陳靚,田星,鄒雅倩,慕佳,陳絮蒙

(湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,湖南 長(zhǎng)沙,410208)

代謝綜合征(metabolic syndrome, MS)是由多種代謝紊亂狀態(tài)構(gòu)成的癥候群,表現(xiàn)為中心肥胖、血糖血脂異常、胰島素抵抗等核心癥狀,是進(jìn)一步造成代謝性疾病和心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素,嚴(yán)重并長(zhǎng)期影響人類生命健康[1]。當(dāng)前,由于人們飲食習(xí)慣和生活方式的不斷變化,導(dǎo)致全球代謝綜合征患病率持續(xù)上升。該項(xiàng)疾病機(jī)制復(fù)雜、病程長(zhǎng)、并發(fā)癥多,藥物治療難度較大。近年來,大量研究表明一些藥食同源的天然植物及其提取物對(duì)代謝綜合征的防治具有較好效果[2-4],受到人們廣泛的關(guān)注。通過日常飲食積極開展代謝綜合征防控工作,具有較高的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

青錢柳 (CyclocaryaPaliurus)也被稱為金錢柳、金錢李等,是中國(guó)特有的一種寶貴植物資源。在湖南等南方多省,自古素有將青錢柳作為“甜茶”日常飲用的民間習(xí)俗,青錢柳的安全性和風(fēng)味在長(zhǎng)期使用中均得到認(rèn)可[5]。2013年,青錢柳被批準(zhǔn)為“新食品原料”[6],相關(guān)功能性食品被相繼研究開發(fā)。以青錢柳葉為原料研制的保健茶已成為國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品,這也是我國(guó)第一個(gè)獲美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證的保健茶,市場(chǎng)前景良好。雖然已有大量研究表明青錢柳中富含多糖、三萜、酚類等活性成分,其提取物具有降血糖、降血脂、降血壓等多種功效[7-9],但鮮見青錢柳調(diào)節(jié)糖脂代謝作用和機(jī)制的深入研究。因此,本研究通過長(zhǎng)期高果糖喂養(yǎng)誘導(dǎo)大鼠代謝綜合征模型,評(píng)價(jià)青錢柳對(duì)動(dòng)物糖脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用,探討其機(jī)制是否涉及炎癥及氧化應(yīng)激。最后通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析青錢柳作用于代謝綜合征的物質(zhì)基礎(chǔ)和潛在靶點(diǎn)-功能-通路,為深入研究開發(fā)青錢柳資源提供參考依據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD雄性大鼠,8～10周齡,體質(zhì)量280～320 g,SPF級(jí),合格證號(hào)SCXK(湘)2021-0002。湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購買及飼養(yǎng),實(shí)驗(yàn)方案(編號(hào)LLBH-202206220003)經(jīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案。

青錢柳干葉產(chǎn)地為湖南常德石門壺瓶山,由湖南省月嶺山農(nóng)林科技股份有限公司提供。

果糖、葡萄糖,上海麥克林生化科技股份有限公司;總膽固醇(total cholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL-C)、高密度脂蛋白(high-density lipoprotein,HDL-C)試劑盒,南京建成生物工程研究所有限公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)ELISA試劑盒,武漢博士德生物工程有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)試劑盒,京建成生物工程研究所有限公司;大鼠晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts,AGEs)ELISA試劑盒,江蘇菲亞生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YJCW20/1+1微壓煎藥機(jī),長(zhǎng)沙卓成醫(yī)療器械有限公司;CA-2610冷卻水循環(huán)裝置、NVP-2000隔膜真空泵,東京理化器械株式會(huì)社;R-1010旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;GA-3型血糖儀及試紙,三諾生物傳感股份有限公司;DLX-880 酶聯(lián)免疫儀,美國(guó)BIO-TEK儀器有限公司;RM2016病理切片機(jī),徠卡顯微系統(tǒng)(上海)貿(mào)易有限公司;真空冷凍干燥機(jī),美國(guó)LABCONCO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 青錢柳水提物制備

將青錢柳干葉加入10倍質(zhì)量的水浸泡30 min,待青錢柳葉軟化后放入提取罐,120 ℃煮沸后煎煮30 min。過濾后將剩余青錢柳葉繼續(xù)加8倍質(zhì)量的水,120 ℃煮沸后煎煮30 min。過濾后將2次所得的濾液合并,76 kPa、56 ℃旋蒸濃縮后冷凍干燥備用。

1.3.2 大鼠代謝綜合征模型構(gòu)建及分組

動(dòng)物在標(biāo)準(zhǔn)受控的環(huán)境中飼養(yǎng),條件為:溫度22～24 ℃,濕度55%,通風(fēng)良好,明/暗周期12 h。本研究意在探究青錢柳作為功能性食品長(zhǎng)期攝入對(duì)糖脂代謝紊亂的影響,而非不同攝入劑量的作用。因此,根據(jù)文獻(xiàn)[10-11]及前期預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇800 mg/kg·d作為青錢柳干預(yù)濃度。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,36只大鼠隨機(jī)分成4組,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為:正常對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱正常組,n=9)、代謝綜合征模型組(以下簡(jiǎn)稱模型組,n=9)、青錢柳水提物干預(yù)組(以下簡(jiǎn)稱青錢柳干預(yù)組,n=9)、青錢柳水提物對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱青錢柳對(duì)照組,n=9)。將10%(體積分?jǐn)?shù))果糖溶液替代飲用水供模型組和青錢柳干預(yù)組大鼠自由飲用,10周建立代謝綜合征模型。期間各組喂養(yǎng)及干預(yù)方式如圖1所示。每天對(duì)大鼠基本形態(tài)進(jìn)行觀察并記錄食物和飲水消耗量,每周測(cè)量一次體質(zhì)量和空腹血糖值。10周后,據(jù)“1.3.3節(jié)”方法完成口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test, OGTT)和胰島素耐量試驗(yàn) (insulin tolerance test, ITT),量取大鼠腰圍、體長(zhǎng),并根據(jù)公式(1)計(jì)算Lee′s指數(shù)[12]:

圖1 大鼠代謝綜合征模型構(gòu)建及干預(yù)方案Fig.1 Construction of rat metabolic syndrome model and intervention

(1)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,禁食不禁水(普通飲用水,下同)過夜,用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉。經(jīng)腹主動(dòng)脈插管取血,靜置過夜后離心取上清,分離血清;處死大鼠后迅速分離并漂洗肝臟組織,用濾紙盡量吸干水分后稱取組織質(zhì)量,按個(gè)體肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量計(jì)算相應(yīng)肝臟指數(shù)[13]。將用于組織切片的肝臟組織浸泡于4%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛中,過夜后更換浸泡液。其他肝臟組織加入9倍組織質(zhì)量的冰生理鹽水,組織勻漿機(jī)研磨后離心取上清。

1.3.3 OGTT和ITT

OGTT:大鼠禁食不禁水12 h,測(cè)量0 min時(shí)血糖水平。后經(jīng)灌胃立即給予大鼠 1.5 g/kg葡萄糖溶液(0.3 g/mL),測(cè)量15、30、60、90、120 min時(shí)血糖水平。

ITT:大鼠禁食不禁水6 h,測(cè)量0 min時(shí)血糖水平。后立即腹腔注射1.6 mL/kg胰島素注射液(0.3 U/mL),測(cè)量15、30、60、90、120 min時(shí)血糖水平。

1.3.4 肝臟HE染色及病理評(píng)分

經(jīng)固定-脫水-包埋-切片-脫蠟等常規(guī)步驟后,對(duì)各組大鼠肝臟標(biāo)本進(jìn)行HE染色。鏡下觀察、拍照并據(jù)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[14]為:結(jié)構(gòu),組織結(jié)構(gòu)正常清晰、細(xì)胞形態(tài)排列整齊(0分);組織結(jié)構(gòu)正常清晰、細(xì)胞形態(tài)排列輕微變形、偶見脂滴空泡(1分);組織結(jié)構(gòu)改變、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯變形、較多脂滴空泡(2分);組織結(jié)構(gòu)顯著異常、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)明顯變形、大量脂滴空泡(3分);大面積空泡樣病變(4分)。炎癥,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(0分);有輕微炎性浸潤(rùn)(1分);有較多炎性浸潤(rùn)(2分);有顯著炎性浸潤(rùn)顯著(3分);有炎性壞死(4分)。胞質(zhì)染色,胞質(zhì)染色均一(0分);胞質(zhì)染色輕微變化(1分);胞質(zhì)染色明顯(2分);胞質(zhì)染色顯著變化(3分);組織壞死(4分)。將同一肝臟組織的結(jié)構(gòu)、炎癥、胞質(zhì)染色評(píng)分相加,即為該樣本的肝臟病理評(píng)分。

1.3.5 血清及肝臟組織生化指標(biāo)測(cè)定

按試劑盒說明測(cè)定大鼠血清和肝臟組織中TC、TG、LDL-C和HDL-C。

1.3.6 血清及肝臟組織炎癥因子、氧化應(yīng)激和AGEs水平測(cè)定

按ELISA試劑盒說明測(cè)定大鼠血清及肝臟組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和AGEs水平。按檢測(cè)試劑盒說明測(cè)定大鼠肝臟組織SOD活力和GSH、MDA水平,以反映其氧化應(yīng)激狀態(tài)。BCA法測(cè)定肝臟勻漿樣本蛋白濃度以校正結(jié)果。

1.3.7 青錢柳活性成分篩選及靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

因多個(gè)數(shù)據(jù)庫中均無法找到青錢柳相關(guān)有效成分,故以“青錢柳”和“Cyclocaryapaliurus”為主題詞檢索文獻(xiàn),進(jìn)行活性成分篩選。Uniport數(shù)據(jù)庫 (https://beta.uniprot.org/)比對(duì)靶點(diǎn)蛋白標(biāo)準(zhǔn)名稱,Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫 (http://www.swisstargetprediction.ch/)估測(cè)青錢柳活性成分的潛在靶點(diǎn)。

在Drugbank (https://go.Drugbank.com/)、GenecardS (https://www.genecards.org/ds)、Omim (https://omim.org/)等數(shù)據(jù)庫檢索代謝綜合征相關(guān)疾病靶點(diǎn),并結(jié)合Venny 2.1.0 (https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)構(gòu)建有效成分靶點(diǎn)與代謝綜合征的韋恩圖。

在Cytoscape 3.9.1軟件中導(dǎo)入交集靶點(diǎn)并進(jìn)行分析,完成“青錢柳-成分-靶點(diǎn)-代謝綜合征”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。利用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)得到青錢柳干預(yù)代謝綜合征的主要有效成分,以連接度、介度和緊密度中位數(shù)作為其閾值篩選出有效成分。

1.3.8 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和生物功能預(yù)測(cè)

借助String數(shù)據(jù)庫 (https://cn.string-db.org/)對(duì)青錢柳與代謝綜合征的相關(guān)交集靶點(diǎn)進(jìn)行蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò) (protein-protein interaction,PPI)構(gòu)建與分析,置信度≥0.4。使用Cytoscape軟件,以自由度、中介中心度、接近中心度、鄰里連通性中位數(shù)為閾值篩選相關(guān)核心靶點(diǎn)。

將找到的交集靶點(diǎn)信息導(dǎo)入David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp),完成KEGG通路富集分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 26.0軟件統(tǒng)計(jì),GraphPad Prism 9軟件作圖。組間差異采用One-Way ANOVA或ANCOVA檢驗(yàn)分析,雙側(cè)P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠基本狀態(tài)和體型

自由飲用果糖溶液后,模型組和青錢柳干預(yù)組大鼠的攝食量均有下降趨勢(shì),而飲水量則明顯增加。果糖為能量性甜味劑,提供的能量使大鼠產(chǎn)生飽腹感,這可能是其攝食意愿降低的主要原因。此外,果糖造成了大鼠血漿高滲狀態(tài),進(jìn)而增加其飲水意愿。造模10周后,模型組大鼠體態(tài)肥胖、行動(dòng)遲緩、精神不振、狂躁易怒,青錢柳干預(yù)組大鼠體態(tài)基本正常、活動(dòng)能力強(qiáng)、精神狀態(tài)良好、不易煩躁,說明青錢柳能明顯改善果糖給大鼠帶來的形態(tài)和精神狀態(tài)變化。青錢柳對(duì)照組大鼠和正常組大鼠基本狀態(tài)無異常表現(xiàn)。

體質(zhì)量反映了機(jī)體整體代謝水平。如圖2-A所示,果糖溶液自由飲用2周后,模型組和青錢柳干預(yù)組大鼠體重相較于正常組略有下降,結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (P>0.05),這可能是由于該組大鼠食物攝入量降低造成。4周后,模型組大鼠體質(zhì)量較正常組顯著升高(P<0.01),且此顯著性差異一直保持至第10周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。這與前人所建代謝綜合征模型特點(diǎn)一致,長(zhǎng)期高果糖攝入可造成大鼠肥胖[15]。4周時(shí),青錢柳干預(yù)組大鼠體質(zhì)量較模型對(duì)照組顯著下降(P<0.01),且此優(yōu)勢(shì)一直保持至10周實(shí)驗(yàn)結(jié)束。青錢柳對(duì)照組大鼠與正常組相比,體質(zhì)量結(jié)果無顯著性差異(P>0.05)。表明青錢柳水提物可使果糖誘導(dǎo)的大鼠體質(zhì)量增加逐步回歸正常,有效降低其患代謝綜合征風(fēng)險(xiǎn)。

A-體質(zhì)量變化;B-腰圍;C-Lee’s指數(shù)圖2 各組大鼠體型變化Fig.2 Body size of rats注:與正常組比較,*表示P<0.05,**表示P<0.01;與模型組比較,#表示P<0.05,##表示P<0.01(下同)。

腰圍是判斷機(jī)體腹型肥胖的重要指標(biāo),代謝綜合征核心表現(xiàn)之一即為中心性肥胖。如圖2-B所示,果糖溶液自由飲用10周后,模型組大鼠腰圍較正常組顯著增加(P<0.01)。青錢柳水提物能顯著改善果糖造成的腰圍增加(P<0.01),且對(duì)正常飲食的大鼠腰圍沒有影響(P>0.05)。Lee′s指數(shù)是評(píng)價(jià)成年大鼠肥胖的關(guān)鍵性指標(biāo)。10周后,各組大鼠Lee′s指數(shù)結(jié)果(圖2-C)趨勢(shì)與腰圍變化趨勢(shì)(圖2-B)完全一致。體重、腰圍及Lee′s指數(shù)結(jié)果共同說明青錢柳水提物可有效調(diào)節(jié)代謝紊亂狀態(tài),改善果糖誘導(dǎo)的大鼠體態(tài)變化。

2.2 大鼠肝臟變化

肝臟是機(jī)體最為重要的代謝中心,當(dāng)肝臟被代謝性疾病影響將直接反映為肝臟脂質(zhì)堆積及質(zhì)量變化[16]。在本研究中(表1),模型組大鼠肝臟指數(shù)和肝臟組織TC、TG水平較正常組均顯著增加(P<0.01)。青錢柳水提物可有效控制果糖誘導(dǎo)的肝臟指數(shù)(P<0.05)和肝臟組織TC、TG水平變化(P<0.01),提示青錢柳對(duì)肝臟的保護(hù)作用。

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)、肝臟TC、TG水平變化Table 1 Liver index, TC, and TG levels in the liver of rats

通過HE染色,對(duì)各組大鼠的肝臟進(jìn)行了病理學(xué)檢查及評(píng)分,以進(jìn)一步觀察實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物肝臟的變化。如圖3-A所示,正常組和青錢柳對(duì)照組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)正常清晰、細(xì)胞形態(tài)排列整齊,無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)且胞質(zhì)染色均一。模型組大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)異常、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變形、出現(xiàn)大量脂滴空泡及炎性浸潤(rùn)、同時(shí)胞質(zhì)染色也出現(xiàn)變化。青錢柳干預(yù)組大鼠肝臟組織病理形態(tài)改變不明顯,相較于模型組趨于正常水平,病理學(xué)評(píng)分平均值較模型組降低45%,結(jié)果有顯著性差異(P<0.05)(圖3-B)。驗(yàn)證了青錢柳對(duì)于肝臟的保護(hù)作用,同時(shí)提示青錢柳可能通過調(diào)節(jié)肝臟糖脂代謝,改善果糖引起的代謝綜合征變化。

A-肝臟HE染色(100×);B-肝臟病理評(píng)分圖3 各組大鼠肝臟病理變化Fig.3 Pathological changes in the liver of rats

2.3 大鼠糖脂代謝變化

代謝綜合征中多種代謝紊亂聚集,已有多項(xiàng)研究報(bào)道高果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征模型將出現(xiàn)糖脂代謝紊亂,血糖、血脂均改變明顯[17]。如圖4-A所示,高果糖喂養(yǎng)前期,模型組大鼠空腹血糖逐步升高,但與正常組比較并無明顯改變(P>0.05)。果糖喂養(yǎng)6周后至第10周實(shí)驗(yàn)結(jié)束,模型組大鼠空腹血糖始終維持在較高水平,與正常組差異明顯(P<0.01)。青錢柳干預(yù)組大鼠空腹血糖值一直處于正常范圍內(nèi),該組大鼠自第8周起空腹血糖值與模型組差異明顯(P<0.01)。OGTT(圖4-B)試驗(yàn)結(jié)果顯示,通過10周的干預(yù),模型組大鼠血糖調(diào)節(jié)能力降低(P<0.05),而青錢柳能顯著提高其糖耐量(P<0.05)。ITT(圖4-C)試驗(yàn)結(jié)果可見,模型組大鼠胰島素敏感性降低,青錢柳能一定程度改善其胰島素敏感性,但除60 min時(shí)青錢柳組血糖改變與模型組比較有顯著性差異外(P<0.05),其他各時(shí)間點(diǎn)2組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

A-空腹血糖;B-OGTT;C-ITT圖4 各組大鼠糖代謝變化Fig.4 Glucose metabolism of rats

血脂四項(xiàng)是臨床脂代謝異常相關(guān)疾病的經(jīng)典檢測(cè)指標(biāo),共同反映著機(jī)體一段時(shí)間內(nèi)的脂質(zhì)代謝情況。如表2所示,與正常組相比,模型組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平顯著升高(P<0.01)、HDL-C水平顯著降低(P<0.05),說明在高果糖喂養(yǎng)的長(zhǎng)期影響下模型組大鼠已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的血脂紊亂。青錢柳干預(yù)組大鼠血清TC、TG和LDL-C水平與模型組相比顯著降低(P<0.01),HDL-C水平無顯著變化(P>0.05)。

表2 各組大鼠血脂變化Table 2 Blood fat of rats

2.4 大鼠血清及肝臟炎癥因子水平

近年來,免疫炎癥已成為代謝性疾病研究的熱門方向。自HOTAMISLIGIL等[18]首次在糖尿病和肥胖動(dòng)物的脂肪中發(fā)現(xiàn)炎癥因子TNF-α表達(dá)顯著升高后,又有諸多研究證實(shí)其他代謝類疾病也伴隨有整體和/或局部炎癥水平的升高[19-21],慢性炎癥反應(yīng)已被肯定為代謝性疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素。青錢柳中富含多糖、三萜、酚類等活性成分。彭曉娟等[22]在非酒精性脂肪性肝病合并2型糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn),青錢柳多糖和青錢柳黃酮能顯著減輕該模型大鼠肝臟脂肪變性及炎癥反應(yīng)。在本研究的肝臟組織病理學(xué)染色結(jié)果中(圖3),也觀察到相似現(xiàn)象。因此推測(cè)青錢柳對(duì)代謝綜合征大鼠糖脂代謝的改善可能涉及炎癥調(diào)節(jié)。

為證實(shí)以上推論,研究檢測(cè)了各組大鼠血清炎癥因子水平,以觀察青錢柳水提物對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物免疫炎癥的影響。結(jié)果如圖5-A～5-C所示,模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平,與正常組比較顯著上升(P<0.01)。青錢柳干預(yù)組大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平,與模型組比較顯著下降(P<0.01)。這一結(jié)果表明,長(zhǎng)期高果糖喂養(yǎng)將使機(jī)體處于炎癥紊亂狀態(tài)并誘導(dǎo)的代謝綜合征的發(fā)生,而青錢柳可顯著減輕其整體炎癥反應(yīng)。肝臟作為代謝綜合征病理改變的核心靶器官,其局部組織炎癥處于整體炎癥風(fēng)暴中心。在本研究中,大鼠肝臟微環(huán)境的炎癥水平(圖5-D～圖5-F)同整體的炎癥水平趨向一致,進(jìn)一步驗(yàn)證了青錢柳糖脂代謝調(diào)節(jié)機(jī)制可能涉及免疫炎癥這一假說。

A-血清TNF-α;B-血清IL-1β;C-血清IL-6;D-肝臟TNF-α;E-肝臟IL-1β;F-肝臟IL-6圖5 各組大鼠血清及組織炎性因子水平Fig.5 Inflammatory factors levels in serum and tissue of rats

2.5 大鼠肝臟氧化應(yīng)激水平

氧化應(yīng)激通常伴隨炎癥共同發(fā)生[23],特別是肝臟微環(huán)境中的氧化應(yīng)激強(qiáng)關(guān)聯(lián)肝臟糖脂代謝紊亂,推動(dòng)著代謝綜合征的發(fā)生發(fā)展[24]。如圖6所示,與正常組比較,模型組大鼠肝臟中SOD活力和GSH水平明顯下降(P<0.01),而MDA水平則明顯升高(P<0.01),提示果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征模型大鼠肝臟微環(huán)境中存在明顯的氧化應(yīng)激損傷。與模型組比較,青錢柳干預(yù)組大鼠肝臟SOD活力和GSH水平明顯升高(P<0.01),而MDA水平則明顯降低(P<0.01)。說明青錢柳可有效改善果糖誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化及氧化損傷,減輕代謝綜合征誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)。

A-肝臟SOD;B-肝臟GSH;C-肝臟MDA圖6 各組大鼠肝臟氧化應(yīng)激水平Fig.6 Oxidative stress levels in the liver of rats

2.6 “青錢柳-成分-靶點(diǎn)-代謝綜合征”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)

傳統(tǒng)的藥用植物研究基于“單一成分-單一靶點(diǎn)-單一途徑”思路,目前青錢柳物質(zhì)基礎(chǔ)和功能機(jī)制研究割裂,不利于后續(xù)開發(fā)利用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可利用計(jì)算機(jī)高級(jí)算力從海量文獻(xiàn)及數(shù)據(jù)庫中篩選化學(xué)成分靶點(diǎn),構(gòu)建“疾病-靶點(diǎn)-藥物-成分”等多層次網(wǎng)絡(luò),有助于整體性闡明青錢柳不同成分與疾病靶點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性[25]。本研究經(jīng)文獻(xiàn)查閱共獲得青錢柳化學(xué)成分354個(gè),經(jīng)過篩選后保留有效活性成分166個(gè),并將其重新編號(hào)為QQL1-166。通過數(shù)據(jù)庫比對(duì)、整合后,獲得445個(gè)青錢柳活性成分的潛在靶點(diǎn)。

在GenecardS(2 099個(gè))、OMIM(1 261個(gè))、Drugbank(9個(gè))共3個(gè)數(shù)據(jù)庫檢索、整合后,獲得2 637個(gè)代謝綜合征疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將2 637個(gè)疾病靶點(diǎn)與445個(gè)青錢柳靶點(diǎn)繪制韋恩圖以獲取交集靶點(diǎn),得到交集靶點(diǎn)169個(gè)。

基于以上有效成分及交集靶點(diǎn)篩選,完成“青錢柳-成分-靶點(diǎn)-代謝綜合征”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建(圖7)。該網(wǎng)絡(luò)包括228個(gè)節(jié)點(diǎn),580條邊。以連接度≥2、介度≥0.000 871 060 956 581 262及緊密度≥0.330 915 065 722 952,即中位數(shù)為閾值篩選。其中青錢柳中46種有效成分、47個(gè)潛在靶點(diǎn)達(dá)到閾值,進(jìn)一步提示藥食同源植物青錢柳“多成分-多靶點(diǎn)”的作用特點(diǎn)。

圖7 “青錢柳-成分-靶點(diǎn)-代謝綜合征”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖Fig.7 “Component-target-disease” relationship network

將上述結(jié)果以連接度、介度、緊密度排序,發(fā)現(xiàn)前十的活性成分基本為酚類化合物(表3)。目前已有多項(xiàng)研究提示青錢柳黃酮類和青錢柳酚酸調(diào)節(jié)代謝的可能作用[26-28],佐證該項(xiàng)分析結(jié)果。有趣的是,除巨大的藥用潛力外,植物中的酚類物質(zhì)通常還決定其感官風(fēng)味[29]。因此,有理由認(rèn)為青錢柳酚類物質(zhì)將是未來功能食品開發(fā)的重要部位。

表3 青錢柳干預(yù)代謝綜合征活性成分(前10)的拓?fù)鋵W(xué)參數(shù)Table 3 Topological parameters of the active components of cyclocarya interfering with metabolic Syndrome (Top 10)

2.7 PPI網(wǎng)絡(luò)及KEGG通路富集分析

將169個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入數(shù)據(jù)庫,隱藏沒有作用關(guān)系的節(jié)點(diǎn),繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。該網(wǎng)絡(luò)共167個(gè)節(jié)點(diǎn),2 964條邊。以自由度≥12、中介中心度≥0.072 817 303、接近中心度≥0.509 090 909、鄰里連通性≥54.583 333 33,即中位數(shù)為閾值進(jìn)一步篩選相關(guān)靶點(diǎn),最終得到青錢柳干預(yù)代謝綜合征的潛在靶點(diǎn)共20個(gè),相互關(guān)系如圖8-A所示。在這20個(gè)強(qiáng)相關(guān)靶點(diǎn)中,IL、SOD、NOS等多項(xiàng)炎癥、氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)與本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果指向一致并相互印證,提示青錢柳干預(yù)代謝綜合征的作用機(jī)制涉及炎癥及氧化應(yīng)激。

為預(yù)測(cè)青錢柳作用可能涉及通路,將169個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集。分析后共得到141條通路,排名前20的通路如圖8-B所示。其中AGE-RAGE信號(hào)通路的可信度位居首位。AGE是由葡萄糖、果糖等還原糖分子與機(jī)體物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)形成的配體,有多種形式。AGEs與細(xì)胞膜上對(duì)應(yīng)的受體RAGE結(jié)合產(chǎn)生效應(yīng),啟動(dòng)下游信號(hào)級(jí)聯(lián),廣泛參與代謝性疾病、動(dòng)脈粥樣硬化及神經(jīng)退行性病變等多種疾病的發(fā)生發(fā)展[30-31]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組大鼠AGEs水平變化,以驗(yàn)證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果。在血清(圖8-C)和肝臟組織(圖8-D)中,模型組AGEs水平相較于正常組顯著升高(P<0.01),青錢柳干預(yù)組AGEs水平相較于模型組則顯著降低(P<0.01)。體內(nèi)AGEs的形成受多因素影響,血糖濃度和機(jī)體代謝能力是其中較為重要的影響因素[32]。高糖狀態(tài)下,大量AGEs產(chǎn)生后作用于受體,激活NF-κB等信號(hào),上調(diào)氧化應(yīng)激水平、引起炎癥反應(yīng),進(jìn)而加劇疾病發(fā)展[33]。新近研究發(fā)現(xiàn),許多天然化合物可抑制內(nèi)源性AGEs的形成并控制疾病發(fā)展[34]。因此,推測(cè)青錢柳可能通過抑制內(nèi)源性AGEs生成發(fā)揮抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用,AGE-RAGE可能是青錢柳抗代謝綜合征的關(guān)鍵性通路。

3 結(jié)論

作為一種功能性甜味劑或能量補(bǔ)充,果糖早已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)。現(xiàn)代加工食品和飲品中大量添加果糖或果葡糖漿以改善風(fēng)味,造成全球果糖消費(fèi)逐年上升。果糖在帶來“甜蜜”的同時(shí),也在逐漸侵蝕著人民的美好生活。高果糖飲食造成的糖脂代謝異常將影響人體健康,顯著增加代謝綜合征的發(fā)生率和心血管疾病死亡率[35]。本研究建立了果糖誘導(dǎo)的代謝綜合征模型,通過10周的干預(yù),結(jié)果顯示青錢柳水提物可顯著改善果糖誘導(dǎo)的大鼠基本狀態(tài)、體型、肝臟變化和糖脂代謝紊亂。這一作用可能與青錢柳緩解肝臟脂質(zhì)過氧化及氧化損傷,調(diào)節(jié)整體及肝臟微環(huán)境中免疫炎癥作用有關(guān)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果相互印證,同時(shí)提示其發(fā)揮糖脂代謝調(diào)節(jié)的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為酚類物質(zhì),涉及AGE-RAGE等信號(hào)通路。此外,在本研究中,長(zhǎng)期灌胃青錢柳水提物的大鼠并未出現(xiàn)明顯不良反應(yīng),一定程度上說明了青錢柳作為功能食品長(zhǎng)期使用的安全性。

綜上所述,本研究運(yùn)用動(dòng)物模型和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,探究青錢柳水提物對(duì)果糖誘導(dǎo)的大鼠代謝綜合征模型糖脂代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用,并從炎癥和氧化應(yīng)激的角度初步探討了青錢柳的糖脂代謝調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明,青錢柳用于代謝綜合征防治的潛力較大,并有利于其應(yīng)用于功能性健康食品開發(fā)。后期可通過深入研究AGE-RAGE等相關(guān)信號(hào)通路,進(jìn)一步研究青錢柳對(duì)于糖脂代謝調(diào)節(jié)的具體作用機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)。