白亞敏,梁靜

1(重慶市食品藥品檢驗檢測研究院,重慶,401121)2(國家市場監(jiān)管重點實驗室(調(diào)味品監(jiān)管技術(shù)),重慶,401121)

毛肚、鴨腸、黃喉等水發(fā)食品在我國西南地區(qū)深受消費者喜愛,消費量較大,但其中檢出氨基脲的事件時有發(fā)生,給食品加工業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失。氨基脲屬于聯(lián)胺類化合物,對實驗動物的生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)有多效性影響和改變,具有致畸性、致突變性和致癌性,長期攝入會給人體造成安全隱患[1-2]。食品動物養(yǎng)殖過程中使用呋喃西林藥物,可在體內(nèi)代謝產(chǎn)生氨基脲[3-4]。此外,部分甲殼類動物體內(nèi)存在內(nèi)源性氨基脲[5-7],偶氮二甲酰胺用作發(fā)泡劑或面粉增筋劑時,高溫分解也會產(chǎn)生氨基脲[8-10]。市售的毛肚、鴨腸、黃喉大部分是干制產(chǎn)品,必須經(jīng)過復(fù)水漲發(fā)才能食用,在水發(fā)食品的生產(chǎn)加工過程中,部分廠家會加入次氯酸鈉消毒劑用于防腐消毒,水發(fā)食品與次氯酸鈉接觸后,會分解出游離的氨基酸和氨基酸衍生物,精氨酸、組氨酸等含有胍基的氨基酸可分解產(chǎn)生氨基脲;精氨酸降解后產(chǎn)生尿素和氨水,氨水與次氯酸鈉反應(yīng)生成氯胺,氯胺與尿素反應(yīng)生成氨基脲;氯胺與氨反應(yīng)可生成聯(lián)氨,谷氨酰胺和天冬酰胺等含有酰胺基團的氨基酸與次氯酸鈉作用能生成異氰酸鹽,聯(lián)胺與異氰酸鹽反應(yīng)也可生成氨基脲[11-16]。目前,國內(nèi)關(guān)于水發(fā)食品中氨基脲研究報道比較少,為系統(tǒng)考察次氯酸鈉消毒劑對水發(fā)食品中氨基脲產(chǎn)生量的影響,本文以毛肚、鴨腸、黃喉等水發(fā)食品為研究對象,全面探究次氯酸鈉消毒劑溶液濃度、浸泡時間、浸泡pH、浸泡溫度、漂洗次數(shù)對氨基脲產(chǎn)生量的影響,為改進水發(fā)食品生產(chǎn)工藝、減少氨基脲生成提供技術(shù)支撐和理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛肚、鴨腸及黃喉,重慶超市及農(nóng)貿(mào)市場。

氨基脲標(biāo)準(zhǔn)品,Dr.Ehrenstorfer GmbH公司;氨基脲-13C-15N2標(biāo)準(zhǔn)品,WITEGA公司;乙腈、甲酸、正己烷均為色譜純,上海安譜實驗科技股份有限公司;乙酸銨、乙酸乙酯、磷酸氫二鉀、鹽酸(均為分析純),重慶川東化工有限公司;氫氧化鈉(分析純),成都市科龍化工試劑廠;水,經(jīng)Millipore超純水儀處理過的超純水;鄰硝基苯甲醛(含量>99%),日本TGI公司;二甲基亞砜(純度≥99.5%),日本Sigma公司;次氯酸鈉(有效氯10%),成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1290型高效液相色譜儀,美國安捷倫公司;API5500型三重四級桿質(zhì)譜儀,美國AB SCIEX公司;渦旋振蕩器,海門市其林貝爾公司;TD16-WS型臺式高速離心機,長沙湘儀公司;恒溫水浴振蕩器,金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 次氯酸鈉溶液處理

稱取2.0 g陰性樣品于50 mL離心管中,分別加入不同質(zhì)量濃度、不同pH值的次氯酸鈉溶液10 mL,渦旋振蕩30 s后,置于恒溫水浴振蕩器,于不同溫度、不同時間下進行振蕩浸泡處理。浸泡結(jié)束后,視實驗需要,用清水漂洗樣品。

1.3.2 樣品制備

經(jīng)次氯酸鈉溶液消毒處理的毛肚、鴨腸及黃喉樣品用10 mL水沖洗后均質(zhì)制樣,準(zhǔn)確稱取2.0 g樣品置于50 mL離心管中,加入100 ng/mL氨基脲內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL,渦旋混合1 min,放置20 min后加入適量1 mol/L鹽酸溶液20 mL和0.1 mol/L鄰硝基苯甲醛溶液0.15 mL,渦旋振蕩1 min后,置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃避光振蕩16 h。取出離心管冷卻至室溫,加入1.0 mol/L磷酸氫二鉀溶液5 mL,用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0～7.4,加入5 mL乙酸乙酯,渦旋振蕩1 min,取上層清液至10 mL離心管中,再加入5 mL乙酸乙酯重復(fù)上述操作,合并上清液后40 ℃氮氣吹干。準(zhǔn)確加入1 mL水,2 mL正己烷渦旋振蕩溶解殘留物,8 000 r/min離心5 min,取下層清液過0.22 μm濾膜,待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)檢測。樣品平行測定3份,結(jié)果取平均值。同時用純水代替次氯酸鈉溶液,做空白試驗。

1.3.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

分別稱取6份陰性樣品,每份2.0 g,置于50 mL離心管中,氨基脲加標(biāo)水平分別為0.5、1、2、5、10、20 μg/kg,加入100 ng/mL氨基脲內(nèi)標(biāo)工作溶液100 μL,渦旋混合1 min,余下操作同1.3.2節(jié)“放置20 min后加入1 moL/L鹽酸溶液20 mL和……,待LC-MS/MS檢測”。

1.3.4 色譜條件

色譜柱:HSS T3(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),流動相A相為乙腈(含0.1%甲酸),B相為10 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.1%甲酸),梯度洗脫程序為:0～0.6 min,15% A;0.6～3.0 min,15%～85% A;3.0～4.5 min,85% A;4.5～4.6 min,85%～15% A;4.6～6.1 min,15% A。流速0.3 mL/min,柱溫40 ℃,進樣體積:2 μL。

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子化模式:電噴霧正離子模式(ESI+),噴霧電壓:5 000 V;離子源溫度:550 ℃;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM);氣簾氣:270 kPa;GAS1:380 kPa,GAS2:380 kPa;質(zhì)譜參數(shù)見表1。標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的質(zhì)量色譜圖見圖1和圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量色譜圖Fig.1 MRM spectra of standard solution

圖2 樣品質(zhì)量色譜圖Fig.2 MRM spectra of sample

表1 氨基脲和同位素內(nèi)標(biāo)物的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of MRM mode for semicarbazide and isotope internal standard

2 結(jié)果與分析

2.1 次氯酸鈉溶液質(zhì)量濃度對氨基脲產(chǎn)生量的影響

食品加工行業(yè)中,次氯酸鈉作為消毒劑的質(zhì)量濃度一般為0.05～0 g/L,25 ℃條件下,分別采用pH為7質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2 g/L的次氯酸鈉溶液振蕩浸泡毛肚、鴨腸和黃喉,浸泡時間為1 h。浸泡后進行測定,氨基脲含量結(jié)果見表2。由表2可知,不同的水發(fā)食品氨基脲的生成量有較大差異。次氯酸鈉溶液質(zhì)量濃度為0.05 g/L時,毛肚、鴨腸和黃喉中均未檢出氨基脲,當(dāng)次氯酸鈉溶液質(zhì)量濃度達到0.1 g/L,毛肚、鴨腸和黃喉中均產(chǎn)生了氨基脲,而且隨著次氯酸鈉質(zhì)量濃度增加,氨基脲產(chǎn)生量也不斷增加,氨基脲產(chǎn)生量與次氯酸鈉溶液質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系。次氯酸鈉溶液質(zhì)量濃度為1 g/L時,毛肚、鴨腸、黃喉中氨基脲生成量分別為11.52、9.74、4.98 μg/kg,毛肚中氨基脲生成量約為黃喉的2倍。

表2 次氯酸鈉質(zhì)量濃度對氨基脲產(chǎn)生量的影響Table 2 Effect of immersion concentration on the production of semicarbazide

利用相同質(zhì)量濃度的次氯酸鈉溶液處理毛肚、鴨腸和黃喉,氨基脲生成量不同,可能由于黃喉表面組織比較致密,次氯酸鈉滲入量較少;也可能與樣品的氨基酸組成差異及樣品表面積差異有關(guān),有待進一步研究。

2.2 浸泡時間對氨基脲產(chǎn)生量的影響

為系統(tǒng)考察浸泡時間對氨基脲產(chǎn)生量的影響,25 ℃條件下,采用pH為7質(zhì)量濃度為1 g/L次氯酸鈉溶液分別浸泡毛肚、鴨腸和黃喉,浸泡時間分別為0.5、1、3、5、8、12 h,浸泡后進行測定,結(jié)果見表3。由表3可知,次氯酸鈉浸泡0.5～3 h內(nèi),氨基脲生成量變化較小,隨著浸泡時間的延長,氨基脲的生成量也逐漸增加,氨基脲的生成量與浸泡時間呈正相關(guān)性。因此,為了盡量控制并減少水發(fā)食品中的生成氨基脲,應(yīng)盡量縮短消毒處理時間。

表3 次氯酸鈉浸泡時間對氨基脲產(chǎn)生量的影響Table 3 Effects of soaking time on the production of semicarbazide

2.3 浸泡溶液pH對氨基脲產(chǎn)生量的影響

次氯酸鈉溶液pH值越小,穩(wěn)定性越差,pH值在7以上,較穩(wěn)定。25 ℃條件下,用質(zhì)量濃度為1 g/L、pH為7、9、10、11、12的次氯酸鈉溶液分別浸泡毛肚、鴨腸和黃喉1 h,浸泡后進行測定,測定結(jié)果見表4。從表4可以看出,毛肚、鴨腸和黃喉中氨基脲生成量隨pH增大而顯著增多。BENDALL[17]研究表明,高pH較高時,次氯酸鈉與有利于生成氨基異氰酸,繼而與尿素反應(yīng)生成氨基脲。此外,pH值次氯酸鈉溶液的穩(wěn)定性有較大影響,低pH時,次氯酸鈉容易分解,高pH時,次氯酸鈉分解速度相對減慢[18]。由于高pH會加速生成氨基脲,利用次氯酸鈉消毒處理水發(fā)食品時,應(yīng)將次氯酸鈉溶液pH控制在7～9。

表4 浸泡溶液pH對氨基脲產(chǎn)生量的影響Table 4 Effects of soaking pH on the production of semicarbazide

2.4 浸泡溫度對氨基脲產(chǎn)生量的影響

為盡可能覆蓋食品企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境溫度,采用pH為7、質(zhì)量濃度為1 g/L次氯酸鈉溶液浸泡毛肚、鴨腸和黃喉,溫度分別設(shè)為4、15、25、37 ℃,浸泡1 h后進行測定,結(jié)果見表5。由表5可知,4 ℃浸泡條件下,僅毛肚中檢出了氨基脲,鴨腸和黃喉中均為未檢出氨基脲,可見,較低溫度下不利于生成氨基脲。在所考察的浸泡溫度內(nèi),隨著浸泡溫度的升高,氨基脲的生成量逐漸增加,氨基脲的生成量與浸泡時間呈正相關(guān)性?？赡苁且驗榻轀囟壬?動物組織纖維空隙增大,與次氯酸鈉接觸的表面積也隨之增加,反應(yīng)更充分,產(chǎn)生的氨基脲也就越多。25 ℃浸泡條件氨基脲生成量是15 ℃浸泡條件下的約2～4倍,但37 ℃浸泡條件氨基脲生成量較25 ℃浸泡條件下變化較小,可能是因為溫度超過30 ℃后,次氯酸鈉容易分解,導(dǎo)致氨基脲生成量變化不顯著。因此,利用次氯酸鈉消毒處理水發(fā)食品時,應(yīng)控制溫度低于15 ℃。

表5 浸泡溫度對氨基脲產(chǎn)生量的影響Table 5 Effects of soaking temperature on the production of semicarbazide

2.5 漂洗次數(shù)對氨基脲產(chǎn)生量的影響

25 ℃條件下,采用pH為7、質(zhì)量濃度為1 g/L次氯酸鈉溶液浸泡毛肚、鴨腸和黃喉,浸泡1 h后,分別用清水漂洗1次和2次,漂洗時間為5 min,漂洗后進行測定,結(jié)果見表6。由表6可知,經(jīng)第1次漂洗后,氨基脲降低較多,第2次漂洗后,氨基脲較第1次漂洗變化較小。實驗說明水發(fā)食品在次氯酸鈉溶液作用下生成的氨基脲部分為游離態(tài),可經(jīng)清水漂洗適當(dāng)降低。

表6 漂洗次數(shù)對氨基脲產(chǎn)生量的影響Table 6 Effects of rinsing times on the production of semicarbazide

3 結(jié)論

本實驗在不同條件下采用次氯酸鈉消毒劑浸泡處理毛肚、鴨腸和黃喉等水發(fā)食品,研究結(jié)果顯示,經(jīng)次氯酸鈉消毒劑浸泡處理后水發(fā)食品中會生成氨基脲,且毛肚、鴨腸和黃喉等不同的水發(fā)食品氨基脲生成量存在差異。氨基脲的生成量與次氯酸鈉溶液質(zhì)量濃度、浸泡時間、浸泡溶液pH、浸泡溫度呈正相關(guān)性;而漂洗可有效減少氨基脲的生成。利用次氯酸鈉溶液消毒處理水發(fā)食品時,應(yīng)盡量用質(zhì)量濃度小于0.5 g/L、pH值7～9的次氯酸鈉在溫度低于15 ℃、0.5 h內(nèi)進行,且處理后用清水漂洗。水發(fā)食品中的氨基脲不僅來源于動物源性食品前期飼養(yǎng)階段使用的呋喃西林藥物,還與食品消毒處理過程中使用的次氯酸鈉有關(guān)系。因此,水發(fā)食品生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)過程應(yīng)控制和減少使用次氯酸鈉消毒劑,盡量避免氨基脲污染給人體健康帶來的危害。