秦炳偉,呂志遠(yuǎn),張夢(mèng)夢(mèng),劉陽(yáng)晴雪,劉玉濤,王文潔,胥鑫鈺,李小杰,崔新瑩,商海林,王瑞明,高紅波*,宋妍妍

1(齊魯工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院,山東 濟(jì)南,250353)2(濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司,山東 濟(jì)南,250115)3(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司,北京,100015)4(廣州禾信儀器股份有限公司,廣東 廣州,510535)

中國(guó)白酒根據(jù)原料、發(fā)酵容器、生產(chǎn)工藝、糖化發(fā)酵劑和貯存方式不同,分為十二大國(guó)標(biāo)香型和其他香型,每種香型具有不同的風(fēng)格特點(diǎn)。趵突泉是濟(jì)南七十二大名泉之首,被譽(yù)為“天下第一泉”,趵突泉白酒采用趵突泉源頭之水釀酒,將傳統(tǒng)芝麻香型工藝與濃香型工藝相結(jié)合,采用磚泥混合窖,隔輪堆積的方式,獨(dú)創(chuàng)了泉香型白酒。泉香型白酒既有芝麻香型白酒的優(yōu)雅細(xì)膩,又有濃香型白酒醇甜甘冽的風(fēng)格特點(diǎn),已成為消費(fèi)者喜愛的白酒。為更好地剖析泉香型白酒的特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)利用頂空固相微萃取-全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(headspace solid phase microextraction -comprehensive two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry, HS-SPME-GC×GC-TOF-MS)對(duì)泉香型白酒的揮發(fā)性組分進(jìn)行檢測(cè),定性、半定量分析。

目前,白酒中揮發(fā)性組分的研究一般采用常規(guī)色譜法,屬于一維氣相,存在化合物共流出的問題。全二維色譜技術(shù)(GC×GC)是最近20年新開發(fā)出的一種全新的色譜分離技術(shù),采用連續(xù)調(diào)制的方式將第一維色譜柱中分離的組分全部轉(zhuǎn)移至第二維色譜柱中進(jìn)行進(jìn)一步分離,具有高分辨率、高靈敏度、高峰容量、族分離等優(yōu)勢(shì),是當(dāng)前能夠?qū)崿F(xiàn)的最高分辨率的色譜分離技術(shù)[1],可以解決一維氣相共流出問題[2]。對(duì)于白酒香氣的研究,國(guó)內(nèi)使用全二維技術(shù),主要通過不同前處理方式[2-7]檢測(cè)易揮發(fā)性組分,利用匹配度、相似性進(jìn)行定性,但是對(duì)利用正構(gòu)烷烴保留指數(shù)(retention index, RI)進(jìn)一步定性后易揮發(fā)組分與香氣貢獻(xiàn)度結(jié)合進(jìn)行分析的研究較少,如ZHU等[6]優(yōu)化了色譜柱組合并認(rèn)為極性+中極性組合更有利于白酒中揮發(fā)性物質(zhì)的分離,然后采用液液萃取結(jié)合GC×GC-TOF-MS,根據(jù)軟件解析、有序色譜和該團(tuán)隊(duì)開發(fā)的RI庫(kù)在茅臺(tái)酒中發(fā)現(xiàn)了528種組分,但僅列出部分成分;YAO等[7]采用液液萃取與頂空固相微萃取(HS-SPME)結(jié)合GC×GC-TOF-MS,根據(jù)軟件解析在瀘州老窖酒中鑒定出超過1 300種物質(zhì),并認(rèn)為不同處理方法對(duì)鑒定結(jié)果有顯著影響。季克良等[8]利用GC×GC-TOF-MS技術(shù)根據(jù)質(zhì)譜鑒定出醬香型白酒中匹配度大于800的組分共873種物質(zhì),在濃香型白酒中有342種物質(zhì),在清香型白酒中有178種物質(zhì);陳雙等[9]采用HS-SPME結(jié)合GC×GC-TOF-MS 解析了芝麻香白酒中的揮發(fā)性組分,根據(jù)相似度、可能性與二維色譜出峰規(guī)律比對(duì)驗(yàn)證,在芝麻香白酒中鑒定出340種揮發(fā)性成分。

基于全二維色譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì),本實(shí)驗(yàn)采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS,利用NIST庫(kù)匹配度可能性、正構(gòu)烷烴RI值定性和內(nèi)標(biāo)法半定量,首次對(duì)泉香型白酒風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行全面的解析,為泉香型白酒揮發(fā)性組分的定性與部分關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)的研究奠定了基礎(chǔ),并探究了泉香型與濃香型和芝麻香型白酒的差異性與共性,使消費(fèi)者更好地了解泉香型白酒風(fēng)格特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

不同批次泉香518(51.8%vol),濟(jì)南趵突泉釀酒有限責(zé)任公司。

無水乙醇(色譜純)、乙酸正戊酯(純度均為99.9%)、2-乙基丁酸(純度均為99.9%)、叔戊醇(純度均為99.9%)、2-甲氧基-3甲基吡嗪(純度均為99.9%)、異丙基二硫醚(純度均為99.9%)、2 mg/L C7～C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品(純度99.9%)、正戊烷(色譜純),百靈威科技有限公司;分析級(jí)氯化鈉,西隴科學(xué)公司。

1.2 儀器和設(shè)備

GT0620全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜,廣州禾信儀器股份有限公司;一維色譜柱FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm)、調(diào)制柱(1.3 m×0.25 mm)、二維色譜柱DB17(1.2 m×0.18 mm×0.18 μm),美國(guó)安捷倫科技公司;SPME arrow(1.1 mm×20 mm×120 μm)(Divinylbenzene/carbon wide range/polydimethylsiloxane)、頂空固相微萃取多功能自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng),廣州智達(dá)實(shí)驗(yàn)室科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 溶液的配制

乙醇溶液(50%,體積分?jǐn)?shù)):量取250 mL無水乙醇于500 mL容量瓶中,用純凈水定容,混勻。

乙酸正戊酯(20 000 mg/L)、2-乙基丁酸(20 000 mg/L)、叔戊醇(20 000 mg/L)、2-甲氧基-3-甲基吡嗪(100 mg/L)、異丙基二硫醚混合內(nèi)標(biāo)溶液(100 mg/L)混合內(nèi)標(biāo)溶液:分別準(zhǔn)確稱取2.000 0 g乙酸正戊酯[10]、2.000 0 g 2-乙基丁酸[10]、2.000 0 g叔戊醇[10]、0.01 g 2-甲氧基-3-甲基吡嗪、0.01 g異丙基二硫醚,加入適量的乙醇溶液(50%,體積分?jǐn)?shù))溶解,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容,充分混勻。

500 μg/L C7～C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)液:吸取25 mL 2 mg/L C7～C40正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品,用適量的正戊烷溶解,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,定容,充分混勻。

1.3.2 樣品前處理

用超純水將酒樣稀釋到乙醇體積分?jǐn)?shù)為12%,吸取5 mL稀釋后的酒樣放入20 mL頂空瓶中,加入1.5 g NaCl,再加入50 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液,壓緊瓶蓋,HS-SPME-GC×GC-TOF-MS儀器檢測(cè)。

吸取1 mL 500 g/L正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)液放入進(jìn)樣瓶中,采用直接進(jìn)樣法GC×GC-TOF-MS儀器檢測(cè)(與樣品檢測(cè)進(jìn)樣方式不同外,儀器條件相同)。

1.3.3 儀器條件

GC×GC條件:一維柱ZB-FFAP(60 m×0.25 mm×0.25 μm),二維柱DB-17 HT(0.6 m×0.25 mm×0.25 μm),進(jìn)樣口溫度230 ℃,分流比10：1;載氣為高純氦氣(純度>99.999 5%),流速為1.0 mL/min;色譜柱升溫程序:初始溫度40 ℃,5 min后以3 ℃/min升溫至200 ℃,保持5 min,后運(yùn)行230 ℃,后運(yùn)行時(shí)間5 min。

飛行質(zhì)譜條件:溶劑延遲3.5 min,采用EI電離源,電離電壓70 eV,離子源溫度為230 ℃,接口溫度230 ℃。檢測(cè)器電壓為-1 700 V,質(zhì)譜掃描范圍:45～500m/z,掃描頻率為101 spectrum/s。

頂空固相微萃取自動(dòng)進(jìn)樣:萃取溫度50 ℃,樣品平衡15 min,萃取45 min,萃取結(jié)束后,萃取頭在250 ℃解吸附5 min。

1.3.4 計(jì)算公式

面積歸一化計(jì)算如公式(1)所示:

(1)

揮發(fā)性物質(zhì)半定量計(jì)算如公式(2)所示:

(2)

氣味活度值(odor activity values, OAV)計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

某化合物RI計(jì)算如公式(4)所示:

(4)

式中:tx,分析組分在氣相色譜中的保留時(shí)間;tn和tn+1,碳原子數(shù)為n和n+1正構(gòu)烷烴出峰的保留時(shí)間。

1.4 數(shù)據(jù)處理

二維數(shù)據(jù)由Canvas采集,Canvas scale工作站(版本1.0.0.19776)用于數(shù)據(jù)處理。

定性:GC×GC-TOFMS所檢測(cè)化合物的定性通過質(zhì)譜解析與NIST 18譜庫(kù)檢索、正向和反向匹配度>800;可能性≥75%;用C7～C40正構(gòu)烷烴作為標(biāo)準(zhǔn),RI比對(duì),根據(jù)保留時(shí)間計(jì)算樣品中檢測(cè)化合物的RI或NIST庫(kù)自動(dòng)計(jì)算保留指數(shù)。

選取OAV≥1的成分作為對(duì)酒體香氣關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。制表軟件:WPS office;繪圖軟件:Origin2019。

2 結(jié)果與分析

2.1 泉香型白酒揮發(fā)性香氣分析

2.1.1 泉香型白酒香氣種類數(shù)的定性

通過頂空固相微萃取-全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)泉香型白酒,將正構(gòu)烷烴的出峰順序疊加在泉香型全二維圖譜得圖1。

圖1 正構(gòu)烷烴輔助定性的泉香型白酒HS-SPME-GC×GC-TOF-MS色譜圖Fig.1 HS-SPME-GC×GC-TOF-MS atlas of spring aroma type Baijiu assisted by n-paraffin

由圖1可知,共出峰1 258種,說明利用頂空固相微萃取全二維氣質(zhì)法能檢測(cè)出泉香型白酒1 258種香氣物質(zhì),選擇正向匹配度與反向匹配度均大于800,可能性≥75%的香氣成分,共566種,共分為15個(gè)類別,利用面積歸一化分析每一類香氣數(shù)量百分比和峰面積百分比(圖2)。

圖2 泉香型白酒香氣類別峰面積和香氣種類峰面積比例Fig.2 Peak area of aroma types and ratio of peak area of aroma types in Spring-flavor Baijiu

由圖2可知,泉香型白酒酯類數(shù)量占化合物總數(shù)量的35%(198種),峰面積占總峰面積的56%;醇類化合物數(shù)量占化合物總數(shù)量的14%(80種),峰面積占總峰面積的11%。說明酯類和醇類為泉香型白酒的主要香氣成分,此外根據(jù)各大類峰的數(shù)量和峰面積,發(fā)現(xiàn)醛類、酮類、酸類等化合物也同時(shí)作為酒中主要的可揮發(fā)物質(zhì)的重要組成部分。與其他白酒風(fēng)味物質(zhì)的研究結(jié)論相一致,說明這幾類物質(zhì)是白酒中普遍存在的揮發(fā)性組分[9,11-12]。

2.1.2 泉香型白酒重要香氣成分的定性

再根據(jù)正構(gòu)烷烴RI值與香氣物質(zhì)NIST RI值差值在50以內(nèi),鑒定出白酒中重要香氣化合物,見表1。

表1 泉香型白酒重要香氣成分分類Table 1 Classification of important aroma components in Spring-flavor Baijiu

由圖1、圖2和表1可知,泉香型白酒揮發(fā)性組分1 258種,經(jīng)匹配度與可能性定性后,可鑒定出泉香型白酒可信度較高的566種香氣成分,再經(jīng)正構(gòu)烷烴RI值定性,鑒定出重要化合物251種。其中酯類峰面積占重要化合物總峰面積的85.65%[(51.11/59.67)×100%],說明酯類物質(zhì)是泉香型白酒主要香氣成分,與其他風(fēng)味物質(zhì)研究結(jié)論一致[13]。因此,對(duì)酯類成分進(jìn)行分析。

2.1.3 泉香型白酒酯類成分的分析

對(duì)酯類成分進(jìn)行分析見表2,然后通過內(nèi)標(biāo)法半定量方法計(jì)算出OAV值,選取OAV≥1貢獻(xiàn)度較大的物質(zhì)[14-16],作為酯類中關(guān)鍵香氣物質(zhì)見表2。

表2 酯類化合物的定性Table 2 Qualitative analysis of ester compounds

由表2和表3可得,泉香型白酒70種酯類物質(zhì)中有21種化合物OAV≥1,說明這21種物質(zhì)是酯類物質(zhì)中關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。其中己酸乙酯OAV=27 233,說明己酸乙酯是泉香型白酒酯類中香氣貢獻(xiàn)度較大的化合物,而己酸乙酯為濃香型白酒的主體香成分,說明泉香型白酒具有濃香型白酒的特點(diǎn);泉香型白酒中關(guān)鍵風(fēng)味組分辛酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、庚酸乙酯等,是綿柔芝麻香型白酒關(guān)鍵揮發(fā)性物質(zhì)[21],也是梅蘭春和趵突泉芝麻香型白酒骨架成分[22],說明泉香型白酒也具有芝麻香型白酒的特點(diǎn)。因此從香氣貢獻(xiàn)度較大的酯類組分考慮,泉香型白酒兼有芝麻香和濃香的特點(diǎn)。

表3 酯類中對(duì)泉香型白酒貢獻(xiàn)度較大的化合物Table 3 Compounds in esters that contribute more to Spring-flavor Baijiu

2.2 泉香型白酒與濃香型白酒和芝麻香型白酒共性與差異性分析

根據(jù)泉香型白酒的工藝和香氣特點(diǎn),本實(shí)驗(yàn)對(duì)泉香型白酒與本公司濃香型(52%vol)、芝麻香型(54%vol)白酒共性與差異性進(jìn)行分析。結(jié)合本研究“2.1節(jié)”內(nèi)容,酯類和醇類為泉香型白酒的主要香氣成分,醛類、酮類、酸類等化合物也是其重要組成部分;另有研究表明,白酒中部分吡嗪類和含硫化合物是其重要香氣成分[23-26],也是特殊功能的健康因子[27-30]。因此,本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過定性、內(nèi)標(biāo)法半定量,重點(diǎn)對(duì)泉香型白酒、濃香型白酒和芝麻香型白酒的酯類、醇類、醛類、酮類、酸類、吡嗪類及含硫化合物這七類可信度較高化合物進(jìn)行分析。

2.2.1 泉香型白酒與濃香型和芝麻香型白酒重要化合物香氣種類與峰面積分析

由圖3和圖4可知,3種香型中酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、吡嗪類、含硫化合物這七類可信度較高化合物總數(shù)量分別為:濃香型白酒372種、泉香型白酒394種、芝麻香型白酒427種;七類物質(zhì)峰面積百分比分別為濃香84.224%、泉香86.544%、芝麻香92.508%。說明泉香型白酒與濃香型白酒和芝麻香型白酒差異性較大,而且泉香型白酒酯類化合物峰面積占比較濃香和芝麻香低,但是醇類、醛類、酮類化合物峰面積占比較高,說明泉香型白酒具有不同于濃香型和芝麻香型的風(fēng)格特點(diǎn)。

圖3 泉香型與濃香型和芝麻香型重要化合物數(shù)量的對(duì)比Fig.3 Comparison of the number of important compounds in Spring-flavor Baijiu, Luzhou flavor, and Sesame flavor

圖4 泉香型白酒與濃香型和芝麻香型重要化合物峰面積的對(duì)比Fig.4 Comparison of peak areas of important compounds in Spring-flavor Baijiu, Luzhou flavor, and Sesame flavor

2.2.2 泉香型白酒與濃香型、芝麻香型白酒主要化合物分析

通過HS-SPME-GC×GC-TOF-MS實(shí)驗(yàn)定性和半定量后,選取相對(duì)較重要、而且3種香型中含量差異相對(duì)較大的11種酯類、8種酸類、11種醇類、3種醛類物質(zhì)、3種酮類、8種吡嗪類、8種含硫化合物,進(jìn)行熱圖對(duì)比分析。

由圖5可知,3種香型中11種酯類化合物含量總和分別為泉香型4 073.6 mg/L、芝麻香型4 803.8 mg/L、濃香型3 056.3 mg/L,雖然泉香總酯含量和濃香型、芝麻香型差異性規(guī)律不一致,但是能說明泉香型白酒整體酯類豐富,香氣馥郁,而且其己酸乙酯含量和丁酸乙酯含量與濃香型白酒較接近,說明泉香型白酒具有濃香型白酒的特點(diǎn),而其他酯類組分與濃香型白酒有一定的差異性。3種香型中8種酸類化合物含量總和分別為泉香型2 375.6 mg/L、芝麻香型2 058.9 mg/L、濃香型2 035.2 mg/L。結(jié)合酸酯平衡,總酸加總酯的含量分別為泉香型6 449.2 mg/L、芝麻香型6 862.7 mg/L、濃香型白酒5 091.5 mg/L,泉香型總酸加總酯的含量介于芝麻香型和濃香型之間,說明泉香型白酒與芝麻香型白酒的差異性與共性。

A-酯類分析;B-醇類、醛類分析;C-酸類、酮類分析;D-吡嗪類和含硫化合物分析圖5 熱圖比較泉香型與濃香型和芝麻香型白酒的差異性與共性Fig.5 Comparison of differences and commonalities in Spring-flavor Baijiu, Luzhou flavor, and Sesame flavor by heat map

醇類化合物對(duì)酒體風(fēng)味的影響較酸酯類化合物小,但亦是酒體不可或缺的主體香氣成分。泉香型白酒中,醇類主要化合物總含量低于芝麻香型,接近于濃香型。其中,異丁醇和3-甲基丁醇的含量低于濃香和芝麻香型,可相應(yīng)減少酒體辛辣刺激感,提高感官舒適度,對(duì)泉香型白酒清雅細(xì)膩的感官特征具有一定的貢獻(xiàn)。

醛、酮類化合物在白酒中起到呈香、協(xié)調(diào)平衡的作用。醛類化合物總含量排序?yàn)槿阈?濃香型<芝麻香型;酮類化合物總含量排序?yàn)槿阈?芝麻香型>濃香型,說明了泉香型與濃香型和芝麻香型白酒的差異性。

本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出:泉香型白酒中8種吡嗪類化合物,5種含硫化合物;濃香型白酒中8種吡嗪類化合物,4種含硫化合物;芝麻香型白酒中8種吡嗪類,8種含硫化合物。其中,2,6-二甲基吡嗪、吡嗪、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、3-甲硫基丙醇、甲基糠基二硫醚含量排序?yàn)?芝麻香>泉香>濃香;2-乙基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、四甲基吡嗪含量排序?yàn)槿阈桶拙浦?芝麻香香型白酒>濃香型白酒;3-甲硫基丙醛含量排序?yàn)闈庀阈桶拙?芝麻香型白酒>泉香型白酒,說明泉香型白酒具有與濃香和芝麻香型白酒不同的香氣特點(diǎn)。

3 結(jié)論

采用頂空固相微萃取-全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜解析泉香型白酒的風(fēng)味物質(zhì),共檢測(cè)出1 258種香氣成分,定性出可信度較高的成分566種,其中,重要化合物251種。在251種重要化合物中,酯類物質(zhì)峰面積占85.65%,說明酯類物質(zhì)是泉香型白酒主要香氣成分。因此,利用內(nèi)標(biāo)半定量法對(duì)酯類成分進(jìn)行OAV分析,鑒定出了21種貢獻(xiàn)度較大的酯類關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì)。并且本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、吡嗪類和含硫化合物,與濃香型白酒和芝麻香型白酒進(jìn)行了對(duì)比,以熱圖的形式,說明了泉香型白酒與濃香型和芝麻香型白酒的共性與差異性。本研究通過采用頂空固相微萃取-全二維氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測(cè)、定性與面積歸一化、內(nèi)標(biāo)半定量分析解析了泉香型白酒的揮發(fā)性物質(zhì)的種類數(shù)與部分關(guān)鍵風(fēng)味物質(zhì),后期還需要標(biāo)準(zhǔn)品的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。