群失調(diào)與血清5-HT分泌、肝臟HNF4α表達存在相關性。表明了腸道菌群紊亂、肝臟HNF4α表達與腸道5-HT分泌的失調(diào)可能為NAFLD(肝郁脾虛證)腸肝軸功能紊亂相關。肝脾同病的機制內(nèi)涵,將腸肝軸概念具體化,為下一步臨床應用疏肝健脾法治療NAFLD (肝郁脾虛證)提供了科學依據(jù)。

此研究存在一定局限性,一是研究所用腸道菌群多樣性不足;二是差異表達的腸道菌群、5-HT、HNF4α參與NAFLD(肝郁脾虛證)發(fā)病的具體機制不明確。下一步將展開具體研究,探尋具有代表性的菌群,研究腸道菌群失調(diào)與差異分泌的5-HT、差異表達HNF4α是通過何種機制參與NAFLD(肝郁脾虛證)的發(fā)病,揭示臨床疏肝健脾治療NAFLD(肝郁脾虛證)的科學內(nèi)涵。