周 芳 楊建美 龔承先 郭玉飛 張 雪 屈銀宗

非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic Fatty Liver Disease,NAFLD)又稱非酒精性脂肪肝,是指除外酒精和其他明確的肝損害因素所致的,以彌漫性肝細(xì)胞大皰性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,包括遺傳因素和表觀遺傳因素、飲食因素、胰島素抵抗、脂毒性、促炎因子以及腸道微生物組在內(nèi)的“多重打擊”學(xué)說被廣泛接受用于解釋NAFLD 的代謝及分子機(jī)制[1]。近年來,基于中醫(yī)“肝脾同病,肝病治脾”基礎(chǔ)理論,圍繞腸肝軸治療NAFLD的研究越來越多,但仍缺乏深入的分子生物學(xué)研究。本項(xiàng)目基于腸肝軸研究腸道菌群、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、肝細(xì)胞核因子 4α(Hepatocyte Nuclear Factor 4α,HNF4 α)與NAFLD(肝郁脾虛證)的相關(guān)性,為臨床疏肝健脾治療NAFLD(肝郁脾虛證)提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取45例2021年9月—2022年9月湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院消化內(nèi)科門診就診的NAFLD(肝郁脾虛證) 患者,另設(shè)健康對照組45例,來源于湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院體檢中心健康體檢人群。NAFLD(肝郁脾虛證)組:男 31例,女14例;年齡(49±5.30)歲;身體質(zhì)量指數(shù)(24.51±2.37) kg·m-2。健康對照組:男30例,女15例;年齡 (50±4.80) 歲,身體質(zhì)量指數(shù)(25.03±2.09) kg·m-2。2組一般情況比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本研究經(jīng)湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會同意。所有患者均自愿加入本研究并簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn):西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)及非酒精性脂肪性肝病輕、中、重度分級參照《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018更新版)》[2]擬定。中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn):中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療專家共識意見(2017)》[3]中肝郁脾虛證標(biāo)準(zhǔn)擬定。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)①符合NAFLD(肝郁脾虛證)中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)和西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn);②年齡18～65歲。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)①合并有嚴(yán)重的心肝腎疾病;②近4周服用影響血脂代謝藥物;③近4周服用影響腸道菌群的藥物;④合并腸道疾病,如炎癥性腸病、腸易激綜合征等。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 糞便菌群情況用統(tǒng)一發(fā)放的糞便采集杯分別無菌收集2組新鮮糞便樣本2～5 g,于-80 ℃冰箱保存。提取總RNA,在Illumina Hiseq2500測序平臺(廠家:Illumina,型號:2500)進(jìn)行16S rRNA 高通量測序及腸道菌群多樣性分析,分別檢測2組大便腸球菌、大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌拷貝數(shù)。

1.5.2 血清5-HT水平分別采集2組空腹外周血5 ml,經(jīng)離心處理(2800 r/min)離心時間12 min,離心半徑9 cm,按照試劑盒要求采用酶聯(lián)免疫吸附法測定2組血清中5-HT的情況。

1.5.3 NAFLD(肝郁脾虛證)患者肝臟組織HNF4α的表達(dá)情況45例NAFLD(肝郁脾虛證)患者在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮肝臟穿刺吸取活組織,進(jìn)行肝臟脂肪含量測定及病理檢查。根據(jù)肝臟脂肪含量測定結(jié)果參照《非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018更新版)》[2]標(biāo)準(zhǔn)將NAFLD患者分為輕度、中度、重度3組。按照免疫組化染色試劑盒要求,在顯微鏡下10×10視野觀察各組標(biāo)本,以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。每張切片鏡下隨時選取5個視野觀察陽性產(chǎn)物分布、染色情況。對每例切片,按照半定量積分法判斷結(jié)果。此部分將會由湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院2名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)生閱片完成,2人結(jié)論一致時則記錄結(jié)果,當(dāng)出現(xiàn)爭議結(jié)果的時候,則請第3名病理科醫(yī)生進(jìn)行閱片,以2個意見相同者為準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 2組患者腸道菌群拷貝數(shù)比較與健康對照組比較,NAFLD(肝郁脾虛證)組腸道中腸球菌、大腸桿菌明顯增多,乳酸桿菌及雙歧桿菌均明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 2組患者腸道菌群拷貝數(shù)比較

2.2 2組患者血清5-HT水平比較與健康對照組比較,NAFLD(肝郁脾虛證)組血清中5-HT的水平明顯更高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義 (P<0.05)。見表2。

表2 2組患者血清5-HT水平比較

2.3 NAFLD(肝郁脾虛證)組患者肝臟組織HNF4α表達(dá)比較根據(jù)肝臟組織學(xué)活檢將45例NAFLD(肝郁脾虛證)患者分為輕、中、重組,觀察各組肝臟組織HNF4α陽性積分,發(fā)現(xiàn)隨著NAFLD患者疾病嚴(yán)重程度的遞增,HNF4α陽性積分逐漸減少,NAFLD重度組與輕度組、中度組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),NAFLD中度組與輕度組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

2.4 NAFLD(肝郁脾虛證)與腸道菌群/5-HT/HNF4α的相關(guān)性分析NAFLD(肝郁脾虛證)患者腸道菌群與血清5-HT相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),腸球菌、大腸桿菌與5-HT呈正相關(guān)(r=0.7532,P<0.05;r=0.9216,P<0.05);乳酸桿菌、雙歧桿菌與5-HT呈負(fù)相關(guān)(r=-0.8228,P<0.05;r=-0.8543,P<0.05)。見圖1。腸道菌群與肝臟HNF4α相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),腸球菌、大腸桿菌與HNF4α呈負(fù)相關(guān)(r=-0.7567,P<0.05;r=-0.5628,P<0.05);乳酸桿菌、雙歧桿菌與HNF4α呈正相關(guān)(r=0.4235,P<0.05;r=0.4887,P<0.05)。見圖2。血清5-HT與肝臟HNF4α的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),兩者呈負(fù)相關(guān)(r=-0.6858,P<0.05)。見圖3。提示,腸道菌群失調(diào)與血清5-HT分泌、肝臟HNF4α表達(dá)存在相關(guān)性。

圖1 NAFLD(肝郁脾虛證)患者腸道菌群與血清5-HT的相關(guān)性分析

圖2 NAFLD(肝郁脾虛證)患者腸道菌群與肝臟HNF4α的相關(guān)性分析

圖3 NAFLD(肝郁脾虛證)患者血清5-HT與肝臟HNF4α的相關(guān)性分析

3 討論

隨著人類飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變,NAFLD的發(fā)病率逐漸升高,已經(jīng)成為全球最普遍的肝臟疾病之一。流行學(xué)研究表明:全球NAFLD患病率高達(dá)25.24%,當(dāng)前中國患病率約為 29.2%,且年發(fā)病率約為 5.0%,處于不斷增長中[3]。因其臨床表現(xiàn)隱匿而不被人們重視,但其隨著疾病進(jìn)展不僅能損害肝細(xì)胞功能,還對機(jī)體其他多個器官功能產(chǎn)生影響,逐漸發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭甚至肝癌等,嚴(yán)重威脅人類健康,也同時給社會經(jīng)濟(jì)帶來了沉重負(fù)擔(dān),已經(jīng)成為全球主要的慢性肝病和公共衛(wèi)生問題。針對NAFLD的西醫(yī)治療,早先認(rèn)為通過體育鍛煉及飲食控制即可,后逐漸認(rèn)識到單純控制肝臟脂肪變是不能逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生,藥物治療無法代替,但所用藥物一般是保肝、降脂、抗氧化等藥物,缺乏抗肝纖維化或者逆轉(zhuǎn)肝纖維化功效。然而,中醫(yī)學(xué)能從整體出發(fā),在NAFLD的治療上具有獨(dú)特優(yōu)勢。

腸肝軸理論是1998年由馬歇爾教授首次提出,是指腸道微生物群和肝臟通過門靜脈循環(huán)相互交流的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),該理論來源于胃腸道與肝臟之間密切的解剖及生理關(guān)系[4]。近年來,針對腸道微生物與肝臟疾病的研究越來越多,已經(jīng)成為未來肝病領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。腸肝軸平衡的維系與腸道微生物及腸道屏障、膽汁酸代謝等密切相關(guān),且各因素之間相輔相成[5]。一旦腸道微生態(tài)構(gòu)成和功能改變,腸道黏膜的屏障功能受損,其通透性發(fā)生改變,腸道內(nèi)細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物則可以通過門靜脈到達(dá)肝臟,干擾膽汁酸代謝,激活肝臟固有免疫系統(tǒng),進(jìn)而釋放一系列炎性因子和血管活性物質(zhì),啟動氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,引起肝細(xì)胞變性壞死及凋亡[6-8],這些物質(zhì)亦會反向造成腸道黏膜損傷,由此形成惡性循環(huán),與NAFLD的發(fā)病及預(yù)后密切相關(guān)。其中腸道菌群產(chǎn)生的色氨酸代謝產(chǎn)物是微生物群落和宿主-微生物之間溝通的重要信號分子,可能有助于維持腸道和全身穩(wěn)態(tài)[9]。5-HT由色氨酸代謝而來,其可通過與腸道、肝臟等不同組織器官間各型5-HT受體(5-HT receptor,5-HTR)相結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。當(dāng)5-HT結(jié)合肝臟5-HTR后可降低如腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)、 核因子κB(Nuclear factor kappa-B,NF-κB)等的水平、調(diào)節(jié)肝巨噬細(xì)胞的免疫,抑制炎癥反應(yīng),從而避免肝臟受到多種因素攻擊,是目前調(diào)控5-HT信號系統(tǒng)防治NAFLD的重要機(jī)制之一[10]。另外,5-HT也作為一種神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)控著人體情緒,這與中醫(yī)“肝主疏泄,調(diào)情志”理論不謀而合。

HNF4a是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子,屬于高度保守的核受體超家族一員,在肝臟中強(qiáng)勢表達(dá),是肝細(xì)胞重要的標(biāo)志物[11]。在肝臟,HNF4α能夠參與肝臟結(jié)構(gòu)形成以及膽汁、氨基酸、糖代謝、脂肪代謝等過程,維持肝腸穩(wěn)態(tài),防止飲食誘導(dǎo)的NAFLD形成和進(jìn)展,其表達(dá)缺陷可引起肝細(xì)胞形態(tài)和功能分化的異常改變[12];在腸道, HNF4α又是重要的腸道黏膜屏障功能基因,可調(diào)控腸上皮細(xì)胞的增殖、分化、凋亡,維持腸道黏膜菌群的穩(wěn)態(tài)[13,14]。

中醫(yī)學(xué)中并沒有NAFLD的病名,屬于“肝著、痞滿”等范疇,中醫(yī)認(rèn)為NAFLD的發(fā)病與飲食失調(diào)、情志失常、勞逸失度等因素有關(guān),這些因素可導(dǎo)致肝失疏泄、脾運(yùn)失健,痰濕內(nèi)蘊(yùn)、瘀血阻絡(luò),肝脾同病、肝郁、脾虛、痰濁、痰瘀為其基本病機(jī),發(fā)病部位主要為肝、脾,治療上,《金匱要略》提出“肝病實(shí)脾”基礎(chǔ)理論。五行中肝屬木,脾屬土,兩者在生理上互相依賴,在病理上互相影響,肝主疏泄,脾主運(yùn)化,只有脾氣健運(yùn),才能布散水谷精微,滋養(yǎng)肝臟,肝得以疏泄,痰濕、瘀血得散,因此強(qiáng)調(diào)在治肝的同時先調(diào)脾,肝脾同治。有研究表明,腸肝軸功能紊亂是肝脾同病的病理基礎(chǔ),而中醫(yī)針對肝郁脾虛型NAFLD應(yīng)用疏肝健脾法治療的現(xiàn)代機(jī)制或在于調(diào)節(jié)腸肝軸,通過腸肝軸這一靶點(diǎn)使水谷精微得以布散全身,進(jìn)而調(diào)節(jié)全身脂質(zhì)代謝治療非酒精性脂肪性肝病[15,16]。

基于NAFLD腸肝軸功能紊亂,以及色氨酸代謝產(chǎn)物5-HT與肝臟HNF4α在腸道菌群、肝臟代謝的重要作用,推測肝臟HNF4α表達(dá)與腸道5-HT分泌的失調(diào)可能為腸肝軸功能紊亂的內(nèi)在機(jī)制。而腸肝軸作為肝脾同病的病理基礎(chǔ),肝脾同病作為NAFLD的中醫(yī)發(fā)病基礎(chǔ),亦推測NAFLD肝郁脾虛證可能與腸道菌群、5-HT、HNF4α存在必然關(guān)系,進(jìn)而參與NAFLD(肝郁脾虛證)的發(fā)病。

本研究發(fā)現(xiàn),NAFLD(肝郁脾虛證)患者存在腸道菌群失調(diào),與健康對照組比較NAFLD(肝郁脾虛證)組血清中存在差異表達(dá)的5-HT(P<0.05),肝臟組織中HNF4α存在差異表達(dá),并且差異表達(dá)的HNF4α隨著NAFLD嚴(yán)重程度的增加,肝臟HNF4α的表達(dá)是減少的(P<0.05)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),腸道菌群失調(diào)與血清5-HT分泌、肝臟HNF4α表達(dá)存在相關(guān)性。表明了腸道菌群紊亂、肝臟HNF4α表達(dá)與腸道5-HT分泌的失調(diào)可能為NAFLD(肝郁脾虛證)腸肝軸功能紊亂相關(guān)。肝脾同病的機(jī)制內(nèi)涵,將腸肝軸概念具體化,為下一步臨床應(yīng)用疏肝健脾法治療NAFLD (肝郁脾虛證)提供了科學(xué)依據(jù)。

此研究存在一定局限性,一是研究所用腸道菌群多樣性不足;二是差異表達(dá)的腸道菌群、5-HT、HNF4α參與NAFLD(肝郁脾虛證)發(fā)病的具體機(jī)制不明確。下一步將展開具體研究,探尋具有代表性的菌群,研究腸道菌群失調(diào)與差異分泌的5-HT、差異表達(dá)HNF4α是通過何種機(jī)制參與NAFLD(肝郁脾虛證)的發(fā)病,揭示臨床疏肝健脾治療NAFLD(肝郁脾虛證)的科學(xué)內(nèi)涵。