干月皓 解文滕 王璐璐 張嘉 張桂龍 吳正巖

1（中國科學院合肥物質科學研究院智能機械研究所， 合肥 230031）

2（中國科學技術大學， 合肥 230026）

3（中國科學院合肥物質科學研究院強磁場科學中心， 合肥 230031）

4（濱州醫(yī)學院煙臺校區(qū)， 山東省分子靶向智能診療技術創(chuàng)新中心， 煙臺 264003）

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合形成的含巰基的三肽[1-2]。作為人體內重要的生物大分子，GSH 參與維持機體正常運轉的多項生命活動[3-4]。首先，GSH 的巰基具有極高的還原能力，可與人體內過量的活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）反應，從而減少自由基對于人體正常組分（脂質體、蛋白質和DNA 等）的損傷[5]；其次，由于巰基的富電子結構，GSH 可與多種重金屬元素（鉛、汞和砷等）配位，形成的復合物可被人體正常代謝，表明GSH 也可發(fā)揮解毒作用[6-7]；此外，當機體發(fā)生功能損傷或病變（如肝臟損傷、血栓癥、帕金森病和阿爾茲海默癥等）時，體內的GSH 水平也會隨之產生波動[8-12]。鑒于GSH 水平在生物學和醫(yī)學方面的重要參考價值，對GSH 的快速、精準檢測尤為重要。目前已報道的GSH 檢測方法主要有高效液相色譜法[13]、質譜法[14]、熒光光譜法[7]、比色法[15]、電化學發(fā)光法[16]、毛細管電泳法[17]以及磁共振波譜法[18]等。然而，這些方法具有耗時長、電極修飾過程冗長以及單個樣品測試費用高等不足[3,19]。

磁共振成像（Magnetic resonance imaging，MRI）技術由于具備穿透深度大以及無電離輻射的特點，近年來廣泛用于臨床診療[20-21]。MRI 主要通過監(jiān)測水分子的氫質子在縱向（T1，平行于外場）和橫向（T2，垂直于外場）的弛豫時間，再經過信號的傅里葉變換而獲得圖像信息[20，22]。在GSH 的還原作用下，MnO2納米材料可釋放出大量Mn2+，這些Mn2+可有效地縮短氫質子的縱向弛豫時間，產生更顯著的T1磁共振信號變化。因此，借助MnO2納米材料的磁共振造影性能可有效地檢測GSH 的含量[19]。然而，由于MnO2與GSH 的反應過程過于迅速，導致難以穩(wěn)定地捕捉磁共振信號的變化，使得對GSH 定量檢測時表現(xiàn)出較高的檢出限（Limit of detection，LOD）。

本研究采用表面沉積氧化鐵的方法，通過空間位阻效應減緩MnO2納米花（MnO2nanoflowers，MnO2NFs）與GSH 的反應速率，有助于穩(wěn)定捕捉磁共振信號的變化，從而有效提高基于T1的MRI 對GSH 定量檢測的靈敏度，降低檢出限。透射電子顯微鏡（TEM）、X 射線晶體衍射（XRD）以及X 射線光電子能譜（XPS）結果表明，氧化鐵顆粒在MnO2NFs 表面有效沉積。同時，水合粒徑分析結果表明，沉積氧化鐵后的MnO2@Fe3O4納米顆粒（MnO2@Fe3O4NPs）具備了更大的粒徑，進一步證明氧化鐵顆粒已在MnO2NFs 表面沉積。與GSH 孵育后，MnO2NFs 的結構幾乎完全坍塌，而MnO2@Fe3O4則保留了一部分NFs 結構，說明經過表面沉積后，MnO2與GSH 的反應被鈍化，從而有利于穩(wěn)定捕捉磁共振的信號變化。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP-OES）監(jiān)測不同濃度GSH 孵育后的Mn2+釋放，結果表明，MnO2@Fe3O4展現(xiàn)了更低的Mn2+釋放量。在體外應用T1MRI 對不同濃度的GSH 進行了定量檢測，結果表明，相對于MnO2，MnO2@Fe3O4可平穩(wěn)減緩質子縱向弛豫過程，具有更低的檢出限（MnO2：70.3 μmol/L；MnO2@Fe3O4：24.3 μmol/L）。本研究利用MRI 納米探針實現(xiàn)了對GSH 的精準檢測，為GSH 的檢測提供了新方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JEOL-2100F 場發(fā)射透射電子顯微鏡（TEM，日本日立公司）；Nano ZS 動態(tài)光散射儀（DLS，英國馬爾文公司）；ICAP7200 電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜儀（ICP-OES，美國賽默飛公司）；X′Pert MPD X 射線衍射儀（XRD，荷蘭飛利浦公司）；ESCALAB 250 X 射線光電子能譜儀（XPS，美國賽默飛公司）；9.4 T磁共振成像儀（MRI，德國布魯克公司）。

FeCl36H2O 和FeCl24H2O（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；瓊脂糖（低凝膠溫度，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；0.1 mol/L 嗎啉乙磺酸緩沖液（MES，pH=6.0，福州飛凈生物科技有限公司）；KMnO4（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP，優(yōu)級純，國藥集團化學試劑有限公司）。實驗用水為去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 MnO2 NFs的制備

根據(jù)文獻[23]的方法制備MnO2NFs。取KMnO4粉末配制2 mg/mL KMnO4溶液，按照5 mL KMnO4溶液、5 mL 嗎啉乙磺酸緩沖液、2 mL 水的比例混合，連續(xù)超聲30 min。隨后，以10000 r/min 離心，收集沉淀，用水和無水乙醇分別洗滌3 次后，重新分散于水中保存，得到MnO2NFs。

1.2.2 MnO2@Fe3O4 NPs的制備

MnO2@Fe3O4NPs 制備流程如圖1 所示。向50 mL 三口瓶中加入19 mL 水，再加入1 mL 水分散的5 mg MnO2NFs。超聲分散均勻后，將該體系置于室溫下攪拌1 h， 同時持續(xù)向體系中鼓吹N2以除去水中的O2。待除完O2后，向體系中加入200 μL 濃氨水，隨后向體系中分別滴加500 μL 40 mg/mL FeCl3·6H2O溶液和500 μL 15 mg/mL FeCl2·4H2O 溶液。繼續(xù)攪拌5 min 后，以10000 r/min 離心，得到MnO2@Fe3O4NPs，用水和無水乙醇分別洗滌3 次后，重新分散于水中保存。

圖1 MnO2@Fe3O4 納米顆粒（NPs）制備流程及鈍化機制示意圖Fig.1 Schematic illustration of fabrication and passivated mechanism of MnO2@Fe3O4 nanoparticles (NPs)GSH: 谷胱甘肽（Glutathione）

1.2.3 Mn2+釋放實驗

配制濃度為0、50、100、200、300 和400 μmol/L 的GSH 溶液，與100 μg/mL 的MnO2或MnO2@Fe3O4混合后置于37 ℃恒溫搖床中連續(xù)振蕩5 min， 從中均勻取出1 mL 過100 nm 水相濾膜。濾液用水稀釋3 倍，隨后采用ICP-OES 測定樣品中Mn2+濃度。用同樣步驟探究各干擾因子對Mn2+釋放的影響，其中，蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、色氨酸、半胱氨酸、賴氨酸、組氨酸和GSH 的濃度設置為400 μmol/L， NaCl和KCl 的濃度設置為4000 μmol/L。所有處理組別均平行設置3 組實驗。

1.2.4 MRI測定GSH濃度

配制1%瓊脂糖懸液，在100 ℃下加熱攪拌至澄清透亮狀態(tài)。同時，配制不同濃度的GSH 溶液，取1 mL GSH 溶液與1 mL 100 μg/mL MnO2或MnO2@Fe3O4混合，5 min 后，從上述體系中移取100 μL 混合液加入200 μL 離心管中，加入100 μL 瓊脂糖水溶液并吹打均勻，等待樣品冷卻凝固即可。隨后，使用9.4 T/400 mm 寬孔徑MR 成像儀在多回波自旋回波序列下（TR=6000 ms， TE=5.6 ms， 層厚為1 mm）測定樣品的縱向弛豫時間T1。所有處理組別均平行設置3 組實驗。

2 結果與討論

2.1 MnO2 NFs和MnO2@Fe3O4 NPs的形貌、組分與結構表征

利用室溫超聲制備MnO2。由TEM 照片（圖2）可知，該MnO2主要為粒徑約100 nm 的NFs（圖2A），與文獻[24]報道的MnO2NFs 類似。在此材料的基礎上，采用共沉淀法獲得了MnO2@Fe3O4NPs。TEM 照片顯示，MnO2@Fe3O4NPs 表面存在一層清晰的氧化鐵NPs 堆積的外殼（圖2B 和2C），并且這種核殼結構的NPs 的尺寸增長到了約170 nm。DLS 結果表明，經過氧化鐵沉積后，NPs 的水合粒徑從213 nm 增加到了323 nm，表明MnO2NFs 表面成功地包覆了Fe3O4NPs（圖2F）。ICP-OES 結果表明，MnO2@Fe3O4NPs中Mn 元素和Fe 元素的摩爾比約為1∶1，表明MnO2NFs 表面沉積了大量的Fe3O4。

圖2 （A）MnO2 納米花（MnO2 NFs）的透射電鏡（TEM）照片；（B）MnO2@Fe3O4 NPs 的TEM 照片（插圖為未經GSH 處理的MnO2@Fe3O4 NPs 照片）；（C）MnO2@Fe3O4 NPs 的TEM 放大圖；（D）GSH 處理的MnO2 的TEM 照片；（E）GSH 處理的MnO2@Fe3O4 NPs 的TEM 照片（插圖為GSH 處理的MnO2@Fe3O4 NPs 的TEM 照片）；（F）MnO2@Fe3O4 納米顆粒的水合粒徑圖Fig.2 Field emission transmission electron microscope(TEM)images of(A)MnO2 nanoflowers(NFs),(B)MnO2@Fe3O4 NPs(Inset:digital photograph of MnO2@Fe3O4 NPs without treatment by GSH),(C)Enlarged picture of Fig.2B, GSH-treated (D) MnO2 and (E) MnO2@Fe3O4(Inset: digital photograph of MnO2@Fe3O4 NPs with treatment of GSH); (F) The corresponding dynamic light scattering (DLS) profile

采用XRD 以及XPS 表征了材料沉積氧化鐵前后的晶體結構和元素價態(tài)。如圖3A 所示，MnO2的XRD 譜圖的特征峰與δ-MnO2的標準卡片（PDF#80-1098）能較好地吻合，其中，12.5°、25.1°、37.3°和67.9°的衍射峰分別對應于（001）、（002）、（-111）和（114）晶面。經過氧化鐵沉積后，材料的XRD 譜圖中出現(xiàn)了明顯的Fe3O4譜圖（PDF#76-1849），其中，18.3°和35.4°分別對應于（111）和（311）晶面，也說明了氧化鐵層的存在。XPS 結果表明，MnO2NFs 主要含有Mn、O 和C 3 種主要元素，分別來自MnO2和MES 兩種組分，而MnO2@Fe3O4NPs 中主要含有Mn、Fe、O、C 和N 5 種元素，表明沉積后Fe3O4和PVP 的存在（圖3B 和3D）。Mn 2p 和Fe 2p 兩個高分辨XPS 譜圖被用于分析沉積前后元素的價態(tài)變化。如圖3C 和3E 所示，MnO2NFs 位于642.08 和653.7 eV 的結合能分別對應Mn 2p3/2和Mn 2p1/2軌道，并且沉積前后Mn 元素的價態(tài)并未發(fā)生明顯的變化。除此之外，圖3F 的結合能特征峰（710.8 和724.2 eV）分別對應于Fe 2p3/2和2p1/2軌道，進一步證明了氧化鐵層的存在。

圖3 （A）MnO2 NFs 和MnO2@Fe3O4 NPs 的X 射線衍射（XRD）譜圖；（B）MnO2 NFs 的X 射線光電子能譜（XPS）全譜；（C）MnO2 NFs 的Mn 2p 高分辨譜圖;（D）MnO2@Fe3O4 NPs 的XPS 全譜；MnO2@Fe3O4 NPs的（E）Mn 2p 高分辨譜圖和（F）Fe 2p 高分辨譜圖Fig.3 (A) X-ray diffraction (XRD) patterns of MnO2 NFs and MnO2@Fe3O4 NPs; (B) Full X-ray photoelectron spectra(XPS)of MnO2 NFs;(C)High-resolution XPS spectrum of Mn 2p of MnO2 NFs;(D)Full XPS spectrum of MnO2@Fe3O4 NPs; (E) High-resolution XPS spectrum of Mn 2p of MnO2@Fe3O4 NPs; (F) High-resolution XPS spectrum of Fe 2p of MnO2@Fe3O4 NPs

2.2 MnO2@Fe3O4 NPs與GSH的反應鈍化評估

由于Mn 基磁共振納米探針的造影作用主要是通過釋放大量順磁性的Mn2+實現(xiàn)的，因此推測氧化鐵層有助于實現(xiàn)Mn2+的平緩釋放，進而提高MRI 檢測GSH 的靈敏度。為了驗證氧化鐵沉積層對于材料響應GSH 釋放Mn2+的鈍化作用，利用ICP-OES 考察了不同濃度GSH 處理下的Mn2+釋放。如圖4A 所示，MnO2NFs 和MnO2@Fe3O4NPs 均展現(xiàn)了GSH 的濃度依賴的Mn2+釋放特征。此外，在等濃度的GSH 處理下，MnO2@Fe3O4NPs 釋放的Mn2+總是低于MnO2NFs，表明氧化鐵層可有效地減緩Mn2+釋放，這可能是由于致密的氧化鐵層對GSH 產生的空間位阻效應所致。

圖4 （A）MnO2 NFs 和MnO2@Fe3O4 NPs 的Mn2+釋放行為；（B）MnO2@Fe3O4 NPs 用于GSH 檢測的抗干擾性能評估Fig.4 (A) Mn2+ release behavior of MnO2 NFs and MnO2@Fe3O4 NPs; (B) Anti-interfere performance of MnO2@Fe3O4 NPs for detection of GSH

為了評估納米探針對于GSH 的選擇性和抗干擾性能，分別探究了多種常見氨基酸和無機鹽等干擾因子對于Mn2+釋放的影響。實驗結果表明，蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、色氨酸、賴氨酸、組氨酸、NaCl 和KCl 幾乎不會引起Mn2+的非選擇性釋放（圖4B）。盡管本實驗中等濃度的半胱氨酸導致了一定程度的Mn2+釋放，但在實際生物體內半胱氨酸含量遠低于GSH[25-26]?？傊?，此納米探針可實現(xiàn)對GSH 的選擇性檢測，沒有明顯的外界因素干擾。

隨后，將這兩種NPs 與等濃度的GSH 共孵育，同時利用TEM 和DLS 觀察材料處理前后的形貌和尺寸的變化。如圖2D 和2F 所示，經GSH 處理后，MnO2NFs 的結構幾乎完全坍塌，尺寸也發(fā)生驟減（57 nm）。然而，MnO2@Fe3O4NPs 仍保持了一定的NFs 結構以及更大的尺寸（148 nm）。上述結果表明，在氧化鐵殼層保護下，MnO2NFs 與GSH 的反應可被減緩。

2.3 GSH的MRI檢測

為了驗證MnO2@Fe3O4NPs 提高GSH 檢測靈敏度的能力，利用9.4 T 磁共振成像儀測定了經不同濃度GSH 處理后材料的T1信號。從兩種材料的T1-map 偽彩圖像可知，隨著GSH 濃度提高，MnO2NFs 和MnO2@Fe3O4NPs 均可有效地縮短氫質子的縱向弛豫時間（圖5A）。經過等濃度GSH 處理后，相比于MnO2NFs，MnO2@Fe3O4NPs 可穩(wěn)定平緩地縮短T1信號，可能是因為Mn2+釋放減緩導致弛豫增強過程變得更加穩(wěn)定。T1的倒數(shù)（1/T1）表示的是氫質子的弛豫速率，通過擬合GSH 濃度與1/T1發(fā)現(xiàn)，上述兩個參數(shù)在檢測區(qū)間內呈現(xiàn)較好的線性關系（圖5B），MnO2@Fe3O4NPs 對GSH 的檢出限（LOD，3σ/k）為24.3 μmol/L， 顯著低于MnO2NFs 對GSH 的檢出限（70.3 μmol/L）。與文獻報道的GSH 檢測方法相比[27-29]，本研究構建的MnO2@ Fe3O4NPs 具有相當?shù)偷臋z出限（表1）。

表1 不同GSH檢測方法的線性范圍與檢出限Table 1 Linear ranges and limits of detection (LODs) of different methods for detection of GSH

圖5 （A）MnO2 NFs 和MnO2@Fe3O4 NPs 的T1-map 偽彩圖像；（B）1/T1 與GSH 濃度的線性關系Fig.5 (A) Pseudo-color T1-map images of MnO2 NFs and MnO2@Fe3O4 NPs; (B) Corresponding linear relationship between 1/T1 and concentration of GSH

3 結論

通過表面沉積的方法構建了一種核殼結構的MnO2@Fe3O4NPs，用于提高GSH 的MRI 檢測靈敏度。通過對比MnO2NFs 和MnO2@Fe3O4NPs 的形貌尺寸變化以及Mn2+釋放行為發(fā)現(xiàn)，MnO2@Fe3O4NPs 可通過致密的氧化鐵層介導的空間位阻效應有效鈍化MnO2與GSH 的反應。基于MnO2@Fe3O4NPs 的MRI對GSH 的檢測具有更低的檢出限。本研究為MRI 技術應用于分析檢測提供了借鑒和參考。