陳珊珊,韓冷,程玉嬌,李貴節(jié)*,馮瑞章,劉雯雯,孫志高*

1(西南大學,柑桔研究所,重慶,400712)2(國家柑桔工程技術研究中心,重慶,400712)3(宜賓學院,香料植物資源開發(fā)與利用四川省高校重點實驗室,宜賓 四川,644000)

枳殼(Fructusaurantii)為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實,具有治療胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化等功效[1],不僅可作為原料添加到功能性食品中,也能直接作為中藥材。不同柑橘品種黃烷酮種類和含量也不一樣,如枳殼中主要黃烷酮成分新橙皮苷和柚皮苷分別為5.6%和 4.11%[2],其含量的高低直接影響枳殼的藥理作用,因此分析、提取和研究枳殼中這兩種功能成分,將對枳殼的中藥現(xiàn)代化及藥食同源開發(fā)及應用具有重要意義。新橙皮苷具有減肥[3]、抑制股骨頭壞死[4]、減輕肺纖維化[5]、保護神經系統(tǒng)[6]、抗癌[7]等藥理作用。柚皮苷具有抗骨質疏松[8]、動脈粥樣硬化[9]、過敏[10]、促進細胞凋亡[11]、調節(jié)微生物活性[12]等作用。此外,新橙皮苷和柚皮苷在調味品中也都有很大的應用價值,其對應的二氫查爾酮(新橙皮苷二氫查爾酮和柚皮苷二氫查爾酮)相對蔗糖甜度值分別為1 000和300[13],是優(yōu)良的零熱量新型甜味劑。

傳統(tǒng)提取類黃酮化合物的方法主要有水浴回流提取、索氏提取、醇提酸析、堿提酸析等[14],但這些提取技術普遍存在工藝耗時長、有機溶劑成本高、萃取率低、生物活性成分易降解等缺陷。因此,為了克服傳統(tǒng)提取技術的缺陷,國內外已開發(fā)出新的提取技術,如雙水相(aqueous two-phase,ATP)提取技術、半仿生-酶法提取技術[15]、閃式提取技術[16]等。其中,雙水相提取技術是一種利用目標化合物在兩種互不相溶的兩水相間選擇性的分配,而實現(xiàn)分離的技術,可一步實現(xiàn)目標化合物的提取和初步純化[17],別具優(yōu)勢。近年來,有機溶劑-鹽系統(tǒng)具有價格低廉、綠色環(huán)保、傳質與平衡反應迅速、回收效率高等特點,在提取和分離植物中的天然活性物質方面得到了廣泛應用?；陔p水相提取技術獨特的分離優(yōu)勢,已經將其與其他提取技術結合起來[18],從而實現(xiàn)更高的提取分離效果。超聲輔助提取是目前應用最廣泛的一種提取技術,不僅能增加產品的得率、縮短提取時間,還能降低理化傷害[19]。酶輔助提取因具有高效、環(huán)境友好、易于操作等優(yōu)點在食品工業(yè)中被廣泛應用[20]。本文結合雙水相提取、超聲輔助提取及酶輔助提取技術三者獨特的優(yōu)勢,擬開發(fā)一種更高效和綠色環(huán)保的提取方法,它被定義為超聲-酶輔助雙水相提取技術(ultrasonic-enzyme assisted aqueous two-phase extraction,UEA-ATPE)。

本文以重慶銅梁枳殼為原料,將黃烷酮新橙皮苷和柚皮苷的得率作為考察指標,篩選最適的雙水相體系作為提取劑,將超聲輔助提取與酶輔助提取應用于黃烷酮的提取,并通過制備型液相色譜、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)、傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)、高分辨質譜(high-resolution mass spectrometry,HR MS)等方法對提取物做分離、純化和鑒定,以期為枳殼功能成分的高效提取利用提供基礎實驗和方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枳殼,產自重慶銅梁(40目篩);乙醇(分析純)、新橙皮苷(分析對照品,≥98%)、柚皮苷(分析對照品,≥98%)(色譜級),ACMEC公司;Na2SO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl(均為分析純)、磷酸、乙腈(色譜級),麥克林Macklin公司;酸性果膠酶(300 000 U/g)、酸性纖維素酶(500 000 U/g)、中性蛋白酶(150 000 U/g),山東隆科特酶制劑有限公司。

1.2 儀器與設備

DF101S集熱式恒溫磁力攪拌器,鄭州長城科工貿有限公司;DP-800超聲波清洗器,上海生析超聲儀器有限公司;L-550臺式低速大容量離心機,長沙湘儀離心機儀器有限公司;RE52CS-2旋轉蒸發(fā)儀,上海亞榮生化儀器廠;LC-1260高效液相色譜儀,德國安捷倫科技有限公司;AS20005半制備液相色譜儀,江蘇漢邦科技有限公司;600 MHz核磁共振波譜儀、BRUKER TENSOR 27傅里葉變換紅外光譜儀FT-IR、impact II高分辨率質譜儀,德國布魯克儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 超聲輔助雙水相提取枳殼黃烷酮的工藝研究

1.3.1.1 雙水相體系的確定

采用濁點滴定法[21]分別考察Na2SO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl/乙醇的成相能力,根據(jù)試驗結果選擇合適的無機鹽繪制相圖。稱取無機鹽3.6 g于50 mL具塞試管中,分別加入12.4 g去離子水溶解,再將乙醇滴加于鹽溶液中,以澄清液剛好變?yōu)槿闈嵋簽榈渭咏K點,記下對應的乙醇質量(m1);體系再滴加去離子水,以乳濁液剛好變?yōu)槌吻逡簽榈渭咏K點,記下對應的去離子水質量(m2)。以無機鹽質量分數(shù)(%)為橫坐標、乙醇質量分數(shù)(%)為縱坐標,繪制雙水相圖。

1.3.1.2 單因素試驗

枳殼粉碎后取0.5 g置于50 mL離心管中,加入20 g雙水相溶劑,磁力攪拌器混合均勻后于50 ℃超聲處理30 min,真空泵抽濾后于分液漏斗中靜置1 h,待體系平衡后取出上相提取液,低溫貯存過夜除去部分鹽,4 200 r/min離心10 min后,再經0.22 μm微孔濾膜過濾,備用。通過單因素試驗分別研究乙醇質量分數(shù)(23%、25%、27%、29%、31%、33%)、(NH4)2SO4質量分數(shù)(15%、17%、19%、21%、23%、25%)和超聲功率(40、70、100、130、160、190 W)對新橙皮苷和柚皮苷得率的影響。

1.3.1.3 響應面設計

在單因素試驗基礎上,以乙醇質量分數(shù)(A)、(NH4)2SO4質量分數(shù)(B)、超聲功率(C)為自變量,新橙皮苷和柚皮苷得率為響應值,按照Box-Behnken設計試驗,篩選出超聲輔助雙水相提取枳殼黃烷酮的最佳工藝參數(shù),因素與水平設計見表1。

表1 響應面分析與因素水平Table 1 Response surface analysis factors and levels

1.3.2 新橙皮苷、柚皮苷的含量測定

采用《中國藥典》[1]枳殼中新橙皮苷、柚皮苷的含量測定方法:Eclipse-XD8-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),V(乙腈)：V(水)=20：80(pH用冰醋酸調整為3),檢測波長為283 nm。分別吸取新橙皮苷(390 μg/mL)和柚皮苷(385 μg/mL)對照品儲備液1.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL,分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容。以對照品質量濃度梯度(μg/mL)為橫坐標,峰面積(mUA)為縱坐標,繪制標準曲線,新橙皮苷:y=10.59x-42.77(R2=0.999 7,線性范圍39～351 μg/mL);柚皮苷:y=7.977 4x-6.91(R2=0.999 6,線性范圍38.5～346.5 μg/mL)。

1.3.3 UEA-ATPE提取枳殼黃烷酮的工藝研究

枳殼粉末取0.5 g置于50 mL離心管中,分別加入4.2 g (NH4)2SO4和10.4 g水使其充分溶解,然后加入5.4 g乙醇和0.05 g酶,用磁力攪拌器混合均勻,于50 ℃下水浴2 h后,在137 W下超聲30 min,后續(xù)處理同1.3.1.2節(jié)。本試驗先考察酶種類(纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶以及質量比1：1的復合酶,包括纖維素酶/果膠酶、纖維素酶/中性蛋白酶、中性蛋白酶/果膠酶),再根據(jù)酶種類試驗結果篩選復合酶比例(1：1、1：2、1：3、2：1、2：3、3：1、3：2)(質量比),酶總量為0.05 g,后續(xù)處理同1.3.1.2節(jié)。

1.3.4 不同提取方法比較

為研究本試驗新建立的提取方法與傳統(tǒng)和新型單一提取方法在提取枳殼黃烷酮方面的差異,試驗比較了超聲輔助雙水相、50%(體積分數(shù))乙醇浸漬、水煎法、90%(體積分數(shù))乙醇超聲輔助。實驗參數(shù)見表2。

表2 不同提取方法試驗參數(shù)Table 2 Experimental parameters of different extraction methods

1.3.5 UEA-ATPE提取物的分離、純化和鑒定

采用制備型液相色譜對UEA-ATPE上相提取液做進一步的分離純化。選擇色譜柱:C18(250 mm×9.4 mm,5 μm);以V(甲醇)：V(水)=45：55 (pH用冰醋酸調整為3)為流動相;流量3.5 mL/min;室溫;波長283 nm;樣品量為0.5 mL,于11.3～11.9 min內人工采集餾分。

將制備型液相色譜收集的餾分經旋轉蒸發(fā)后,獲得一種淡黃色粉末,取其中一部分溶解于甲醇后經分析型液相色譜測定,方法同1.3.2節(jié),并用峰面積歸一化法計算純度,剩余部分來做定性分析。采用NMR、FT-IR和HR MS等方法解析其結構,從而進一步對純化物質作定性確認。

a)NMR:稱取20 mg純化物質于核磁管中,加入0.6 mL DMSO-d6充分溶解,進行核磁共振碳譜和氫譜測定。通過分析各個峰的化學位移及裂分情況,初步確定其結構。

b)FT-IR:取適量純化物質與溴化鉀以質量比1：200混合壓片,壓片后在傅里葉紅外光譜儀上進行400～4 000 cm-1波長范圍掃描,分析圖譜主要特征吸收峰。

c)HR MS:取適量純化物溶于甲醇,在高分辨質譜正離子模式下全掃分析,取樣范圍(m/z)為50～1 300。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析處理

實驗設計與數(shù)據(jù)處理、繪圖采用Origin 2021、Excel 2019、SPSS 26.0、Design-Expert 8.0和ChemDraw17.0等軟件;所有樣品平行試驗3次,結果為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 超聲輔助雙水相提取枳殼黃烷酮條件的確定

2.1.1 雙水相體系的確立

2.1.1.1 乙醇與無機鹽構成雙水相體系的成相結果

表3顯示乙醇與多種無機鹽(Na2SO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3、Na2HPO4、KH2PO4、NaCl)構建雙水相體系的成相結果。Na2SO4、Na2CO3、(NH4)2SO4、K2CO3均能和乙醇形成雙水相,其中,Na2SO4迅速分層,靜置一會后下相出現(xiàn)沉淀;Na2CO3迅速分層后,上相渾濁;Na2HPO4、KH2PO4、NaCl均不能與乙醇形成雙水相。因此選擇(NH4)2SO4和K2CO3進一步考察相圖繪制。

表3 各雙水相體系的成相結果Table 3 Phase formation of various ATPS

2.1.1.2 K2CO3/(NH4)2SO4與乙醇相圖

根據(jù)試驗結果選擇成相能力較好的(NH4)2SO4和K2CO3并分別繪制與乙醇的相平衡圖,結果如圖1所示。曲線將體系劃分成兩個區(qū)域,曲線上方是一個兩相區(qū)域,上相主要含乙醇,下相主要含無機鹽;曲線下方是單相區(qū)域,表示不可形成雙水相。本試驗應從曲線上方選擇合適的無機鹽/乙醇組成,由圖1可知,(NH4)2SO4/乙醇的質量分數(shù)上下限均大于K2CO3/乙醇的質量分數(shù),結合表3各雙水相體系的成相結果,對比兩種雙水相體系成相特點,(NH4)2SO4/乙醇的成相能力強,所以在接下來的試驗中選擇(NH4)2SO4。

圖1 乙醇與不同無機鹽構成體系的相圖Fig.1 Phase diagrams of ATPS built by ethanol and different inorganic salts

2.1.2 單因素試驗結果

2.1.2.1 乙醇質量分數(shù)的確定

固定(NH4)2SO4質量分數(shù)19%、功率100 W、50 ℃超聲輔助提取30 min等條件下,試驗結果如圖2-a所示。隨著乙醇質量分數(shù)的增加,新橙皮苷和柚皮苷得率先增大后下降,當乙醇質量分數(shù)為27%時,兩者的得率都為最大值。這是因為隨著乙醇質量分數(shù)的增加,使得雙水相體系的極性更接近于兩者的極性,根據(jù)相似相溶原理[22],從而提高了兩者在雙水相體系中的溶解度,而當繼續(xù)增大乙醇質量分數(shù)時,雙水相體系提高了溶解其他有機物的能力,進而抑制了目標化合物的溶解[23]。因此,本試驗選擇乙醇質量分數(shù)為27%。

a-乙醇質量分數(shù)/%;b-(NH4)2SO4質量分數(shù)/%;c-超聲功率/W圖2 新橙皮苷和柚皮苷得率的單因素分析Fig.2 Analyses of single factors effecting on the yield of neohesperidin and naringin注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)。

2.1.2.2 (NH4)2SO4質量分數(shù)的確定

固定乙醇質量分數(shù)27%,其他參數(shù)不變,試驗結果如圖2-b所示。(NH4)2SO4質量分數(shù)的增加,兩者得率先是逐漸上升,當質量分數(shù)超過21%時則呈下降趨勢。這是因為(NH4)2SO4濃度的增加會促進雙水相體系上相中的疏水相向上相分配,從而提高了兩者得率,這與WANG等[24]在乙醇/鹽水溶液兩相系統(tǒng)-超聲法從橄欖葉中提取多酚有關(NH4)2SO4的趨勢變化結果相似。因此,本試驗選擇(NH4)2SO4的質量分數(shù)21%。

2.1.2.3 超聲功率的確定

固定乙醇、(NH4)2SO4質量分數(shù)分別為27%和21%,其他參數(shù)不變,試驗結果如圖2-c所示。功率在40～130 W時,隨著超聲功率的增加兩者得率持續(xù)增加,這是因為空化效應產生的能量,在一定程度上破壞了枳殼粉末組織和細胞壁,而導致兩者得率增加,但超過130 W因強烈的空化效應會導致兩者得率下降;同時超聲波作用時因高速振蕩也將枳殼粉末分散得更均勻[25],從而增加了兩者得率。故本試驗選擇超聲功率130 W。

2.1.3 響應面優(yōu)化超聲輔助雙水相提取黃烷酮的試驗結果

2.1.3.1 響應面結果及回歸模型

根據(jù)單因素試驗結果,設計3因素(A、B、C)3水平共17組響應面優(yōu)化試驗,得到二次回歸模型:新橙皮苷得率Y1=72.54+0.67A+4.63B+3.22C-5.42AB-3.64AC-3.97BC-6.27A2-5.64B2-4.81C2;柚皮苷得率Y2=59.85+0.033A+3.40B+2.62C-4.39AB-2.41AC-2.88BC-6.40A2-6.14B2-4.66C2。

a、d-乙醇質量分數(shù)和(NH4)2SO4質量分數(shù);b、e-乙醇質量分數(shù)和功率;c、f-(NH4)2SO4質量分數(shù)和功率圖3 新橙皮苷得率的響應面和等高線Fig.3 Response surfaces and contours of neohesperidin yield注:a～c為響應面圖;d～f為等高線圖

表4 二次響應面回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic response surface regression model

2.1.3.2 響應面驗證試驗

利用Design-expert 8.0軟件分析優(yōu)化枳殼中新橙皮苷、柚皮苷提取的最佳條件:乙醇質量分數(shù)26.61%、(NH4)2SO4質量分數(shù)21.84%、超聲功率137.06 W,新橙皮苷提取效果預測為73.83 mg/g,柚皮苷提取效果預測為60.62 mg/g。為了便于實際操作,對最佳條件進行優(yōu)化:乙醇質量分數(shù)27%、(NH4)2SO4質量分數(shù)21%、超聲功率137 W,其他參數(shù)同1.3.1.2節(jié)。經過3次平行試驗實際測得,新橙皮苷得率為(74.94±1.45) mg/g,柚皮苷得率為(61.05±1.42) mg/g,與預測值接近,說明該模型適用于超聲輔助雙水相提取新橙皮苷和柚皮苷的工藝優(yōu)化。

2.2 UEA-ATPE提取枳殼黃烷酮條件的確定

2.2.1 酶種類的確定

其他參數(shù)同響應面優(yōu)化結果,試驗結果如圖4-a所示。纖維素酶促進作用優(yōu)于果膠酶和中性蛋白酶,纖維素酶復合另外兩種酶后,促進作用變弱;中性蛋白酶/果膠酶促進作用強于其他兩種復合酶。由于枳殼中存在果膠,在加熱狀態(tài)下果膠大量溶出,提取液黏稠[26],增加了分離難度,故引入果膠酶提高新橙皮苷和柚皮苷的得率,它與中性蛋白酶復合使用后,兩者得率達到最大,這可能是因為枳殼種子中還含有蛋白質,引入中性蛋白酶有利于提高兩者得率,因此,本試驗后續(xù)選擇中性蛋白酶/果膠酶。

a-酶種類;b-酶質量比圖4 酶種類和比例對新橙皮苷和柚皮苷得率的影響Fig.4 Effects of different enzyme types and enzyme proportions on the yield of neohesperidin and naringin

2.2.2 酶比例的確定

選擇中性蛋白酶/果膠酶,其他參數(shù)同響應面優(yōu)化結果,試驗結果如圖4-b所示。1：2與1：3(質量比)的復合酶分別對兩者得率有類似的影響。1：1(質量比)的復合酶對兩者得率優(yōu)于其他幾種比例組合,不同酶組合比例對新橙皮苷得率的影響比柚皮苷大,究其原因可能是:a)本試驗枳殼提取液中新橙皮苷的含量高于柚皮苷,在適宜的酶處理條件下,柚皮苷的溶出量已達到飽和狀態(tài);b)新橙皮苷和柚皮苷的熱穩(wěn)定性和溶解度不一樣[27]。故綜合考慮,選擇質量比1：1,新橙皮苷和柚皮苷得率分別為(92.27±2.13)、(72.24±1.56) mg/g。

2.3 UEA-ATPE與其他提取方法得率的比較

結果如圖5所示,不同的提取工藝對新橙皮苷和柚皮苷得率有明顯的影響:UEA-ATPE>超聲輔助雙水相>50%乙醇浸漬>水煎法>90%乙醇超聲輔助,可能是由于雙水相的選擇特性,超聲輔助提取的空化作用,以及酶輔助提取的高效性能更大程度地破壞枳殼細胞壁結構,促進更多的黃烷酮被釋放出來。在5種方法中,新橙皮苷純度最高的是UEA-ATPE和超聲輔助雙水相,由于雙水相獨特的選擇性,蛋白質、多糖等雜質向下相轉移,可以實現(xiàn)新橙皮苷的初步分離,并簡化后續(xù)進一步純化操作。本試驗結果表明,一種適宜的鹽/乙醇雙水相體系可以作為提取植物中有效成分的溶劑,這與近年來的科研結果一致[28],同時超聲和酶輔助能大大提高目標化合物的提取效率。

圖5 不同提取方法對新橙皮苷和柚皮苷得率的影響Fig.5 Effects of different extraction methods on the yield of neohesperidin and naringin

2.4 UEA-ATPE提取物的分離、純化和鑒定

a-純化物質核磁共振碳譜圖;b-純化物質核磁共振氫譜圖;c-純化物質傅里葉紅外光譜圖;d-純化物質高分辨質譜圖附圖1 純化物質的核磁共振圖譜、傅里葉紅外光譜圖和高分辨質譜圖Fig.S1 NMR、FT-IR and HR MS of the purified substance

表5 純化物質的核磁共振數(shù)據(jù)Table 5 NMR data of purified substance

綜上NMR、FT-IR和HR MS所列結果該物質鑒定為新橙皮苷。

3 結論

本文建立了UEA-ATPE提取枳殼黃烷酮的工藝,并進行了參數(shù)優(yōu)化。試驗結果表明,最佳雙水相體系為 (NH4)2SO4/乙醇,乙醇和(NH4)2SO4質量分數(shù)分別為27%和21%,超聲功率137 W,中性蛋白酶/果膠酶質量比為1：1,新橙皮苷和柚皮苷得率分別達到(92.27±2.13)、(72.24±1.56) mg/g。比較了UEA-ATPE和傳統(tǒng)、新型單一提取等方法,結果表明UEA-ATPE得率最高,其提取液純化后經光譜分析,結果表明純化物質純度達99.37%,光譜分析鑒定為新橙皮苷。枳殼黃烷酮作為一種天然的食品成分,可用于抗炎、抗癌、保健品等方面,這為枳殼的新橙皮苷和柚皮苷的高效提取以及綜合開發(fā)利用提供參考。