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        基于頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對不同產(chǎn)地黃金百香果的代謝組學(xué)分析

        2023-10-09 06:46:52盧晨陳楠王立娟袁啟風顏培玲史斌斌粟睿馬玉華
        食品與發(fā)酵工業(yè) 2023年18期
        關(guān)鍵詞:差異

        盧晨,陳楠,王立娟,袁啟風,顏培玲,史斌斌,粟睿,馬玉華

        1(貴州省果樹科學(xué)研究所,貴州 貴陽,550006)2(從江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)經(jīng)站,貴州 黔東南苗族侗族自治州,557400)3(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院,貴州 貴陽,550006)

        百香果屬于西番蓮科(PassifloracaeruleaL.)西番蓮屬(Passiflora)多年生常綠藤本植物,是一種作為果汁生產(chǎn)原料和鮮果消費都具有相當重要的經(jīng)濟意義的作物[1]。因其富含維生素、酚類物質(zhì)、抗氧化劑、氨基酸等對人體有益的物質(zhì)[2-3],現(xiàn)已應(yīng)用于食品、制藥等行業(yè)[4-7]。由于其豐富的香氣和營養(yǎng),百香果被稱為“果汁之王”。不同產(chǎn)地的黃金百香果因地理位置、環(huán)境條件和生產(chǎn)方式不同,具有不同的風味特征。因此探索不同產(chǎn)地黃金百香果的揮發(fā)性差異代謝物質(zhì)具有重要意義。

        百香果具有特殊的風味和香氣,可以散發(fā)出菠蘿、草莓、檸檬和荔枝等水果的香味[8]。獨特的香味常常由不同揮發(fā)性物質(zhì)之間的平衡導(dǎo)致[9-11]。目前,已對百香果揮發(fā)性物質(zhì)進行一定的研究,主要包括酯類、醇類、酮類、醛類、烯類、烷類、酸類及其他類,其中酯類物質(zhì)為其獨特香味的主要貢獻者[12],主要包括丁酸乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸己酯等[13]。氣相色譜-質(zhì)譜法(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)在百香果香氣物質(zhì)分析檢測中應(yīng)用很廣泛,方靈等[14]研究表明,黃金百香果不同發(fā)育階段果皮間、果肉間揮發(fā)性成分存在差異性,正己酸乙酯、乙酸己酯、(E)-Β-羅勒烯及乙酸葉醇酯等可判別黃金百香果肉是否完全成熟。但同一品種不同產(chǎn)地揮發(fā)性代謝物質(zhì)的差異分析研究較少,金潤楠等[15]對浙江、湖北、湖南3個產(chǎn)地溫州蜜柑果汁中的揮發(fā)性代謝物質(zhì)差異進行分析比較,結(jié)果表明產(chǎn)地對揮發(fā)性代謝物質(zhì)具有顯著影響。劉慧宇等[16]利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析信豐、興山和秭歸3個產(chǎn)區(qū)贛南早臍橙果實中揮發(fā)性成分的差異性,結(jié)果顯示揮發(fā)性代謝物質(zhì)是能夠區(qū)分不同產(chǎn)地的生物標志物。黃金百香果因其味甜,風味奇特,在貴州、福建、廣西等地大面積種植,但對不同產(chǎn)地黃金百香果揮發(fā)性物質(zhì)代謝組學(xué)的研究未見報道。

        本研究采用固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對貴州、福建和廣西等3個不同產(chǎn)地的黃金百香果進行揮發(fā)性代謝物質(zhì)比較分析,篩選不同產(chǎn)地黃金百香果的差異代謝物,解析不同產(chǎn)地黃金百香果的品質(zhì)差異,初步為黃金百香果的產(chǎn)地鑒別及深加工提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        黃金百香果(坐果后75 d)采集于貴州(GZ)、福建(FJ)、廣西(GX)三地的百香果主產(chǎn)基地,每地區(qū)各選取20株進行采樣,每株采集發(fā)育良好,果形一致,無病害的5個果實樣品,將果汁分別混勻后液氮凍存?zhèn)溆谩B然c,國藥集團化學(xué)試劑有限公司;正己烷,默克醫(yī)藥生物科技公司;標準品,西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。

        1.2 儀器與設(shè)備

        8890-5977B型氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀、頂空瓶、TFE硅膠頂蓋,美國安捷倫公司;65 μm SPME纖維組件二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷,美國Supelco公司。

        1.3 樣品制備方法

        從-80 ℃冰箱中取出樣品進行液氮研磨,渦旋混合均勻,每個樣本稱取約1 g粉末于頂空瓶中,加入飽和NaCl溶液,使用TFE硅膠頂蓋(安捷倫)密封。SPME分析時,將每個小瓶放入60 ℃保持10 min,溫度平衡后,采用65 μm SPME纖維組件二乙烯基苯/羧基/聚二甲基硅氧烷(色譜科)在60 ℃下暴露于樣品的頂部空間20 min。每個樣品做6組平行。

        1.4 色譜與質(zhì)譜條件

        萃取后,在GC儀的注入端口中,在250 ℃條件下,從纖維涂層中解吸揮發(fā)性有機物5 min。揮發(fā)性有機物的鑒定和定量采用氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀,配備30 m×0.25 mm×0.25 μm 5%苯基-聚甲基硅氧烷(DB-5MS)毛細管柱。以氦氣為載氣,線速為1.0 mL/min。噴射器溫度保持在250 ℃,探測器溫度保持在280 ℃。加熱速率為5 /min時,烘箱溫度由40 ℃上升到250 ℃。所有的質(zhì)譜都是在電子沖擊(electronic impact,EI)模式下獲得的,電離電壓為70 eV。四極質(zhì)量探測器、離子源和傳遞線溫度分別設(shè)置為150 ℃、230 ℃和280 ℃。質(zhì)譜在m/z30~350 amu內(nèi)進行掃描,間隔為1 s。將質(zhì)譜與數(shù)據(jù)系統(tǒng)庫(MWGC)和線性保留指數(shù)進行了比較,對分離的揮發(fā)性化合物進行了質(zhì)譜鑒定。

        1.4 數(shù)據(jù)處理

        采用R軟件進行主成分分析(principal component analysis,PCA)及正交偏最小二乘判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis,OPLS-DA),以反映不同樣本分布狀況,最大程度地分離不同變量指標。基于OPLS-DA模型獲得的變量重要性投影(variable importance in project,VIP)進行評分,將根據(jù) VIP≥1、P<0.05篩選出的代謝物定義為差異代謝物(significant changed metabolites,SCMs)。利用KEGG代謝庫將鑒定出的差異代謝物進行比對并注釋,進行相關(guān)代謝通路的分析。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 GC-MS定性定量分析

        本實驗對3個不同產(chǎn)地黃金百香果揮發(fā)性成分進行了定性和定量分析。一共鑒定出183個與香氣相關(guān)的揮發(fā)性代謝物質(zhì)。分類統(tǒng)計(圖1-A)表明183個代謝物中一共分成14類,其中酯類占38%,萜類占16%,酮類占9%,雜環(huán)化合物占8%,醇類占6%,芳烴類占6%,烷烴類占5%,烯烴類占3%。并繪制不同產(chǎn)地黃金百香果揮發(fā)性成分熱圖,聚類結(jié)果表明不同產(chǎn)地的18個樣本分為3組,貴州樣本和廣西樣本的揮發(fā)性物質(zhì)種類與含量接近,聚為一類,福建樣本單獨聚為一類(圖1-B)。

        A-揮發(fā)性成分分類餅圖;B-不同產(chǎn)地聚類分析熱圖圖1 GC-MS定性定量結(jié)果Fig.1 Qualitative and quantitative results of GC-MS

        酯類物質(zhì)是本研究中最豐富的揮發(fā)性代謝物質(zhì)(圖1-A),大多數(shù)酯類被描述為具有水果和花的香味[17]。其次是萜類物質(zhì),揮發(fā)性的萜主要包含異戊二烯、單倍半萜及其衍生物,這一類物質(zhì)也往往具有花果香氣并具有較強的揮發(fā)性[18]。這些代謝物質(zhì)不僅使百香果具有獨特的香氣和風味,也是決定其品質(zhì)和口感的重要因素之一。

        2.2 PCA分析

        針對不同產(chǎn)地黃金百香果的揮發(fā)性物質(zhì)進行非監(jiān)督模式識別方法PCA分析。由圖2可知,PCA得分圖中主成分1和主成分2的貢獻率之和為89.4%。一般情況下,當累計貢獻率達到60%時,選擇PCA模型作為分離模型[19]。本研究供試樣品的PCA模型可以將貴州、福建及廣西等不同地區(qū)種植的百香果區(qū)分開,且組內(nèi)各點分布較為集中。主成分1將福建與貴州、廣西分為兩類,與聚類熱圖結(jié)果一致(圖2)。表明不同產(chǎn)地黃金百香果的揮發(fā)性代謝物質(zhì)具有一定的差異性。

        圖2 PCA結(jié)果Fig.2 The results of PCA

        2.3 OPLS-DA分析

        相對于PCA技術(shù),OPLS-DA在建立分類模型時能夠提供更準確的結(jié)果,從而提高模型預(yù)測能力和精度。OPLS-DA得分圖(圖3-A)的R2Y(cum)值為0.997,Q2Y(cum)值為0.994,表明該模型穩(wěn)定性良好,可以應(yīng)用于差異揮發(fā)物成分的篩選。對模型進行了200次置換驗證檢驗(圖3-B),結(jié)果表明這個OPLS-DA模型沒有過擬合,具有統(tǒng)計學(xué)意義。

        A-S-plot圖;B-200次置換驗證檢驗圖3 OPLS-DA結(jié)果Fig.3 OPLS-DA results

        2.4 主要差異代謝物質(zhì)分析

        通過對該OPLS-DA模型的VIP值進行多變量分析,對VIP值進行排序,VIP值越大,則對模型的貢獻度越高,篩選出VIP值≥1,且P<0.05的揮發(fā)性成分(圖4)。GX vs FJ篩選到31種差異代謝物,其中酯類占45.1%,包括丁酸己酯、(Z)-3-己烯基丁酸酯、丁酸乙酯、(Z)-3-己烯己酸酯、辛酸乙酯、1-甲基己酯-己酸、2-乙基丁酸辛酯、(Z)-3-己烯基酯辛酸、己酸己酯、庚烷-2-基丁酸酯、乙酸己酯、丁酸香葉酯、異丁酸香茅酯、己酸異戊酯等14種代謝物;萜類占29.0%,包括δ-3-烯、(1S)-6,6-二甲基-2-亞甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷、4-蒈烯、(+)-檸檬烯、2,6,10,10-四甲基-1-氧雜螺[4.5]癸烯、3,6,6-三甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯、γ-萜品烯、8-(2,6-二甲基-庚-1,5-二烯基)-3,7,7-三甲基-雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯、L-α-松油醇等9種代謝物;醇類占9.6%,包括1,2-辛二醇、己醇、呋喃醇TM3種代謝物;雜環(huán)化合物占6.4%,包括4,4′-雙氮唑基、4-甲基噻唑2種代謝物;酮類占3.2%,僅2-庚酮1種代謝物;芳烴類占3.2%,僅苯酚1種代謝物;其他占3.2%,僅丁酸酸酐1種代謝物。GZ vs FJ篩選到35種差異代謝物,其中酯類占45.7%,包括丁酸己酯、(Z)-3-己烯己酸酯、(Z)-3-己烯基丁酸酯、丁酸乙酯、辛酸乙酯、1-甲基己酯-己酸、(Z)-3-己烯基酯辛酸、2-乙基丁酸辛酯、乙酸芐酯、庚烷-2-基丁酸酯、4-(2,6,6-三甲基環(huán)己烯-1-基)丁烷-2-基乙酸酯、己酸己酯、乙酸己烯酯、反式-3-己烯基乙酸酯、丁酸香葉酯、乙酸己酯等16種代謝物;萜類占31.4%,包括δ-3-烯、(1S)-6,6-二甲基-2-亞甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷、2,6,10,10-四甲基-1-氧雜螺[4.5]癸烯、4-蒈烯、(+)-檸檬烯、1,1,5-三甲基-1,2-二氫萘、3,6,6-三甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯、γ-萜品烯、對薄荷腦1,5,8-三烯、8-(2,6-二甲基-庚-1,5-二烯基)-3,7,7-三甲基-雙環(huán)[4.2.0]辛-2-烯、L-α-松油醇等11種代謝物;醇類占5.7%,包括1,2-辛二醇、4-羥基-3-甲氧基芐醇2種代謝物;酮類占5.7%,包括4-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基)-2-丁酮、2-庚酮2種代謝物;芳烴類占5.7%,包括1,2,3,4-四氫-1,4,6-三甲基-萘、苯酚2種代謝物;雜環(huán)化合物占2.8%,僅4,4′-雙氮唑基1種代謝物;其他占2.8%,僅丁酸酸酐1種代謝物。GZ vs GX篩選到31種差異代謝物,其中酯類占35.4%,包括(Z)-3-己烯己酸酯、4-(2,6,6-三甲基環(huán)己烯-1-基)丁烷-2-基乙酸酯、(Z)-3-己烯基丁酸酯、乙酸芐酯、γ-十內(nèi)酯、苯乙酸甲酯、丁酸芐酯、乙酸己酯、己酸己酯、吡螺烷、丁酸己酯等11種代謝物;萜類占35.4%,包括δ-3-烯、2,6,10,10-四甲基-1-氧雜螺[4.5]癸烯、(1S)-6,6-二甲基-2-亞甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷、1,1,5-三甲基-1,2-二氫萘、(+)-檸檬烯、4-蒈烯、龍腦、對薄荷腦1,5,8-三烯、3,6,6-三甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯、1,8-二甲基-8,9-環(huán)氧-4-異丙基-螺癸烷、甲基異冰片等11種代謝物;醇類占9.6%,包括4-羥基-3-甲氧基芐醇、(R)-3,7-二甲基-6-辛烯醇、己醇3種代謝物;芳烴類占6.4%,包括1,2,3,4-四氫-1,4,6-三甲基-萘、1-甲基-3-(1-甲基乙基)-苯2種代謝物;雜環(huán)化合物占6.4%,包括4,4′-雙氮唑基、2,4a-表二氧基-5,6,7,8-四氫-2,5,5,8a-四甲基-2H-1-苯并吡喃等2種代謝物;酮類占3.2%,僅4-(2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-基)-2-丁酮1種代謝物;烯烴類占3.2%,僅3,4-二甲基-2,4,6-辛三烯1種代謝物。

        A-GX vs FJ; B-GZ vs FJ; C-GZ vs GX圖4 主要差異代謝物質(zhì)Fig.4 Main differential metabolites

        有趣的是,在貴州、廣西和福建等3個不同地區(qū)種植的黃金百香果,根據(jù)地區(qū)不同,檢出了特征性代謝物質(zhì)(圖5),其中,己酸己酯在貴州和廣西采集樣品中檢出,3-羥基丁酸乙酯在福建和廣西采集樣品中檢出。此外,1-甲基己基乙酸酯在貴州和福建采集樣品中檢出,呋喃醇TM、水楊酸乙酯、十四烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、甲烷亞磺酰氟、2-壬醇乙酸酯等6種代謝物質(zhì)只在福建采集樣品中檢出。說明產(chǎn)地不同對酯類揮發(fā)性物質(zhì)有較大的影響(圖5)。以往的研究表明,乙酸乙酯、丁酸乙酯等酯類揮發(fā)性物質(zhì)是區(qū)分草莓香味的重要化合物質(zhì)[9,20]。

        圖5 特征性代謝物質(zhì)Fig.5 Characteristic metabolic substances注:其中白色方框表示該樣品未檢出相應(yīng)代謝物。

        2.5 共有差異代謝物分析

        由圖6可知,在GX vs FJ、GZ vs FJ和GZ vs GX比較組中,3 個比較組間共同認定12個標志性代謝物,包括6個萜類物質(zhì){3,6,6-三甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯、δ-3-烯、(1S)-6,6-二甲基-2-亞甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷、(+)-檸檬烯、2,6,10,10-四甲基-1-氧雜螺[4.5]癸烯、4-蒈烯};5個酯類物質(zhì)[己酸己酯、丁酸乙酯、乙酸己酯、(Z)-3-己烯己酸酯、(Z)-3-己烯基丁酸酯];1個雜環(huán)化合物(4,4′-雙氮唑基)。

        圖6 差異代謝物韋恩圖Fig.6 Venn diagram of differential metabolites

        本研究3個比較組間共同認定12個標志性代謝物,其中包括6個萜類物質(zhì),說明萜類物質(zhì)在黃金百香果不同產(chǎn)地鑒別中承擔重要作用。單萜類化合物一般具有揮發(fā)性和較強的香氣[18,21-22]。5個酯類物質(zhì)也被認定為標志性代謝物,這些物質(zhì)往往作為脂肪酸與醇的酯化產(chǎn)物出現(xiàn),可能起到能量貯存和釋放的作用[17]。以往的研究表明,茶類的揮發(fā)性萜類化合物對茶的風味和品質(zhì)有直接影響[23]。從結(jié)果來看,這些標志性代謝物在不同的比較組中都被認定為共同存在的代謝物,這表明它們可能在不同組之間具有一定的代謝通路和相似的生物功能。同時,這些代謝物的共同存在也可能與樣本來源的地理位置、生長條件等因素有關(guān)。深入研究這些標志性代謝物,有助于更好地理解不同組之間的代謝差異,并有助于對物種的生長和適應(yīng)機制進行更深入的探究。

        2.6 差異代謝物通路分析

        共有代謝物分析可以幫助本研究了解不同樣本之間的差異,KEGG富集分析可以進一步幫助本研究了解這些差異代謝物所富集的生物學(xué)通路及其功能。在3個黃金百香果產(chǎn)地之間的差異代謝物KEGG富集分析結(jié)果中,可以看出不同樣本之間存在的生物學(xué)差異(圖7)。在GX vs FJ比較組中,差異代謝物主要富集在單萜類生物合成、酪氨酸代謝、檸檬烯和針烯降解、代謝途徑及次生代謝物的生物合成中。這些富集通路與百香果的營養(yǎng)成分和香氣有關(guān),其中單萜類物質(zhì)和檸檬烯是重要香氣成分[24]。在GZ vs FJ比較組中,差異代謝物主要富集在單萜類生物合成、次生代謝物的生物合成、酪氨酸代謝、α-亞麻酸代謝、檸檬烯和針烯降解及代謝途徑中。這些差異代謝物與GX vs FJ比較組相似,但還包括亞麻酸代謝,這表明2個產(chǎn)地之間的差異還在于脂肪酸的含量和類型,脂肪酸是參與果實香氣揮發(fā)物生物合成的重要代謝途徑[25]。在GZ vs GX比較組中,差異代謝物主要富集在單萜類生物合成、檸檬烯和針烯降解、代謝途徑及次生代謝物的生物合成中。以上結(jié)果表明,不同產(chǎn)地的黃金百香果在化學(xué)成分和生物學(xué)功能方面存在差異,這可以為產(chǎn)地的鑒別和質(zhì)量控制提供重要的參考。

        A-GX vs FJ; B-GZ vs FJ; C-GZ vs GX圖7 差異代謝物KEGG富集圖Fig.7 Differential metabolite KEGG enrichment map注:橫坐標為代謝通路對應(yīng)的 Rich factor,縱坐標為代謝通路名稱,點的顏色為P-value(越紅表示富集越顯著),點的大小為所富集的差異代謝物個數(shù)(越大表示個數(shù)越多)。

        3 結(jié)論

        產(chǎn)地溯源能夠證明農(nóng)產(chǎn)品的真實性,確保食品質(zhì)量安全。本研究分析對比了貴州、福建、廣西3個不同產(chǎn)地黃金百香果揮發(fā)性成分,研究發(fā)現(xiàn),黃金百香果中的揮發(fā)性成分主要為酯類與萜類,在3個產(chǎn)地間共同認定了12個標志性代謝物,其中6個為萜類物質(zhì),5個為酯類物質(zhì),1個雜環(huán)化合物。不同地區(qū)種植的黃金百香果中檢測出的代謝物質(zhì)有所不同。在貴州和廣西的樣品中發(fā)現(xiàn)了己酸己酯和1-甲基己基乙酸酯,而在福建和廣西的樣品中檢測到了3-羥基丁酸乙酯。此外,在福建的樣品中檢測到了呋喃醇TM、水楊酸乙酯、十四烷酸乙酯、十六烷酸乙酯、甲烷亞磺酰氟、2-壬醇乙酸酯等6種代謝物質(zhì),而這些物質(zhì)在其他2個地區(qū)的樣品中沒有檢測到。研究結(jié)果可以幫助鑒別和區(qū)分不同產(chǎn)地的百香果,但是只采集了貴州、福建及廣西的黃金百香果樣本做了廣靶代謝組學(xué)分析,在今后的研究工作中,除了已知的揮發(fā)性代謝物外,還有許多未知的代謝物需要進一步分析和鑒定,這些代謝物可能對百香果的品質(zhì)和營養(yǎng)成分具有重要影響。此外,通過對百香果的基因組進行分析,可以了解其生長和發(fā)育過程中揮發(fā)性代謝物的合成和調(diào)控機制。

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