王亮,田玉潭,劉軍,鄭安然,毛筱藝,吳迅,劉敦華,*

1(寧夏大學(xué) 食品與葡萄酒學(xué)院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川,750021)

畜禽鮮骨是畜禽肉加工過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物,富含極高的營養(yǎng)價值[1]。我國肉雞總產(chǎn)量居世界前列,雞骨資源非常豐富,雞骨中含有約51%的水分、19%的蛋白質(zhì)和15%的灰分,目前,我國有少部分雞骨被加工成骨粉、骨泥等低價值產(chǎn)品,并沒有實現(xiàn)雞骨的高值化利用,造成了蛋白資源浪費(fèi)[2]。

研究表明,雞骨被酶水解后,蛋白質(zhì)被催化分解,釋放出大量的呈味游離氨基酸,是風(fēng)味物質(zhì)的重要前體物,具有制作調(diào)味料基料的潛質(zhì)[3]。此外,發(fā)酵技術(shù)有助于促進(jìn)雞骨中風(fēng)味前體物的產(chǎn)生,可以改善產(chǎn)品的風(fēng)味[4]。而通過酶解-發(fā)酵聯(lián)用技術(shù)能夠改善產(chǎn)品風(fēng)味,產(chǎn)生功能性物質(zhì),因此利用酶解-發(fā)酵技術(shù)制備肉類風(fēng)味香精具有廣闊的應(yīng)用前景。

YANG等[5]研究表明超聲預(yù)處理草魚蛋白水解物后,可以促進(jìn)草魚蛋白水解物發(fā)生美拉德反應(yīng),并且可以改善美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的風(fēng)味。美拉德反應(yīng)能夠改善蛋白質(zhì)水解物的風(fēng)味、穩(wěn)定性、溶解性、黏度等功能特性,同時影響美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性、抑菌性、降血壓、消化性等性質(zhì)[6]。蛋白酶水解和美拉德反應(yīng)的結(jié)合可以有效改善產(chǎn)品的風(fēng)味:降低雞骨提取物的口味,改善口感、新鮮度[6]。蛋白質(zhì)水解物的美拉德反應(yīng)涉及許多因素,包括游離氨基和羰基的比例、溫度、時間、pH值等,此外,研究發(fā)現(xiàn)超聲處理、微波處理等外在的處理方式會影響美拉德反應(yīng)速率。超聲波通過機(jī)械作用、空化效應(yīng)作用于反應(yīng)物質(zhì),產(chǎn)生巨大的壓力、剪切應(yīng)力、動態(tài)攪拌和溫度梯度,超聲協(xié)同熱處理改變了空間結(jié)構(gòu),加快分子間的反應(yīng)速度,促進(jìn)了美拉德反應(yīng)的進(jìn)行[7]。目前,關(guān)于美拉德反應(yīng)制備雞骨香精基料的研究較少,因此,對雞骨香精基料及其活性的研究具有重要意義。

本實驗以雞骨為原料,加入木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行酶解,接種發(fā)酵劑,制成雞骨酶解發(fā)酵液,在此基礎(chǔ)上添加糖和氨基酸進(jìn)行美拉德反應(yīng),制成雞骨香精基料,對比熱處理、超聲協(xié)同熱處理制備雞骨香精基料的美拉德反應(yīng)體系及揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量,并測定雞骨香精基料的抗氧化活性、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制活性、膽固醇抑制率等活性,旨在明確超聲處理對雞骨香精基料美拉德反應(yīng)程度及活性的影響,以期為開發(fā)具有抗氧化活性和抑制活性的高品質(zhì)肉味衍生化產(chǎn)品提供一定參考,并實現(xiàn)雞骨的高值化利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞骨架購于銀川市同心路綜合市場;木瓜蛋白酶(100 000 U/g)、風(fēng)味蛋白酶(15 000 U/g)(食品級),夏盛生物科技開發(fā)有限公司;植物乳桿菌凍干粉,濟(jì)南金雨源生物技術(shù)有限公司;戊糖片球菌凍干粉,上海北諾有限公司;D-木糖、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-精氨酸、維生素C、維生素B1、酵母抽提物(食品級),英博生物科技有限公司;葡萄糖(食品級),濟(jì)南銘鋒生物科技有限公司;食鹽(食品級),銀川聚信匯科生物技術(shù)有限公司;ABTS,上海麥克林生化科技有限公司;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶、馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu,HHL),美國Sigma試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SE-150型高速萬能粉碎機(jī),北京科一電器有限公司;LRH-150-B型生化培養(yǎng)箱,廣州瑞豐實驗設(shè)備有限公司;DSX-280型手提式壓力蒸汽滅菌鍋,山東歐萊博醫(yī)療器械;pHS-2F型pH計、970CRT型熒光分光光度計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器,河南博匯機(jī)械設(shè)備有限公司;DP-400型色差儀,柯尼卡美能達(dá)公司;UV-18000304042502型紫外可見光分光光度計,日本島津;Agilent 5975GC-MSD型氣質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜儀 安捷倫科技有限公司;GL-10C型高速冷凍離心機(jī),濟(jì)南好來寶醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 雞骨香精基料制備

在前期研究[8]的基礎(chǔ)上,建立雞骨酶解發(fā)酵液美拉德反應(yīng)體系。向雞骨泥中添加木瓜蛋白酶8.15 g/kg,55 ℃條件下水解4 h,風(fēng)味蛋白酶8 g/kg,55 ℃條件下水解3 h,酶解完成后在90 ℃條件下進(jìn)行滅菌,得到雞骨酶解液,接入發(fā)酵劑(植物乳桿菌：戊糖片球菌為1：1),發(fā)酵溫度為33 ℃,發(fā)酵劑接種量為6%,發(fā)酵時間為49 h,得到雞骨酶解發(fā)酵液;香精配料為:L-半胱氨酸和酵母提取物2%,L-丙氨酸1%,L-精氨酸2.5%,維生素C和維生素B10.8%,木糖和葡萄糖3%,食鹽0.6%,放入美拉德反應(yīng)瓶中,使原料全部溶解,調(diào)節(jié)pH值至6.0,置于105 ℃油浴鍋中反應(yīng)50 min,發(fā)生美拉德反應(yīng)得到雞骨香精基料。每10 min從油浴鍋中取美拉德反應(yīng)產(chǎn)物,用冰浴停止反應(yīng),用高速冷凍離心機(jī)以10 000 r/min離心10 min,得到測試原液,測定美拉德反應(yīng)程度及生物活性。

1.3.2 超聲協(xié)同熱處理

參考劉偉[9]的方法,先將雞骨酶解發(fā)酵液超聲處理30 min,超聲條件為:超聲功率因數(shù)60%(900 W),超聲溫度保持在(60±3) ℃,再置于105 ℃油浴鍋中熱處理50 min發(fā)生美拉德反應(yīng)。

1.3.3 色澤測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,使用色度計測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的顏色,色度計的校準(zhǔn)使用白色標(biāo)準(zhǔn)板(L*=95.28,a*=-0.14,b*=0.95)。

1.3.4 中間產(chǎn)物的測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,取測試原液用去離子水稀釋20倍,于最大吸收波長294 nm處測定吸光度。

1.3.5 褐變程度的測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,取測試原液用去離子水稀釋20倍,于最大吸收波長420 nm處測定吸光度。

1.3.6 熒光光譜的測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,取測試原液稀釋16倍,用熒光分光光度計進(jìn)行測定:熒光光譜激發(fā)波長為417 nm,掃描發(fā)射波長為200～450 nm,狹縫寬度為10 nm,靈敏度為1。

1.3.7 揮發(fā)性物質(zhì)的測定

參考依勝男等[11]的方法并略作修改,固相微萃取(DVB/CAR/PDMS 50 μm):取5 mL雞骨香精基料置于20 mL的頂空瓶中,溫度50 ℃,水浴平衡10 min,頂空吸附30 min,進(jìn)樣分析,解析5 min,溫度為250 ℃。

GC條件:DB-5MS毛細(xì)管柱(30 mm×0.25 mm×0.5 μm,Agilent Techonologies),載氣為高純氦氣,起始溫度設(shè)定為40 ℃,持續(xù)3 min后,以5 ℃/min升溫到230 ℃,持續(xù)3 min,共40 min。恒定流速為1.2 mL/min,不分流。

MS條件:GC-MS接口溫度為200 ℃,質(zhì)譜庫NIST17.L,質(zhì)譜質(zhì)量掃描范圍40～450 amu。各揮發(fā)性物質(zhì)相對含量(%)按照峰面積歸一化法計算。

1.3.8 抗氧化活性的測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除活性的測定

參考XIONG等[12]的方法并略作修改,將超聲協(xié)同熱處理制備的測試原液稀釋20倍,取2 mL加入2.0 mL DPPH溶液(0.20 mmol/L),振蕩混勻,置于陰涼處避光靜置30 min,于最大吸收波長517 nm處測定其吸光度,陽性對照為樣液與無水乙醇溶液以及無水乙醇與DPPH溶液。

1.3.8.2 超氧陰離子自由基清除活性的測定

參考張亞琨等[13]的方法,取5 mL Tris-HCl(0.05 mol/L)緩沖溶液,25 ℃下預(yù)熱20 min,將超聲協(xié)同熱處理制備的測試原液稀釋20倍,取1 mL加入500 μL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L),混合均勻,繼續(xù)反應(yīng)5 min,添加1 mL鹽酸(8 mmol/L)停止反應(yīng),于最大吸收波長299 nm處測定吸光度。

1.3.8.3 ABTS陽離子自由基清除活性的測定

參考TAN等[10]的方法并略作修改,取0.352 mL K2S2O8溶液(140 mmol/L)和20 mL ABTS陽離子溶液(7 mmol/L),在室溫下避光反應(yīng)12～16 h,用無水乙醇稀釋至在734 nm處的吸光度為0.7±0.02,取5 mL該溶液,將測試原液稀釋20倍,取50 μL樣液與之混合,在室溫下避光反應(yīng)6 min,于734 nm處測定吸光度。

1.3.9 ACE抑制活性的測定

參考LI等[14]的方法并略作修改,反應(yīng)開始后,每間隔10 min取超聲協(xié)同熱處理制備的測試原液15 μL,添加30 μL HHL(2 mg/mL)溶液和ACE酶液(12.5 mg/mL),置于96孔酶標(biāo)板,混合均勻后在37 ℃條件下反應(yīng)60 min,立即加入120 μL NaOH(1.2 mol/L)溶液停止反應(yīng),加入30 μL 2%的鄰苯二甲醛溶液,混合均勻,室溫下靜置20 min,添加30 μL的HCl(6 mol/L)溶液停止反應(yīng)。測定熒光強(qiáng)度:激發(fā)波長340 nm,掃描發(fā)射波長300～600 nm,狹縫寬度10 nm,靈敏度為2。

1.3.10 體外降膽固醇能力的測定

參考李晶等[15]的方法并略作修改,制備1 mg/mL的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)液,配制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,測定混合液在550 nm處的吸光度,以膽固醇濃度為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程。根據(jù)不加測試原液的膽固醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值A(chǔ)0,添加與之相同量的測試原液測得吸光度A1,帶入回歸方程得到美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的膽固醇濃度ω0和ω1,計算膽固醇抑制率,如公式(1)所示:

(1)

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗進(jìn)行3次平行,采用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計并做標(biāo)準(zhǔn)差,采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,P<0.05表示差異顯著,采用Origin 2019對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 色澤分析

美拉德反應(yīng)底物的糖基化程度可以通過反應(yīng)過程中的顏色變化來判斷[10]。由圖1可知,不同處理方式不同反應(yīng)時間之間的a*、b*、L*在反應(yīng)第10～50 min時差異性均顯著(P<0.05)。隨熱反應(yīng)時間延長,各處理組雞骨香精基料的L*值呈下降趨勢,a*值呈上升趨勢,b*值呈降低趨勢,說明隨反應(yīng)時間延長,雞骨香精基料的色澤逐漸變暗,紅色加深,黃色變淺,這是由于加熱時間延長,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物不斷增加,類黑精物質(zhì)累計,導(dǎo)致顏色不斷加深,且加熱時間增加,美拉德反應(yīng)程度越高,顏色變化越明顯。另外,超聲協(xié)同熱處理組的a*值始終高于熱處理組,L*值在反應(yīng)第20 min時高于熱處理組,剩余時間均低于熱處理組,b*值在反應(yīng)第10 min時高于熱處理組,剩余時間均低于熱處理組,說明經(jīng)超聲處理過的雞骨香精基料色澤較暗,亮度更低。美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的棕色黑色素會使L*持續(xù)下降,由于黑色素的積累,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物會產(chǎn)生紅色和黃色。經(jīng)超聲處理后,雞骨蛋白的三級結(jié)構(gòu)得到更廣泛的擴(kuò)展,使美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有更好的溶解性,有利于顏色產(chǎn)生;超聲波的物理和機(jī)械作用改變了雞骨香精基料的蛋白質(zhì)性質(zhì),這可能會加速美拉德反應(yīng)過程,導(dǎo)致黑色素增加,因此色澤變化更為明顯[16]。

a-L*;b-a*;c-b*圖1 雞骨香精基料的色澤變化Fig.1 Changes of color of chicken bone essence basic material注:同一種處理方式不同反應(yīng)時間之間的差異性用小寫字母表示(P<0.05),同一反應(yīng)時間不同處理方式之間的差異性用大寫字母表示(P<0.05)。

2.2 中間產(chǎn)物及褐變程度分析

雞骨香精基料中間產(chǎn)物及褐變程度的變化如圖2所示。在美拉德反應(yīng)中產(chǎn)生的二羰基化合物(如酮類和醛類)可在294 nm處進(jìn)行測量[17],可反映美拉德反應(yīng)的中間產(chǎn)物變化。由于色素產(chǎn)物的形成,美拉德反應(yīng)通常伴隨著褐變,因此褐變程度(A420 nm)可以反映樣品美拉德反應(yīng)的劇烈程度[17]。由圖2可知,超聲協(xié)同熱處理組的樣品其在294、420 nm處的吸光度始終高于熱處理組,且隨著時間延長而增加,中間產(chǎn)物的變化趨勢與褐變程度相一致,原因可能是因為雞骨蛋白被酶解后,三級結(jié)構(gòu)被破壞,蛋白質(zhì)鏈上的氨基裸露出來,然后在酶的作用下,蛋白鏈的肽鍵被破壞,分解為小分子的肽鏈或游離氨基酸,而超聲處理改變了雞骨蛋白的高級結(jié)構(gòu),促進(jìn)了雞骨的酶解,產(chǎn)生了更多肽和氨基酸[17]。因此可得出結(jié)論:超聲協(xié)同熱處理可使雞骨香精基料美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的中間產(chǎn)物和褐變程度增強(qiáng),類黑精含量增多。

a-中間產(chǎn)物;b-褐變程度圖2 雞骨香精基料A294nm吸光度及褐變程度的變化Fig.2 Changes of intermediate products and browning degree of chicken bone essence basic material

2.3 熒光光譜分析

不同處理方式對雞骨香精基料熒光光譜如圖3所示。熒光化合物出現(xiàn)在可見棕色色素形成之前,因此可用作美拉德反應(yīng)初始階段的指示劑[17]。由圖3可知,不同反應(yīng)時間產(chǎn)生的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物其熒光光譜僅呈現(xiàn)單峰,且各處理組雞骨香精基料的熒光強(qiáng)度隨著時間延長呈現(xiàn)逐步增長的趨勢,當(dāng)處理時間為50 min時,熱處理和超聲協(xié)同熱處理的樣品熒光強(qiáng)度均達(dá)到峰值(414 nm處),分別為127、238,表明隨著加熱時間延長,美拉德反應(yīng)過程中產(chǎn)生了更多的熒光化合物,考慮原因可能是隨著加熱時間延長,蛋白質(zhì)的肽鍵被破壞,暴露出更多的酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)殘基,酪蛋白發(fā)生去折疊現(xiàn)象,使更多具有熒光吸收能力的苯環(huán)基團(tuán)裸露,從而增加了對熒光的吸收,使熒光強(qiáng)度增加。而在熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值后熒光強(qiáng)度的降低可能是因為木糖與蛋白酶解物發(fā)生共價反應(yīng),美拉德產(chǎn)物的空間位阻增加,氨基酸吸收熒光的信號被屏蔽,使熒光強(qiáng)度降低[18],也有學(xué)者認(rèn)為熒光化合物是美拉德反應(yīng)混合物的前體,而不是最終產(chǎn)物[19]。LI等[19]對山藥多糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)山藥多糖美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度在426 nm處達(dá)到峰值,達(dá)到最大值后熒光強(qiáng)度呈下降趨勢,與本實驗結(jié)論相一致。另外,經(jīng)超聲預(yù)處理的樣品,熒光強(qiáng)度始終高于熱處理的樣品,考慮原因可能是超聲使蛋白質(zhì)分子鏈伸展,蛋白質(zhì)分子之間的疏水鍵被破壞,暴露出更多的疏水性基團(tuán),進(jìn)而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度增加[17],因此超聲協(xié)同熱處理有利于美拉德反應(yīng)生成熒光化合物,促進(jìn)美拉德反應(yīng)的進(jìn)行。

a-熱處理;b-超聲協(xié)同熱處理圖3 雞骨香精基料熒光光譜的變化Fig.3 Changes in the fluorescence spectra of chicken bone essence basic material

2.4 揮發(fā)性物質(zhì)分析

不同處理方式的雞骨香精基料揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖如圖4所示。結(jié)合圖4和表1容易看出,熱處理過的雞骨香精基料美拉德反應(yīng)體系共檢測出22種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì);超聲協(xié)同熱處理過的雞骨香精基料美拉德反應(yīng)體系共檢測出26種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)?？煞譃槠哳?其中醛類物質(zhì)5種、醇類物質(zhì)4種、酮類物質(zhì)2種、酚類物質(zhì)1種、酯類物質(zhì)3種、烷烴類物質(zhì)7種、雜環(huán)類化合物10種。熱處理組中烷烴類占比最高,相對含量為34.77%,雜環(huán)類次之,占比為22.81%;超聲協(xié)同熱處理組中同樣烷烴類和雜環(huán)類占比最高,分別為30.30%、24.44%。

表1 美拉德反應(yīng)體系中的揮發(fā)性物質(zhì)Table 1 Volatile substances in Maillard reaction system

a-熱處理;b-超聲協(xié)同熱處理圖4 雞骨香精基料揮發(fā)性物質(zhì)總離子流圖Fig.4 The total ion current diagrams of volatile substances in chicken bone essence basic material

SUN等[20]證明用雞骨的美拉德反應(yīng)制作的廣東香腸具有良好的質(zhì)地和感官特性,也有論文描述了從海鮮副產(chǎn)品和羊骨中制備風(fēng)味化合物[21-22]。研究發(fā)現(xiàn),醛類物質(zhì)主要來自脂肪的氧化分解以及戊糖和氨基酸的熱降解,由于醛的氣味閾值極低,因此,醛類物質(zhì)是美拉德反應(yīng)體系極重要的芳香化合物,其中苯甲醛具有堅果和水果香氣[23]。由表1可以看出,超聲處理過的樣品,醛類物質(zhì)含量較高。含硫化合物主要提供低閾值的肉類風(fēng)味,醇類物質(zhì)也是美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中重要的揮發(fā)性化合物,1-辛烯-3-醇可以改善或增強(qiáng)肉類風(fēng)味,且只在超聲處理過的樣品中檢測到了1-辛烯-3-醇。而醇酮類、酚類物質(zhì)相對含量較低,這些物質(zhì)氣味閾值較高,對產(chǎn)物香氣無明顯影響,但可以協(xié)調(diào)補(bǔ)充產(chǎn)物的整體香氣。雜環(huán)類化合物相對含量最高,而且雜環(huán)類化合物閾值較低,很有可能是雞骨香精基料中的主體風(fēng)味物質(zhì),呋喃類化合物是肉制品的主要雜環(huán)化合物,主要提供燒烤和海鮮風(fēng)味,且超聲處理過的雞骨酶解發(fā)酵液,其呋喃類化合物含量較高,這可能與超聲協(xié)同熱處理過程中,木糖環(huán)化的加劇有關(guān),其他雜環(huán)類化合物也貢獻(xiàn)烤香、焦甜香、堅果香、肉香等風(fēng)味,其中2-戊基-呋喃相對含量最高,呈現(xiàn)豆腥味[24]。美拉德反應(yīng)體系中最重要的呈味物質(zhì)是醛類和雜環(huán)類化合物,超聲處理得到的雞骨香精基料中醛類化合物和雜環(huán)類化合物均高于熱處理組,同樣證明超聲可促進(jìn)美拉德反應(yīng)的發(fā)生。

2.5 抗氧化活性分析

由圖5可知,隨著時間延長,雞骨香精基料的抗氧化活性呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。DPPH自由基清除率在反應(yīng)第20 min時最高,為95.45%,ABTS陽離子自由基、超氧陰離子自由基清除率在反應(yīng)進(jìn)行到30 min時最高,分別為83.82%和90.63%?？寡趸钚栽黾拥脑蚩赡苁敲览路磻?yīng)產(chǎn)物中一些還原性化合物的氫鍵被破壞,使更多羥基裸露出來,從而提供氫電子,氫電子的還原性對其他物質(zhì)發(fā)生氧化具有抑制作用[12]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中類黑精的抗氧化特性部分歸因于這些化合物的金屬螯合能力,類黑精的陰離子能夠螯合過渡金屬,另外,類黑精組分可以清除多種活性氧,可清除自由基[25]。美拉德反應(yīng)產(chǎn)物通過提供氫清除DPPH自由基,形成穩(wěn)定的DPPH-H分子。通過接受美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中的氫自由基,DPPH的顏色從紫色變?yōu)辄S色,從而形成穩(wěn)定的分子[15]。ABTS陽離子自由基的主要清除機(jī)制是電子轉(zhuǎn)移,抗氧化劑為ABTS陽離子自由基提供電子以產(chǎn)生聚合物產(chǎn)品,并將ABTS陽離子溶液的顏色從綠色變?yōu)闊o色[15],這些結(jié)果可以表明,美拉德反應(yīng)和發(fā)酵水解破壞了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu),可以對雞骨酶解發(fā)酵液的還原能力產(chǎn)生積極影響。此外,超聲波作用增強(qiáng)了氨基和羰基之間的分子運(yùn)動,產(chǎn)生更多的抗氧化劑,這些結(jié)果可以表明超聲可以改變美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抗氧化性能[12]。抗氧化活性降低的原因可能是在反應(yīng)后期,大量的氨基酸、多肽被消耗,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物減少,這也可能導(dǎo)致抗氧化活性降低。

圖5 雞骨香精基料的自由基清除活性Fig.5 Radical scavenging activity of chicken bone essence basic material

2.6 ACE抑制活性分析

由圖6可知,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的ACE抑制活性呈先上升后下降的趨勢,與自由基清除活性的變化趨勢相一致。ACE在調(diào)節(jié)動脈血壓中起關(guān)鍵作用,血管緊張素Ⅰ由腎素水解產(chǎn)生,ACE可催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為血管緊張素Ⅱ(血管收縮劑),血管緊張素Ⅱ可使具有血管舒張作用的緩激肽失活,還能與血管緊張素Ⅱ 1型(AT1)受體結(jié)合,導(dǎo)致血管收縮和血壓升高[26]。反應(yīng)至40 min時,ACE抑制活性由53.25%增加到89.997%,ACE抑制活性增加的原因可能是超聲空化效應(yīng)使蛋白分子的分散性增加,加速了美拉德反應(yīng)過程中具有ACE抑制活性的物質(zhì)釋放,導(dǎo)致ACE抑制活性增加,在反應(yīng)至50 min時,ACE抑制活性降低至84.39%,原因可能是美拉德反應(yīng)消耗了具有ACE抑制活性的肽,導(dǎo)致ACE抑制活性降低[26]。研究發(fā)現(xiàn),美拉德反應(yīng)產(chǎn)物類黑精具有ACE抑制作用,目前,已經(jīng)研究了從咖啡、啤酒、甜酒中分離的純類黑素的體外ACE抑制活性,具備潛在的抗高血壓活性[26]。LI等[27]研究發(fā)現(xiàn),大豆分離物具有ACE抑制活性,從中分離鑒定出一種化合物C15H21NO7,推測是苯丙氨酸與葡萄糖通過美拉德反應(yīng)形成的共軛物,證實了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在豆瓣醬ACE抑制活性中的重要作用。

圖6 雞骨香精基料的ACE抑制活性Fig.6 ACE inhibitory activity of chicken bone essence basic material

2.7 體外降膽固醇能力分析

由圖7可知,隨反應(yīng)時間延長,美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的體外降膽固醇能力在10～50 min呈上升趨勢。這可能是由于隨反應(yīng)時間延長,美拉德反應(yīng)程度加劇,美拉德反應(yīng)體系中類黑精物質(zhì)及其他生物活性物質(zhì)不斷積累,改善了雞骨香精基料的降膽固醇能力,另一方面,膽固醇抑制活性與肽的疏水性有關(guān),超聲能夠使雞骨蛋白中的疏水基團(tuán)外露,從而提高雞骨香精基料的降膽固醇能力[28]。PAK等[29]確定疏水性是導(dǎo)致膽固醇降低的關(guān)鍵因素,而脯氨酸殘基是關(guān)鍵的組成部分,此外,疏水性和與膽汁酸結(jié)合的能力之間的相關(guān)性表明,具有高膽汁酸結(jié)合能力的多肽可以抑制回腸中膽汁酸的吸收并降低血清膽固醇水平。還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)美拉德反應(yīng)協(xié)同發(fā)酵顯著提高了乳蛋白的抗血栓活性水平和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制作用,但并未改變膠束膽固醇溶解度的活性水平,同時美拉德反應(yīng)增強(qiáng)了乳蛋白的抗氧化性能,確定了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物中產(chǎn)生的小分子大小的化合物,這些化合物具有更高的心血管預(yù)防作用,因此,發(fā)酵的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可用于降低氧化應(yīng)激,血小板聚集和膽固醇合成[30]。但是關(guān)于美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的抑制機(jī)理還未有明確報道,需要進(jìn)一步探究。

圖7 雞骨香精基料的體外降膽固醇能力Fig.7 Cholesterol lowering ability of chicken bone essence basic material

3 結(jié)論

本研究基于美拉德反應(yīng)制備雞骨香精基料,分析超聲預(yù)處理對雞骨酶解發(fā)酵液制備雞骨香精基料的影響及雞骨香精基料的生物活性。結(jié)果表明,超聲預(yù)處理對雞骨香精基料的美拉德反應(yīng)具有積極影響,促進(jìn)了美拉德反應(yīng)的發(fā)生。GC-MS檢測到呋喃類化合物、1-辛烯-3-醇等對風(fēng)味有重要影響的揮發(fā)性物質(zhì),能夠改善雞骨香精基料的風(fēng)味;實驗結(jié)果證明雞骨香精基料具有較高的抗氧化活性、ACE抑制活性,還具備一定的體外降膽固醇能力。總體而言,以上結(jié)果為美拉德反應(yīng)制備雞骨香精基料提供了技術(shù)支持,證明利用肉類工業(yè)的副產(chǎn)品骨骼殘渣制備肉味香精具有一定的可行性。