趙思佳 王靜 賀鋒, 杜鵬飛 劉天地 張紹穎 李騰飛

1（河北工程大學生命科學與食品工程學院， 邯鄲 056038）

2（河北工程大學材料科學與工程學院， 邯鄲 056038）

3（山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工與營養(yǎng)研究所， 山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術重點實驗室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部新食品資源加工重點實驗室， 濟南 250100）

過氧化氫（H2O2）具有殺菌和漂白等作用且易分解[1]，常用于食品加工和化工生產(chǎn)等行業(yè)。過量的H2O2進入人體會誘發(fā)心血管疾病和癌癥等[2]。許多國家對食品中H2O2的殘留量有嚴格要求，美國食品藥品管理局（FDA）規(guī)定H2O2殘留量不超過0.5 mg/L， 我國明確禁止在乳制品生產(chǎn)中添加H2O2[3]。因此，建立食品中H2O2的快速、靈敏的檢測方法具有重要意義。

目前，H2O2的檢測方法主要有比色法[4]、熒光法[5]、色譜法[6]、電化學法和化學發(fā)光法[7]等。電化學法具有操作簡便、分析成本低、響應快速和靈敏度高等特點，廣泛用于H2O2檢測[8]，如基于銀納米粒子/碳納米球[9]、氧化石墨烯/金納米顆粒[10]和銅基金屬有機骨架[11]等材料修飾電極的電化學傳感器，均可實現(xiàn)對H2O2的靈敏檢測。然而，以上傳感器均是直接對H2O2的電信號進行檢測，容易受到復雜樣品基質及檢測環(huán)境的干擾[12]。比率型電化學傳感器基于內(nèi)參信號和目標響應信號之比實現(xiàn)精準檢測，可以消除基質和環(huán)境的干擾[13]。因此，構建比率型電化學傳感器用于復雜樣品基質中H2O2的檢測具有良好的現(xiàn)實意義。

金屬有機框架（Metal organic frameworks，MOFs）材料是由金屬離子/團簇和不同的有機配體組成的一類新型晶體多孔材料，具有孔隙率高、表面積大和電化學活性位點多等特性。常規(guī)MOFs 作為電極材料，其電導率和穩(wěn)定性較差，引入多壁碳納米管（Multi-walled carbon nanotubes，MWCNTs）制備復合材料，可提高其電化學性能[14]。Rani 等[15]使用碳納米管功能化的錫基金屬有機骨架材料實現(xiàn)了H2O2的靈敏檢測，采用該方法有效提高了材料的電子傳輸速率，增強了MOFs 的電催化活性。目前，采用MOFs 構建H2O2比率型電化學傳感器的研究還鮮有報道。

亞甲基藍（Methylene blue，MB）具有電子傳輸速率快、氧化還原可逆及水溶性好等優(yōu)點，可為比率型電化學傳感器提供內(nèi)參信號[16]。本研究采用鋅基金屬有機骨架（ZIF-8）與羧基化碳納米管的復合材料修飾電極，以MB 的氧化峰電流作為內(nèi)參信號構建比率型電化學傳感器（圖1）。引入對氨基苯硼酸（PABA）與H2O2反應生成電活性物質對氨基苯酚（PAP），以PAP 與MB 的氧化峰電流比值作為檢測信號，實現(xiàn)H2O2的特異性檢測。

圖1 基于MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 的H2O2 比率型電化學傳感器構建示意圖Fig.1 Schematic illustration of construction process of ratiometric electrochemical H2O2 sensor based on MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

SU8020 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本Hitachi 公司）；FEI Talos F200X 場發(fā)射透射電子顯微鏡（美國FEI 公司）；D8 Advance X-射線衍射儀（德國布魯克公司）；CHI 650E 電化學工作站（上海辰華儀器有限公司）。采用三電極系統(tǒng)：以玻碳電極（GCE，直徑為3 mm）為工作電極，鉑絲為輔助電極，Ag/AgCl 電極為參比電極。

MB、PABA、聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K30）和MWCNTs 購于上海麥克林生化科技有限公司；H2O2（30%）購于萊陽市康德化工有限公司。其它試劑均為分析純；實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。磷酸鹽緩沖溶液（Phosphate buffer saline，PBS）由Na2HPO4和NaH2PO4配制而成。

1.2 實驗方法

1.2.1 羧基化多壁碳納米管(COOH-MWCNTs)的合成

參考文獻[17]的方法，將MWCNTs 進行羧基化處理，以去除金屬雜質和引入含氧基團。將100 mg MWCNTs 加入到60 mL 混酸（濃硫酸∶濃硝酸=3∶1，V/V）中，超聲分散2 h，分散液在70 ℃下回流5 h。冷卻后，將分散液用超純水稀釋并過濾，反復洗滌至中性，60 ℃下真空干燥24 h， 得到COOH-MWCNTs。

1.2.2 ZIF-8/COOH-MWCNTs的合成

參考文獻[18]的方法，將10 mg COOH-MWCNTs 和0.1 g PVP-K30 加入到50 mL 2-甲基咪唑的甲醇溶液（80 mmol/L）中，隨后緩慢加入50 mL 醋酸鋅的甲醇溶液（16 mmol/L）。將以上混合溶液攪拌30 min，室溫下靜置12 h， 離心，用水和甲醇洗滌，收集產(chǎn)物，在80 ℃真空干燥24 h， 得到ZIF-8/COOHMWCNTs。在不添加COOH-MWCNTs 的條件下，采用同樣的方法制備得到ZIF-8。

又如，11月的主題是科技，小學部3～6年級學生到青少年活動中心體驗小制作。從學校步行到活動中心，4公里的路程是對學生毅力的挑戰(zhàn)。許多學生都沒有步行這么遠距離的體驗，這次活動把體育、思想品德、科學、美術、數(shù)學、語文學科融合在一起，既鍛煉了大家的身心，又培養(yǎng)了學生實踐和創(chuàng)新能力。此外，1～2年級還在DIY基地體驗了制作小蛋糕；3～6年級開展了大興農(nóng)場采摘活動。學習任務單式的實踐活動不僅讓學生獲得了不同的勞動體驗，同時也讓學生將所學的學科知識應用到實踐中。

1.2.3 修飾電極的制備

將GCE 表面用不同粒徑的Al2O3粉拋光打磨成鏡面，再用乙醇和水超聲清洗5 min，氮氣吹干，隨后將ZIF-8/COOH-MWCNTs 分散液（10 μL，0.5 mg/mL）滴加在電極表面，室溫下干燥，得到ZIF-8/COOHMWCNTs/GCE。將MB 溶液（3 μL，75 μmol/L）滴加在電極表面，室溫下干燥，獲得修飾電極MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE。

1.2.4 電化學檢測

采用三電極體系，以MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 為工作電極，鉑絲為輔助電極，Ag/AgCl 電極為參比電極。循環(huán)伏安法（Cyclic voltammetry，CV）的電位范圍為-0.2～0.6 V， 掃描速率為0.05 V/s。電化學阻抗譜（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）的頻率范圍為0.01 Hz～100 kHz，振幅為0.005 V。CV 和EIS 測試均在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]溶液中進行。差分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry，DPV）測量在PBS（0.01 mol/L， pH 7.5）中進行，電位范圍為-0.5～0.3 V， 脈沖寬度為0.1 s， 脈沖周期0.2 s， 振幅為0.05 V。

1.2.5 牛奶樣品的處理

牛奶樣品購于邯鄲本地超市。將1.8 g（NH4）2SO4加入到10 mL 牛奶樣品中，攪拌15 min 后，以8000 r/min 離心20 min， 取上清液過濾，收集濾液，在4 ℃下儲存。

2 結果與分析

2.1 ZIF-8/COOH-MWCNTs表征

采用掃描電子顯微鏡（Scanning electron microscopy，SEM）和透射電子顯微鏡（Transmission electron microscope，TEM）對ZIF-8、COOH-MWCNTs 和ZIF-8/COOH-MWCNTs 材料進行形貌表征。如圖2A 所示，所制備的ZIF-8 晶體呈典型的多面體形貌，粒徑約為150～200 nm。未修飾的COOH-MWCNTs 呈細長的管狀結構（圖2B）。圖2C 為ZIF-8/COOH-MWCNTs 復合材料，可以明顯看出ZIF-8 分散在COOHMWCNTs 周圍，表明ZIF-8/COOH-MWCNTs 復合材料制備成功。ZIF-8/COOH-MWCNTs 的TEM 圖（圖2D）清晰呈現(xiàn)了COOH-MWCNTs 纏繞ZIF-8 的結構。

圖2 ZIF-8（A）、COOH-MWCNTs （B）和ZIF-8/COOH-MWCNTs （C）的掃描電子顯微鏡（SEM）圖; ZIF-8/COOH-MWCNTs （D）的透射電子顯微鏡（TEM）圖Fig.2 Scanning electron microscopy (SEM) images of ZIF-8 (A), COOH-MWCNTs (B) and ZIF-8/COOHMWCNTs (C); Transmission electron microscope (TEM) image of ZIF-8/COOH-MWCNTs (D)

ZIF-8、COOH-MWCNTs 和ZIF-8/COOH-MWCNTs 3 種材料的X-射線衍射圖見圖3。ZIF-8（曲線b）在7.5°、10.5°、12.5°、14.73°、16.42°和18.00°處的特征衍射峰分別對應于（011）、（002）、（112）、（022）、（013）和（333）晶面，與文獻[19]基本一致。COOH-MWCNTs（曲線a）在26.01°和43.12°處的衍射峰對應（002）和（100）晶面。ZIF-8/COOH-MWCNTs（曲線c）的峰值分布與ZIF-8（曲線b）的峰值分布大致相同，說明COOH-MWCNTs 的添加對ZIF-8 的晶體結構沒有影響。

圖3 COOH-MWCNTs （a）、ZIF-8 （b）和ZIF-8/COOH-MWCNTs （c）的X 射線衍射（XRD）圖Fig.3 X-ray diffraction (XRD) patterns of COOH-MWCNTs (a), ZIF-8 (b) and ZIF-8/COOH-MWCNTs (c)

2.2 不同修飾電極的電化學表征

采用CV 研究了不同修飾電極（GCE、ZIF-8/GCE、ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 和MB@ZIF-8/COOHMWCNTs/GCE）的電化學行為。如圖4A 所示，氧化還原探針[Fe（CN）6]3-/4-在裸GCE 上有一對明顯的可逆氧化還原峰；在GCE 上修飾ZIF-8 后，因為ZIF-8 本身的弱導電性，導致電流響應明顯降低（曲線a）；當ZIF-8/COOH-MWCNTs 復合材料修飾GCE 后，峰電位差明顯減小，氧化還原峰電流值增大（曲線c），說明ZIF-8 與COOH-MWCNT 的協(xié)同作用加快了電子傳遞速率；當MB 修飾到ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE上，氧化還原峰電流達到最大值（曲線d）。

圖4 不同修飾電極的（A）循環(huán)伏安（CV）圖、（B）電化學阻抗譜（EIS）圖和（C）計時庫倫圖：（a）ZIF-8/GCE; （b） GCE; （c） ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE; （d） MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCEFig.4 (A) Cyclic voltammograms (CV), (B) electrochemical impedance spectroscopic (EIS) graphs and (C)chronocoulometry curves of different electrodes: (a) ZIF-8/GCE; (b) GCE; (c) ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE;(d) MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE

EIS 是表征電極界面性質的有效方法，其中，直線部分表示擴散過程，高頻處的半圓直徑大小對應電荷轉移阻值（Rct）。如圖4B 所示，裸GCE 的Rct為138 Ω（曲線b）。當修飾ZIF-8 后，半圓的直徑明顯變大（Rct=375 Ω，曲線a），表明ZIF-8 阻礙了電子轉移。相比之下，ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 的半圓直徑較小，表明ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 的電子轉移加快，阻抗值減小（Rct=32 Ω，曲線c）。此外，MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE（Rct=18 Ω，曲線d）的半圓直徑遠小于其它修飾電極，表明MB 顯著促進了電極表面電子的傳輸，這與CV 的結果一致。

采用計時庫侖法測試修飾電極在5 mmol/L K3[Fe（CN）6]/K4[Fe（CN）6]溶液中的電量和時間的關系，按式（1）[20]計算修飾電極的有效面積:

其中，A是電極活性表面積，C是底物濃度，n是電子的轉移數(shù)，F(xiàn)是法拉第常數(shù)，t是時間，D是鐵氰化鉀的標準擴散系數(shù)，Qads為Faradaic 電荷。如圖4C 所示，計算得到ZIF-8/GCE、GCE、ZIF-8/COOHMWCNTs/GCE 和MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 電極的活性表面積A分別為0.1212、0.1313、0.1671和0.2053 cm2， 表明修飾材料可為電極提供更多的活性位點。

2.3 電化學檢測H2O2原理

PABA 與H2O2反應可生成電活性物質對氨基苯酚，如圖5 所示。

圖5 對氨基苯硼酸（PABA）與H2O2 的反應過程Fig.5 Reaction process of 4-aminophenylboronic acid (PABA) and H2O2

在含有0.5 mmol/L PABA 的溶液（0.01 mol/L PBS，pH 7.5）中，測定對氨基苯酚在不同修飾電極（GCE、MB/GCE 和MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE）上的DPV 響應。如圖6 所示，3 種修飾電極均在0.096 V 左右出現(xiàn)對氨基苯酚的電化學氧化峰，與GCE（曲線a）和MB/GCE（曲線b）相比，對氨基苯酚在MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE（曲線d）上的氧化電流更大，說明修飾電極具有較高的電催化活性和良好的電導率。另外，MB/GCE 和MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 在-0.3V 左右還有另一個氧化峰，該氧化峰為MB 的氧化峰。在電解液中加入不同濃度的H2O2，MB 的氧化峰電流基本不變，但對氨基苯酚的氧化峰電流隨濃度而改變（曲線c）?；诖?，可以構建檢測H2O2的比率型電化學傳感器。

圖6 裸GCE（a）、MB/GCE（b）和MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE（d）在含有50 μmol/L H2O2 的0.5 mmol/L PABA 溶液（0.01 mol/L PBS，pH 7.5）中的差分脈沖伏安（DPV）曲線;（c）MB@ZIF-8/COOHMWCNTs/GCE 在含有30 μmol/L H2O2 的0.5 mmol/L PABA 溶液（0.01 mol/L PBS，pH 7.5）中的DPV 曲線Fig.6 Differential pulse voltammetry(DPV)curves of 50 μmol/L H2O2 in 0.5 mmol/L PABA solution(0.01 mol/L PBS, pH 7.5) on different electrodes: (a) bare GCE, (b) MB/GCE, (d) MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE;(c)DPV curve of 30 μmol/L H2O2 on MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE in 0.5 mmol/L PABA solution(0.01 mol/L PBS, pH 7.5)

2.4 實驗條件的優(yōu)化

考察了溶液pH 值對MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 電化學性能的影響。如圖7A 所示，在pH 6.0～7.5 范圍內(nèi)，對氨基苯酚與MB 的電流比值隨著pH 值增大而增加，當pH＞7.5 時，電流比值逐漸減小。因此，本研究選擇溶液pH=7.5。圖7B 顯示了溶液pH 值（6.0～8.5）對對氨基苯酚的氧化峰電位的影響。Epa與pH 值的線性回歸方程為Epa（V） = -0.05109pH + 0.5454 （R2= 0.997）， 斜率接近于能斯特方程的理論值（-0.059 mV/pH），表明對氨基苯酚在該電極上的氧化是等電子等質子反應。

圖7 （A）pH 值對MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 電極響應的影響；（B）pH 值與對氨基苯酚氧化峰電位的線性擬合曲線；（C）H2O2 和PABA 反應時間對MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 電極響應的影響Fig.7 (A)Influences of pH value on response of MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE;(B)Linear fitting curve of pH value and oxidation peak potential of p-aminophenol; (C) Influence of reaction time of H2O2 and PABA on response of MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE

H2O2與對氨基苯酚溶液反應時間對電化學性能的影響見圖7C，隨著反應時間延長，對氨基苯酚與MB 的電流比值增大，80 s 后，電流比值幾乎保持不變。因此，最佳反應時間選擇80 s。

2.5 掃描速率的影響

圖8A 為MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 在0.01 mol/L PBS 溶液（pH 7.5）中不同掃描速率下的CV 曲線，出現(xiàn)了對氨基苯酚的氧化還原峰（0.04/0.15 V）。如圖8B 所示，對氨基苯酚的氧化峰和還原峰電流與掃描速率的平方根成正比。根據(jù)Randles-Sevcik 方程，線性回歸方程可以表示為Ipa=1.99625v1/2+1.6799（R2=0.994），Ipc=-1.93735v1/2+ 0.45762 （R2=0.995），表明對氨基苯酚在MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE上的電化學過程以擴散控制為主。此外，對氨基苯酚的氧化峰電位或還原峰電位和掃描速率的對數(shù)（lgv）呈線性關系（圖8C），線性方程為Epa=0.04645lgv+0.03383（R2=0.994），Epc=-0.03444lgv+0.1218（R2= 0.991）。根據(jù)Laviron 方程可計算出電子轉移數(shù)n。

圖8 （A） MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 在不同掃速（30～130 mV/s）下的CV 曲線; （B） 氧化還原峰電流和掃速平方根的線性擬合曲線; （C） 掃描速度的對數(shù)與氧化還原峰電位的線性擬合曲線Fig.8 (A) CV curves of MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE in the presence of 50 μmol/L H2O2 in 0.01 mol/L PBS(pH 7.5) at different scan rates(30-130 mV/s); (B) Linear fittings of square root of redox peak current and scan rate; (C) Linear relationship between the peak potential (Epa, Epc) and logarithm of scan rate

其中，n、F、T和R分別是氧化還原過程中的電子數(shù)、法拉第常數(shù)、溫度和理想氣體常數(shù)。由上述對pH 值與電位的研究得出對氨基苯酚在MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 表面是等電子等質子反應，結合公式（2） 和（3） 得出n= 2.1，這表明對氨基苯酚的電化學反應是雙電子雙質子轉移過程，其可能的反應機理如圖9 所示。

圖9 對氨基苯酚化學式以及可能的電化學氧化機理Fig.9 Chemical structure and possible oxidation mechanism of 4-aminophenol

2.6 方法的分析性能

圖10A 為MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs 在含有不同濃度H2O2的0.5 mmol/L 對氨基苯酚溶液（0.01 mol/L PBS，pH 7.5）中的DPV 曲線，可見隨著H2O2濃度增加，對氨基苯酚在0.095 V 左右的氧化峰電流逐漸變大。對氨基苯酚與MB 的電流比值（I/IMB）與H2O2濃度在5～200 μmol/L 范圍內(nèi)呈線性關系，線性回歸方程為I/IMB=0.0087C（μmol/L）+0.1980（R2=0.996），檢出限（LOD，S/N=3）為0.2 μmol/L。與其它檢測H2O2的傳感器相比（表1），本傳感器具有較高的靈敏度和較低的檢出限。

表1 MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE與其它傳感器檢測H2O2的性能比較Table 1 Comparison of the performances between MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE and other sensors for detection of H2O2

圖10 （A） 傳感器對不同濃度（5～200 μmol /L） H2O2 的DPV 曲線; （B） 檢測H2O2 濃度的線性校正曲線Fig.10 (A) DPV curves of the sensor toward different concentrations (5-200 μmol/L) of H2O2; (B) Calibration curve of sensor for detection of H2O2

2.7 選擇性、重復性及穩(wěn)定性研究

為了評價MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs/GCE 檢測H2O2的選擇性，選擇了葡萄糖、檸檬酸、L-脯氨酸和尿素等干擾物加入50 μmol/L H2O2的溶液中，干擾物濃度是H2O2濃度的50 倍，如圖11 所示，常見干擾物對H2O2的影響可以忽略不計，此傳感器表現(xiàn)出良好的特異性。平行制備5 根MB@ZIF-8/COOHMWCNTs/GCE 修飾電極對50 μmol/L H2O2進行測定，相對標準偏差（RSD）為2.1%，表明此比率型傳感器具有良好的制備重現(xiàn)性。將修飾電極在4 ℃保存10 d 后，I/IMB值為初始值的90.4%，表明此比率型電化學傳感器具有良好的儲存穩(wěn)定性。

圖11 傳感器對H2O2 的選擇性。H2O2 濃度為50 μmol/L， 干擾物濃度為2.5 mmol/LFig.11 Selectivity of the sensor toward H2O2. The concentrations of H2O2 and interferents are 50 μmol/L and 2.5 mmol/L, respectively

2.8 實際樣品分析

為考察本方法在實際樣品中的檢測能力，采用本方法測定了市售牛奶樣品中的H2O2，結果如表2 所示，H2O2加標回收率為95.6%～104.0%，RSD＜4%。上述結果表明，本方法對牛奶樣品中H2O2的測定具有良好的準確性和實用性。

表2 牛奶樣品中H2O2的檢測結果Table 2 Detection results of H2O2 in milk sample

3 結論

構建了一種基于MB@ZIF-8/COOH-MWCNTs 的比率型電化學傳感器用于H2O2檢測。此傳感器對H2O2的線性范圍為5～200 μmol/L， 檢出限為0.2 μmol/L。牛奶樣品中H2O2的加標回收率為95.6%～104.0%，表明此比率型電化學傳感器有良好的實用性，有望用于食品中H2O2的靈敏檢測。