劉瑞,劉郁琪,鐘金鋒,劉雄,覃小麗*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)2(食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心(西南大學(xué)),重慶,400715)

姜黃素是從姜黃提取出來的一類多酚化合物,因其具有良好的抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[1]而備受廣大研究者的青睞。然而,姜黃素具有水溶性低、遇熱不穩(wěn)定、在胃腸道中穩(wěn)定性差、口服生物利用度低等特性,因此限制了其在功能性食品和營(yíng)養(yǎng)制劑中的應(yīng)用[2]。研究表明姜黃素在納米脂質(zhì)體[3]、納米乳液[4]和納米復(fù)合物[5]等包埋體系中具有高溶解性和高穩(wěn)定性。因此,通過包埋體系解決姜黃素的穩(wěn)定性差、溶解性低的問題,對(duì)于擴(kuò)展姜黃素在功能性食品和營(yíng)養(yǎng)制劑中的應(yīng)用具有重要意義。

在構(gòu)建姜黃素包埋體系的材料中,多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物因其天然無毒、生物相容性、低免疫原性和生物可降解性而備受關(guān)注。YANG等[6]發(fā)現(xiàn)姜黃素的穩(wěn)定性和抗氧化活性在牛血清白蛋白-卡拉膠復(fù)合物的包埋下顯著提高。CHEN等[7]的研究表明大豆分離蛋白-大豆可溶性多糖復(fù)合物可作為姜黃素的良好載體,以提高其熱穩(wěn)定性和可控釋放率。在構(gòu)建多糖-蛋白質(zhì)復(fù)合物包埋體系的各種蛋白質(zhì)中,酪蛋白是一種含磷鈣的結(jié)合蛋白,具有來源廣泛、價(jià)格低、無毒和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)[8]。同時(shí)酪蛋白還具有兩親性,在水溶液中能自組裝成酪蛋白膠束,這種特性使酪蛋白成為開發(fā)包埋體系的合適材料,以包埋姜黃素等活性小分子[9]。然而,單獨(dú)的蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物穩(wěn)定性差,易被胃腸道中的蛋白酶降解,導(dǎo)致活性物質(zhì)的泄露或失活[10]。可通過在制備過程中引入多糖以改善蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,多糖可以通過靜電相互作用覆蓋在蛋白質(zhì)表面,保護(hù)蛋白質(zhì)不被水解,同時(shí)也能穩(wěn)定被包封的活性物質(zhì)[11]。例如,果膠是一種陰離子多糖,其羧基基團(tuán)可以與酪蛋白中的氨基基團(tuán)發(fā)生相互作用,具有穩(wěn)定酪蛋白膠束的作用[12],同時(shí)也能延緩酪蛋白鈉在胃中的降解[13]。然而,果膠-酪蛋白復(fù)合物的穩(wěn)定性受多種因素影響,如pH、離子強(qiáng)度、電荷密度和果膠濃度等[14]。其中pH是影響果膠-酪蛋白相互作用和穩(wěn)定性的重要因素[14],了解pH值對(duì)酪蛋白-果膠復(fù)合物相互作用的影響對(duì)姜黃素包埋體系的調(diào)控非常重要。然而,目前研究pH值對(duì)酪蛋白-果膠復(fù)合物穩(wěn)定性的影響主要集中在復(fù)合物的宏觀性能指標(biāo)分析,無法直接反映出pH值引起的相互作用在分子水平上的變化程度。分子動(dòng)力學(xué)模擬(molecular dynamics simulation, MD)可以深入地闡述分子間的相互作用并較好地解釋相互作用的機(jī)理,有望在分子水平上為待研究物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象提供理論支持[15]。FERNANDES等[16]利用MD模擬發(fā)現(xiàn)花青素與果膠之間存在弱氫鍵和疏水相互作用。ZHANG等[17]通過MD模擬發(fā)現(xiàn)疏水和氫鍵相互作用促進(jìn)了肌球蛋白和姜黃素的結(jié)合。然而,目前尚未見用MD模擬來研究pH值對(duì)果膠-酪蛋白復(fù)合物作為姜黃素包埋體系的穩(wěn)定性的影響機(jī)制的報(bào)道。

本研究通過實(shí)驗(yàn)和MD模擬聯(lián)合研究了果膠-酪蛋白復(fù)合物在酸性(pH 5.0)和中性(pH 7.0)條件下作為姜黃素包埋體系的物理性質(zhì)、穩(wěn)定性和相互作用。首先制備了在不同pH條件下的酪蛋白-果膠-姜黃素復(fù)合物,并研究了果膠和pH值對(duì)姜黃素包封率和物理性質(zhì)(ζ-電位、微觀形貌)的影響。其次,利用熒光光譜分析了果膠和pH值對(duì)酪蛋白構(gòu)象的影響。隨后,分析了pH對(duì)酪蛋白-果膠-姜黃素復(fù)合物中姜黃素的熱穩(wěn)定性和在體外模擬胃腸道消化液中的生物可及性和保留率的影響。最后,通過MD模擬探究了不同pH條件下的酪蛋白-果膠-姜黃素復(fù)合物的相互作用。本研究有望為果膠-酪蛋白包埋體系的性能調(diào)控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白(CAS:9000-71-9)、胰蛋白酶,合肥博美生物科技有限公司;果膠(酯化度67.9%),恒銳食品生物科技有限公司;姜黃素(CAS:458-37-7),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;胃蛋白酶、豬膽鹽,上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD-1A-50型冷凍干燥機(jī),北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;F-2500型熒光分光光度計(jì),日本日立公司;Zetasizer Nano ZS 90粒徑分析儀,英國(guó)馬爾文儀器有限公司;Phenom Pro10102型掃描電鏡,荷蘭Phenom World公司;TGL-16G臺(tái)式離心機(jī),上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 復(fù)合物的制備

分別配制20 g/L的酪蛋白溶液和4 g/L的果膠溶液,4 ℃冷藏12 h使其完全水合。取20 mL酪蛋白溶液置于100 mL燒杯中,加入2 mg姜黃素,充分混勻1 h使姜黃素完全溶解得到混合物。然后,分別向混合物中加入20 mL超純水(調(diào)整pH至7.0)、20 mL果膠溶液(調(diào)整pH至7.0)和20 mL果膠溶液(調(diào)整pH至5.0),充分混勻1 h分別得到pH為7.0的酪蛋白-姜黃素復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0),pH為7.0的果膠-酪蛋白-姜黃素復(fù)合物(PE-CS-Cur pH 7.0)和pH為5.0的果膠-酪蛋白-姜黃素復(fù)合物(PE-CS-Cur pH 5.0)。

1.3.2 包封率和負(fù)載容量

參照OKAGU等[18]的做法,稍作修改,將所得的3種復(fù)合物離心(6 201×g, 10 min),吸取上清液,用無水乙醇萃取上清液的姜黃素10 min,并于420 nm處測(cè)定其熒光強(qiáng)度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液中姜黃素質(zhì)量。姜黃素的包封率和負(fù)載容量計(jì)算如公式(1)、公式(2)所示:

(1)

(2)

1.3.3 ζ-電位測(cè)定

采用Zetasizer Nano ZS 90測(cè)定了在pH 7.0和5.0時(shí)的酪蛋白、果膠、CS-Cur和PE-CS-Cur的ζ-電位。水相溶液的折射率設(shè)置為1.33,測(cè)試溫度為25 ℃,平衡時(shí)間為120 s。對(duì)每個(gè)樣品平行測(cè)定3組,對(duì)每組進(jìn)行3次測(cè)定,取平均值作為每次的測(cè)量值。

1.3.4 掃描電鏡觀察

采用掃描電子顯微鏡觀察酪蛋白、果膠、姜黃素以及復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 5.0)的形貌。將樣品分散于有雙面膠的樣品臺(tái),吹掉浮粉并噴金,進(jìn)行掃描觀察,放大倍數(shù)為300、2 000、10 000倍,加速電壓為10 kV。

1.3.5 熒光光譜分析

以酪蛋白為對(duì)照,使用熒光分光光度計(jì)測(cè)定復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 5.0)的熒光光譜。固定激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm,激發(fā)狹縫寬度設(shè)置為2.5 nm[19],發(fā)射狹縫寬度設(shè)置為5 nm,掃描范圍為300～500 nm。

1.3.6 復(fù)合物的熱穩(wěn)定性

通過測(cè)定80 ℃下復(fù)合物的降解動(dòng)力學(xué)曲線來分析復(fù)合物中姜黃素的熱穩(wěn)定性[7]。分別在錐形瓶中加入40 mL新鮮制備的復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 5.0)。此外,制備游離的姜黃素溶液作為對(duì)照,取2 mg姜黃素于錐形瓶中,加入1 mL無水乙醇使其充分溶解,再加入40 mL去離子水,攪拌均勻后即得游離的姜黃素溶液。將上述各組樣品在80 ℃保溫,每隔0.5 h取樣0.15 mL分析姜黃素的保留率,姜黃素的保留率為不同處理時(shí)間后樣品中姜黃素的質(zhì)量與處理前樣品中姜黃素的質(zhì)量的百分比。

1.3.7 復(fù)合物中姜黃素在體外模擬胃腸道消化中的保留率和生物可及性

參考CHEN等[20]的方法,通過體外模擬胃腸道消化分析復(fù)合物中姜黃素的生物可及性。取20 mL新鮮制備的復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 5.0),用2 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至1.5,在水浴鍋(37 ℃)中預(yù)熱10 min,加入8 mg胃蛋白酶,開始模擬胃液消化。60 min后,用4.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0,并加入100 mg豬膽鹽提取物,混勻10 min后加入16 mg胰蛋白酶,模擬小腸消化120 min。在消化過程中每隔0.5 h取樣0.15 mL,按照1.3.6節(jié)方法分析姜黃素的保留率。此外,在消化終點(diǎn)時(shí)取1 mL消化液離心(6 201×g, 10 min),按照1.3.2節(jié)方法計(jì)算上清液中的姜黃素質(zhì)量,根據(jù)公式(3)計(jì)算姜黃素的生物可及性:

(3)

1.4 MD模擬

MD模擬使用GROMACS(version:2019.06)[21]軟件包,可視化分析采用PyMOL(version 2.4)軟件[22]。首先,參考ZHAO等[23]的同源建模方法獲得酪蛋白結(jié)構(gòu),并通過Cellulose-Builder工具[24]構(gòu)建果膠結(jié)構(gòu),從Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得姜黃素(ID:969516)的初始分子結(jié)構(gòu)。隨后,利用acpype.py調(diào)用Ambertools18軟件[25],在Gaff力場(chǎng)下生成姜黃素的拓?fù)湮募妥鴺?biāo)文件,并在B3LYP-D3(BJ)/6-31G(D,P)水平上,聯(lián)合Gaussian09[26]和Multiwfn(version 3.7)[27]計(jì)算得到姜黃素的限制性擬合靜電勢(shì)電荷,替換原有的Austin Model 1電荷。在GLYCAM06力場(chǎng)下生成果膠的拓?fù)浜妥鴺?biāo)文件。利用H++在線服務(wù)器(http://biophysics.cs.vt.edu/H++)計(jì)算酪蛋白在pH 7.0和pH 5.0的質(zhì)子化狀態(tài),并在Amber99SB-ILDN力場(chǎng)下得到對(duì)應(yīng)pH下酪蛋白的拓?fù)浜妥鴺?biāo)文件。然后,將果膠、酪蛋白、姜黃素包埋在一個(gè)13 ?×13 ?×13 ?的立方體盒中,加入TIP3P模型水,并通過NaCl來中和系統(tǒng)電荷。系統(tǒng)通過1 500步的共軛梯度進(jìn)行能量最小化,隨之進(jìn)行最陡下降算法進(jìn)行體系預(yù)平衡。最后,設(shè)置pH為4.6,模擬溫度和壓力分別為298 K和1 Bar運(yùn)行時(shí)間60 ns的模擬,步長(zhǎng)為2 fs。此外,按照同樣的方法進(jìn)行了pH 7.0的酪蛋白-姜黃素模擬。均方根偏差(root-mean-square deviation,RMSD)、氫鍵數(shù)量指標(biāo)均從軌跡分析中獲得。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)指標(biāo)平行測(cè)定3次,樣品平行測(cè)定2次,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 18.0進(jìn)行單因素ANOVA分析(P<0.05時(shí)為差異顯著)。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合物對(duì)姜黃素的包封率和負(fù)載容量

圖1為不同復(fù)合物對(duì)姜黃素包封率和負(fù)載容量。與CS-Cur pH 7.0(80.2%)相比,PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0對(duì)姜黃素的包封率分別增加了3.0%和15.8%,表明果膠的加入可提高復(fù)合物對(duì)姜黃素的包封率。此外,在pH 5.0下制備的PE-CS-Cur復(fù)合物對(duì)姜黃素的包封率和負(fù)載容量最高,分別為96.0%和4.8%,說明在pH 5.0下制備可以進(jìn)一步提高復(fù)合物對(duì)姜黃素的包封率和負(fù)載容量。這可能是因?yàn)楫?dāng)pH由7變?yōu)?時(shí),酪蛋白膠束之間由于靜電斥力減弱而發(fā)生聚集,從而導(dǎo)致更多的姜黃素被包裹[10]。

圖1 姜黃素在復(fù)合物CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 5.0中的包封率和負(fù)載容量Fig.1 Encapsulation efficiency and loading capacity of CS-Cur pH 7.0, PE-CS-Cur pH 7.0, and PE-CS-Cur pH 5.0注:同組不同大小寫字母分別表示差異性顯著(P<0.05)(下同)。

2.2 復(fù)合物的ζ-電位

酪蛋白、果膠、CS-Cur和PE-CS-Cur在pH 7.0和5.0時(shí)的ζ-電位如圖2所示。pH為5.0時(shí),酪蛋白(-7.2 mV)和CS-Cur(-7.8 mV)的ζ-電位沒有顯著變化,說明姜黃素的存在不會(huì)顯著影響分散液中酪蛋白的表面電荷。然而,在pH 5.0時(shí),PE-CS-Cur的ζ-電位(-30.9 mV)顯著低于CS-Cur(-7.8 mV),這是由于果膠成功包覆在CS-Cur的表面,其較大的電位導(dǎo)致分散液中顆粒的ζ-電位降低[28]。此外,與酪蛋白(-7.2 mV)相比,PE-CS-Cur在pH 5.0時(shí)的ζ-電位(-30.9 mV)與果膠(-33.1 mV)更相近,表明PE-CS-Cur的表面電荷主要受果膠的影響,同時(shí)也說明果膠成功包覆在CS-Cur的表面[27]。

圖2 酪蛋白、果膠、CS-Cur和PE-CS-Cur在pH 7.0和5.0時(shí)的ζ-電位Fig.2 ζ-potential of casein, pectin, CS-Cur, and PE-CS-Cur at pH 7.0 and 5.0

2.3 復(fù)合物的形貌

圖3為酪蛋白、果膠、姜黃素、CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0的掃描電鏡圖。酪蛋白、果膠和姜黃素分別呈現(xiàn)出光滑球狀結(jié)構(gòu)(圖3-A)、不規(guī)則條狀結(jié)構(gòu)(圖3-B)和針狀結(jié)構(gòu)(圖3-C)。CS-Cur pH 7.0(圖3-D)表面呈現(xiàn)出不規(guī)則凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),表面凹陷較多,呈蜂窩狀。由于果膠的覆蓋,PE-CS-Cur pH 7.0(圖3-E)的表面結(jié)構(gòu)較CS-Cur pH 7.0(圖3-D)更為平整,雖然仍有凹陷,但蜂窩狀結(jié)構(gòu)明顯減少。PE-CS-Cur pH 5.0(圖3-F)結(jié)構(gòu)與PE-CS-Cur pH 7.0(圖3-E)相似,表現(xiàn)出連續(xù)的、無裂縫的凸起結(jié)構(gòu),其顆粒明顯大于PE-CS-Cur pH 7.0(10 000倍時(shí)),這是因?yàn)镻E-CS-Cur pH 5.0的表面凈電荷量較低,導(dǎo)致液滴之間的排斥力太低而發(fā)生聚集[29]。

A-酪蛋白;B-果膠;C-姜黃素;D-CS-Cur pH 7.0;E-PE-CS-Cur pH 7.0;F-PE-CS-Cur pH 5.0圖3 酪蛋白、果膠、姜黃素、CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron micrograph of casein, pectin, curcumin, CS-Cur pH 7.0, PE-CS-Cur pH 7.0, and PE-CS-Cur pH 5.0注:放大倍數(shù)分別為300、2 000、10 000倍。

2.4 復(fù)合物的熒光光譜

酪蛋白的內(nèi)源熒光主要來源于色氨酸殘基,故可通過熒光光譜法來研究配體與酪蛋白之間的相互作用及酪蛋白的構(gòu)象變化。圖4顯示了酪蛋白、CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0的熒光光譜。酪蛋白在337 nm處具有熒光最大發(fā)射峰,源于酪蛋白中的色氨酸殘基。添加姜黃素后,3種復(fù)合物中酪蛋白的熒光強(qiáng)度均降低,且熒光最大發(fā)射峰均藍(lán)移至328 nm,表明姜黃素與酪蛋白發(fā)生了疏水相互作用,導(dǎo)致酪蛋白的構(gòu)象發(fā)生變化,使色氨酸殘基所處的微環(huán)境極性發(fā)生改變,疏水性增加[29]。此外,PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0的熒光強(qiáng)度低于CS-Cur pH 7.0的熒光強(qiáng)度,但熒光最大發(fā)射峰沒有發(fā)生移動(dòng),說明果膠不會(huì)影響酪蛋白與姜黃素之間的相互作用,不能改變酪蛋白的極性環(huán)境。與PE-CS-Cur pH 7.0相比,PE-CS-Cur pH 5.0的熒光強(qiáng)度明顯降低,這是由于PE-CS-Cur pH 5.0接近酪蛋白的理論等電點(diǎn)(pI=4.7),此時(shí)酪蛋白分子的凈電荷低,顆粒之間的電荷排斥作用減弱,易形成沉淀,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[29]。

2.5 姜黃素在復(fù)合物中的熱穩(wěn)定性

姜黃素受熱易降解,本研究評(píng)估了游離姜黃素和不同復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0)包埋的姜黃素在80 ℃下的降解動(dòng)力學(xué),結(jié)果如圖5所示。隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng),游離的姜黃素以及3種復(fù)合物中的姜黃素的降解過程均呈衰減趨勢(shì)。加熱3 h后,CS-Cur pH 7.0中姜黃素的保留率(46.7%)顯著大于游離姜黃素的保留率(39.4%),表明酪蛋白的結(jié)合提高了姜黃素的熱穩(wěn)定性。此外,PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0中姜黃素的保留率分別為48.8%和66.9%,均大于游離姜黃素(39.4%)和CS-Cur pH 7.0中姜黃素的保留率(46.7%),說明添加果膠可以進(jìn)一步提高姜黃素的熱穩(wěn)定性,有效減少姜黃素分子的高溫降解。與CS-Cur pH 7.0(48.8%)相比,PE-CS-Cur pH 5.0(66.9%)中姜黃素的保留率顯著提高,說明在pH 5.0下制備的果膠-酪蛋白復(fù)合物包埋的姜黃素的熱穩(wěn)定性最好。

圖5 在80 ℃下游離姜黃素和不同復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0)包裹的姜黃素在80 ℃下的降解動(dòng)學(xué)曲線Fig.5 Degradation kinetic curve of free curcumin and curcumin in CS-Cur pH 7.0, PE-CS-Cur pH 7.0, and PE-CS-Cur pH 5.0 at 80 ℃

2.6 復(fù)合物包埋的姜黃素在體外模擬消化過程中的生物可及性和穩(wěn)定性

游離姜黃素和不同復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0)包埋的姜黃素在體外模擬胃腸道消化過程中的生物可及性如圖6-A所示。與游離姜黃素(31.6%)相比,CS-Cur pH 7.0(64.6%)包埋的姜黃素的生物可及性顯著提高,表明酪蛋白的包埋作用可以提高姜黃素的生物可及性。此外,姜黃素在CS-Cur pH 7.0(64.6%)和PE-CS-Cur pH 7.0(63.2%)中的生物可及性接近(P<0.05),表示姜黃素生物可及性受果膠包埋的影響不大。與CS-Cur pH 7.0(64.6%)和PE-CS-Cur pH 7.0(63.2%)相比,姜黃素在PE-CS-Cur pH 5.0(79.1%)中的生物可及性最大,這可能與PE-CS-Cur pH 5.0中姜黃素的包封率最高(圖1)有關(guān)[30]。

A-生物可及性;B-降解動(dòng)力學(xué)曲線圖6 體外模擬胃腸道消化中游離姜黃素和不同復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0)中包埋的姜黃素的生物可及性和降解動(dòng)力學(xué)曲線Fig.6 In vitro simulation of the bioavailability and degradation kinetics curve of free curcumin and curcumin in CS-Cur pH 7.0, PE-CS-Cur pH 7.0, and PE-CS-Cur pH 5.0 in gastrointestinal digestion

游離姜黃素和不同復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0)包埋的姜黃素在體外模擬胃腸道消化過程中的保留率如圖6-B所示。在模擬胃消化過程時(shí),游離姜黃素降解了21.2%,顯著高于CS-Cur pH 7.0(7.5%)、PE-CS-Cur pH 7.0(6.1%)和PE-CS-Cur pH 5.0(5.8%)。在模擬小腸消化過程時(shí),游離姜黃素迅速降解了42.1%,而復(fù)合物(CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0)的中姜黃素分別降解了17.9%、25.1%和8.0%。這些結(jié)果表明酪蛋白和果膠的包埋作用可以提高姜黃素在胃腸道消化過程中的穩(wěn)定性,延緩其在胃腸道消化液中的釋放。此外,與PE-CS-Cur pH 7.0(生物可及性=63.2%,保留率=68.9%)相比,PE-CS-Cur pH 5.0的生物可及性(79.1%)和姜黃素保留率(86.2%)更大,表明PE-CS-Cur pH 5.0在模擬消化液中的生物可及性和穩(wěn)定性最高,可以達(dá)到更好的緩釋效果。

2.7 MD模擬

2.7.1 RMSD分析

通過分析CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0復(fù)合物的RMSD,可反映整個(gè)模擬過程中復(fù)合物體系偏離初始結(jié)構(gòu)的程度,當(dāng)RMSD值在0.2 nm范圍內(nèi)波動(dòng)時(shí),表明體系達(dá)到了平衡[23]。由圖7可知,0～55 ns時(shí),CS-Cur pH 7.0的RMSD值波動(dòng)較大,但55 ns后,整體趨于穩(wěn)定,此時(shí)其平均值約為1.26 nm。對(duì)于PE-CS-Cur復(fù)合物,在pH 7.0下,果膠的存在減弱了RMSD的波動(dòng),PE-CS-Cur pH 7.0在MD模擬前40 ns內(nèi)的RMSD值在0.66 nm附近波動(dòng);在40 ns后,RMSD值維持在0.86 nm的平衡值,低于CS-Cur pH 7.0的RMSD值(1.26 nm),表明果膠可以提高復(fù)合物的穩(wěn)定性。在pH 5.0下,PE-CS-Cur pH 5.0在MD模擬前40 ns內(nèi)的RMSD值在0.82 nm附近波動(dòng);在40 ns后趨于穩(wěn)定,此時(shí)其平均值約為0.69 nm,低于PE-CS-Cur pH 7.0的RMSD值(0.86 nm),表明PE-CS-Cur pH 5.0的穩(wěn)定性強(qiáng)于PE-CS-Cur pH 7.0,與實(shí)驗(yàn)結(jié)果中PE-CS-Cur pH 5.0的熱穩(wěn)定性和體外消化穩(wěn)定性較好相一致(圖5、圖6)。

圖7 CS-Cur pH 7.0, PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0在MD模擬過程中的RMSD變化Fig.7 The RMSD of CS-Cur pH 7.0, PE-CS-Cur pH 7.0 and PE-CS-Cur pH 5.0 along the MD simulation

2.7.2 氫鍵分析

圖8-A為CS-Cur pH 7.0、PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0在MD模擬過程中形成的氫鍵數(shù)量隨時(shí)間的變化。在MD模擬達(dá)到平衡后(55～60 ns),PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0在大多數(shù)時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)4個(gè)氫鍵,而CS-Cur pH 7.0呈現(xiàn)1或2個(gè)氫鍵,表明果膠可以與酪蛋白或姜黃素以氫鍵結(jié)合形成復(fù)合物。此外,PE-CS-Cur pH 5.0的平均氫鍵數(shù)量(4個(gè))多于PE-CS-Cur pH 7.0(2個(gè)),表明在pH 5.0條件下PE-CS-Cur復(fù)合物可以形成更多的分子間氫鍵,有利于增強(qiáng)體系的穩(wěn)定性。圖8-B為復(fù)合物在平衡后(58.73 ns)的代表性氫鍵示意圖。由圖8可知,與PE-CS-Cur pH 7.0(3個(gè))和CS-Cur pH 7.0(1個(gè))相比,PE-CS-Cur pH 5.0可以形成更多的分子間氫鍵(8個(gè)),與PE-CS-Cur pH 5.0的平均氫鍵個(gè)數(shù)最多一致,對(duì)維持復(fù)合物的穩(wěn)定性有著積極影響。此外,理論計(jì)算與實(shí)際PE-CS-Cur復(fù)合物體系中的相互作用存在一定偏差,因?yàn)樵诜肿觿?dòng)力學(xué)模擬時(shí),考慮到計(jì)算量和建模復(fù)雜性,采用單果膠、酪蛋白和姜黃素分子代表實(shí)際PE-CS-Cur包埋體系的各組分,但未考慮各組分內(nèi)的分子之間的相互作用。

A-氫鍵數(shù)量;B-氫鍵示意圖圖8 CS-Cur pH 7.0, PE-CS-Cur pH 7.0和PE-CS-Cur pH 5.0在MD模擬過程中的氫鍵數(shù)量和58.73 ns時(shí)的氫鍵示意圖Fig.8 The number of hydrogen bonds of CS-Cur pH 7.0, PE-CS-Cur pH 7.0, and PE-CS-Cur pH 5.0 of MD simulation and the hydrogen bonds at 58.73 ns

3 結(jié)論

本文研究了pH對(duì)PE-CS復(fù)合物作為姜黃素包埋體系的穩(wěn)定性、生物可及性和相互作用的影響。pH 5.0是制備最優(yōu)性能的PE-CS-Cur的pH值。在此條件下,復(fù)合物的ζ-電位為-30.9 mV,包封率高達(dá)96.0%。ζ-電位的結(jié)果表明果膠成功包覆在CS-Cur的表面。熒光光譜表明姜黃素與酪蛋白之間存在疏水相互作用。經(jīng)PE-CS包埋后的姜黃素在高溫下的保留率提高了27.5%,且在模擬胃腸道消化液中的保留率和生物可及性也分別提高了49.5%和47.5%,表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性,進(jìn)而延緩了姜黃素在胃腸道消化液中的釋放。此外,分子動(dòng)力學(xué)模擬表明在pH 5.0條件下PE-CS-Cur可以形成更多的分子間氫鍵,使其具有更好的穩(wěn)定性?？傊?本研究為PE-CS復(fù)合物作為姜黃素包埋體系的性能調(diào)控提供了理論參考。