曾祥杰，王潤雨，羅星月，武靈芝，翁麗星

(南京郵電大學(xué)地理與生物信息學(xué)院，江蘇 南京 210023)

作為一種高精度的單分子檢測技術(shù)，納米孔越來越廣泛地應(yīng)用于基因測序和生物傳感領(lǐng)域，具有無需標(biāo)記和擴增、低成本、高靈敏和高通量等優(yōu)勢，可以識別不同生物分子，如核酸、蛋白質(zhì)以及病毒、納米顆粒等[1-4]。 納米孔檢測方法簡單，一般情況下，納米孔傳感器是將具有納米孔結(jié)構(gòu)的薄膜置于電解質(zhì)溶液中，當(dāng)在溶液中施加不同的偏置電壓，溶液中的離子通過納米孔定向運動，產(chǎn)生一定的離子電流。 當(dāng)檢測分子進(jìn)入納米孔，會引起離子電流的波動。 如在適當(dāng)實驗條件下(如孔的大小，離子強度和所加的電勢差)，單個生物分子在孔內(nèi)取代了足夠體積的電解質(zhì)溶液，引起可測量的脈沖電流波動，能夠被高增益放大器記錄下來[5-6]。 這些電流變化的強度，時間，頻率以及波形能夠提供生物分子在溶液中體積、濃度、表面電荷以及動態(tài)構(gòu)象變化等信息，因此對納米孔中分子易位引起的脈沖信號的識別與信息提取十分關(guān)鍵[7-10]。

目前納米孔電信號的處理軟件較少，一般僅適用于與之匹配的儀器，信息的讀取和輸出受到限制。特別是隨著目前納米孔傳感器檢測范圍不斷擴大，不同分子易位引起的信號變化更加多樣和復(fù)雜，而商業(yè)化軟件功能單一，適用范圍有限，對于背景噪音大，多變信號的判定和處理都存在困難，多需要手動判斷與剔除干擾信號，不能適應(yīng)目前納米孔傳感器的快速發(fā)展。 為了高效地處理納米孔大數(shù)據(jù)，擴大納米孔的應(yīng)用范圍，很多研究小組都嘗試研發(fā)納米孔微弱電信號的信息提取方法。 如Dekker 小組[11-14]研究了納米孔離子電流的背景噪音和漂移問題，提出一種局域閾值的迭代運算，使基線電流的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)差收斂，更好地確定基線電流。 同時Kim 組[10，15]通過算術(shù)平均、線性擬合、高斯平滑和回歸混合等擬合方法處理納米孔電流的階梯變化和陡變，進(jìn)行基線的精準(zhǔn)擬合，進(jìn)一步提取分子過孔事件。 這些工作改善了傳統(tǒng)方法通過平均整個電流軌跡來確定開孔電流基線的限制，提高了納米孔信號識別的精度。 針對納米孔信號噪音濾波帶來的信息丟失，Pedone 等[16]提出了一種改進(jìn)的脈沖信號寬度和高度評估方法，很好地部分補償了脈沖濾波所造成的誤差。 同時Long 組也提出了隱馬爾可夫模型和二階差分的方法來處理納米孔信號的噪音和濾波問題[17-18]，在一定程度上平衡了信號去噪與失真的問題，但是缺乏普適性。 目前機器學(xué)習(xí)在納米孔信號處理中的應(yīng)用也越來越多，如Zhang 等[8，19-20]基于深度學(xué)習(xí)的雙路徑網(wǎng)絡(luò)通過訓(xùn)練可以更準(zhǔn)確地獲取數(shù)據(jù)信息，甚至在脈沖電流信噪比為1 時也適用。 機器學(xué)習(xí)具有強大的信號處理前景，不過機器學(xué)習(xí)算法的適用性受到訓(xùn)練數(shù)據(jù)集可訪問性的限制，同時對用戶操作有一定要求。

因此，為了高效準(zhǔn)確地處理納米孔信號，基于自主搭建的納米孔傳感平臺，設(shè)計了一款適應(yīng)性強且高通量的納米孔數(shù)據(jù)處理可視化軟件，可將生物傳感器采集的微弱生物電信號數(shù)據(jù)進(jìn)行多標(biāo)準(zhǔn)、大批量的信息提取。 該軟件主要基于MATLAB 設(shè)計了自適應(yīng)的傳感器電信號的分子特征事件識別和信息提取程序，通過設(shè)置信號移動窗口范圍及雙閾值判定標(biāo)準(zhǔn)，對選取的數(shù)據(jù)段進(jìn)行脈沖信號的識別，同時對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和校正，排除背景噪音等干擾。 一旦納米孔傳感器脈沖信號確定，該軟件進(jìn)一步將特征事件的滯留時間、信號脈沖幅度以及峰位面積等參量進(jìn)行提取并保存輸出，便于特征事件各個參量的統(tǒng)計分析，有利于全面地揭示分子過孔的動力學(xué)過程。

1 納米孔傳感器脈沖信號識別程序

如圖1 所示，該程序基于MATLAB 設(shè)計，運行主程序，加載數(shù)據(jù)，設(shè)置參數(shù)，進(jìn)行脈沖信號的信息識別。 程序分為分子事件判定，分子事件校正以及信息提取和結(jié)果展示三個模塊。 該程序的設(shè)定參數(shù)主要有移動窗口寬度和雙閾值的設(shè)定。 首先基線檢測主要是通過局域窗口設(shè)定來進(jìn)行的，根據(jù)基線的穩(wěn)定性來設(shè)定移動窗口的寬度。 閾值的設(shè)定是在檢測范圍內(nèi)捕獲更多有效的分子過孔事件，主要通過分析窗口內(nèi)基線電流和信號噪聲水平來設(shè)定。 通過對移動窗口內(nèi)閾值的初步設(shè)定，再借助上升時間和差分函數(shù)方法擬合校正，更好地確定一個分子過孔事件的起始點，從而確定脈沖信號事件。 一旦脈沖信號被判定為納米孔分子特征事件，該方法進(jìn)一步將特征事件的滯留時間、信號幅度，峰位面積等參量進(jìn)行提取并輸出。 該方法具有自適應(yīng)性，多標(biāo)準(zhǔn)對脈沖信號進(jìn)行判定和校正，保證了信息提取的準(zhǔn)確可靠。 同時通過對特征信號的滯留時間、幅值以及信號面積等多參量進(jìn)行提取分析，多維直觀地建立納米孔脈沖信號的信息圖譜。 該方法精度高，數(shù)據(jù)為批量化處理，實現(xiàn)了對納米孔傳感器大數(shù)據(jù)的高通量分析，節(jié)約了時間成本，有助于納米孔傳感器的廣泛應(yīng)用。

圖1 納米孔傳感器分子脈沖信號識別的程序設(shè)計

該程序的界面如圖2 所示。 基于MATLAB 可視化的操作界面，采用窗口移動對局域數(shù)據(jù)的閾值進(jìn)行精準(zhǔn)設(shè)定，對納米孔檢測電流的脈沖信號進(jìn)行識別和信息提取分析。 首先在Data list 模塊對文本數(shù)據(jù)進(jìn)行加載，具有很好的兼容性。 然后在Event detection 模塊進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，該過程主要包括閾值設(shè)定和數(shù)據(jù)校正。 閾值的設(shè)定是在檢測范圍內(nèi)捕獲更多有效的分子過孔事件，主要通過分析窗口內(nèi)基線電流和信號噪聲水平來設(shè)定，排除過大或者過小的異常信號干擾，提高了信號識別的精度。 同時對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合和校正，排除背景噪音等干擾。 接下來在Result 模塊進(jìn)行信息提取和結(jié)果展示等。 當(dāng)納米孔傳感器的電流脈沖信號確定，可以進(jìn)一步將特征事件的滯留時間、信號脈沖幅度以及峰位面積等參量提取和輸出，便于進(jìn)一步分析。 同時該軟件還可以進(jìn)行數(shù)據(jù)坐標(biāo)軸的調(diào)整，可視化地展示分子事件特征信息和統(tǒng)計分析圖譜。

圖2 納米孔電信號識別主程序界面

1.1 分子事件判定

當(dāng)施加一定的偏置電壓，納米孔傳感器獲得平穩(wěn)的離子電流，一旦有檢測分子，電信號會發(fā)生阻塞，形成一個個脈沖信號。 每個脈沖信號代表了納米孔內(nèi)分子通過時引起的電流變化，稱為一個分子易位事件。 通過脈沖信號的幅值、時間等信息可以推斷出檢測分子的種類，物理化學(xué)性質(zhì)等。 將納米孔看成是一個電學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的元器件，判斷分子事件的基本原理就是觀察變化的電流信號相對于基線電流的波動幅度。 但由于脈沖信號的速度極快，其采樣頻率為100 kHz 以上，長時檢測中，基線電流可能會有增加或減少的變化，但在較短的一段時間內(nèi)基線電流是一個十分穩(wěn)定的值，稱為一個局域信號窗口。 可以把長時間記錄的電流信號段分成一個個窗口，整個信號數(shù)據(jù)段在分析窗口的移動下進(jìn)行事件的檢測與分析，具有較高的自主適應(yīng)性，提高了分析效率和準(zhǔn)確性。

1.2 分子事件的校正

通過實驗采集到的納米孔電信號一般湮沒在強噪音背景中，信噪比較差，所以需要對信號數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步校正。 為了更好地使用數(shù)學(xué)函數(shù)進(jìn)行分析，需要先一步對原始的納米孔電信號數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑擬合，以便于后續(xù)的校正過程。 本程序主要利用MATLAB 軟件中的傅里葉級數(shù)擬合函數(shù)，對不同長度的信號數(shù)據(jù)進(jìn)行傅里葉級數(shù)擬合，將上下波動的原始事件信號數(shù)據(jù)擬合成平滑的信號數(shù)據(jù)，相當(dāng)于低通濾波器的作用，使信號數(shù)據(jù)變得平滑，排除噪聲干擾，便于信號分析。 擬合后得到的信號數(shù)據(jù)，通過上升時間和二階差分等校正函數(shù)進(jìn)行校正分析，進(jìn)一步消除了背景干擾，提高了信息識別的高效性和準(zhǔn)確性。

1.3 脈沖信號特征信息提取

目前通用的納米孔信號特征通常包括滯留時間與信號幅值(相對于基線電流的幅值，可以看作由于過孔引起的離子電流變化量)，其意義在于分子種類不同，其在納米孔中的體積排阻效應(yīng)和動力學(xué)過程均不同，通過對大量的分子事件的電信號進(jìn)行統(tǒng)計分析，就能夠總結(jié)出每種分子過孔時的電信號特征。 為了豐富地刻畫分子獨特的形貌和表面荷電特性以及在微納限域空間的運動動力學(xué)過程，除了事件信號滯留時間與離子電流變化幅值，該程序設(shè)計了多個信號指標(biāo)進(jìn)行比對分析，進(jìn)一步豐富了分子過孔的動力學(xué)信息。 一旦納米孔傳感器的電流脈沖信號確定，該方法將特征事件的滯留時間、信號脈沖幅度以及整個事件的信號積分面積等參量進(jìn)行提取并進(jìn)行保存輸出，并提供分子事件特征信息的統(tǒng)計和圖譜分析。 如離子電流變化峰值對辨識分子種類有一定的對比作用，同時也可以評估外界環(huán)境或納米孔的穩(wěn)定性；分子事件峰位面積相當(dāng)于離子電流變化量與事件信號持續(xù)時間的乘積，可以對事件進(jìn)行分級，有助于更精準(zhǔn)地判斷分子種類，更深層次地分析檢測分子形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化。

2 金納米顆粒信號分析

2.1 金納米顆粒過孔信號檢測

隨著納米孔技術(shù)的發(fā)展，除了DNA 測序，納米孔作為一種單分子傳感器，廣泛用于蛋白質(zhì)、糖類，脂類以及病毒顆粒等的檢測。 這些不同大小、形貌結(jié)構(gòu)的檢測對象使納米孔傳感信號更加復(fù)雜多樣。其中金納米棒就是一個典型的各向異性的納米結(jié)構(gòu)。 通過化學(xué)合成，金納米棒具有可控的長徑比，其結(jié)構(gòu)形貌類比纖維狀蛋白和桿狀的病毒顆粒，為不同形貌生物分子的識別提供了理論參考。 通過MATLAB 設(shè)計的納米孔傳感器脈沖信號識別程序，以金納米棒為例進(jìn)行納米孔的信號分析。 類比DNA 的線性結(jié)構(gòu)，金納米棒是一種各向異性的納米顆粒，具有可控的尺寸結(jié)構(gòu)，憑借優(yōu)良的光電特性在生物檢測、細(xì)胞成像等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。 如圖3 所示，以金納米棒為模型，進(jìn)行納米孔檢測，對生物醫(yī)學(xué)中不同形貌的蛋白質(zhì)、病毒等生物顆粒的檢測都具有重要的借鑒意義。

圖3 金納米棒在納米孔中信號檢測

圖3(a)為固態(tài)納米孔傳感器檢測金納米棒的原理示意圖，納米孔直徑約為(60±3)nm，絕緣的氮化硅膜片會把檢測的電解質(zhì)溶液分成cis 側(cè)和trans側(cè)兩部分。 圖3(b)為研究中使用的金納米棒，通過種子生長法制備，表面覆蓋十六烷基三甲基溴化銨離子層，帶正電，直徑約22±2 nm，長度約50±2 nm，長徑比約為2.5，在溶液中具有良好的分散性。 當(dāng)施加偏置電壓時，電解質(zhì)溶液中的離子在納米孔道內(nèi)定向運動形成基線電流。 當(dāng)金納米棒在電場力驅(qū)動下進(jìn)入到納米孔道時部分阻斷離子通道，改變了通道內(nèi)的總體離子濃度，從而產(chǎn)生了可識別的電流脈沖信號軌跡圖。 圖3(c)為MATLAB 軟件用于納米孔信號分析界面。 通過窗口內(nèi)進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，可以實現(xiàn)對金納米棒易位信號的多維度分析圖譜。

2.2 納米孔信號分析

當(dāng)溶液中加入金納米棒后，記錄的離子電流軌跡圖中出現(xiàn)了尖刺狀的脈沖電流信號。 通過程序?qū)Σ煌妷?400 mV，600 mV，900 mV)下檢測到的脈沖電流信號進(jìn)行統(tǒng)計分析，對識別的過孔事件進(jìn)行脈沖幅值(Amplitude)和滯留時間(dwell time)的直方統(tǒng)計圖，見圖4。

圖4 金納米棒在納米孔傳感器中不同電壓下的電流信號統(tǒng)計圖

圖4(a)從上到下為400 mV、600 mV、900 mV對脈沖信號幅值統(tǒng)計分布直方圖，通過高斯擬合可以看出，電壓在400 mV、600 mV、900 mV 時，幅值峰值分別(151±3)pA，(208±4)pA，(289±6)pA，脈沖幅值隨電壓的增大而增大，符合歐姆定律。 圖4(b)為脈沖電流信號的滯留時間統(tǒng)計分布直方圖，其峰值別為(1.44±0.047)ms，(1.28±0.027)ms，(1.61±0.150)ms，有趣的是在900 mV 下金納米棒易位信號的滯留時間相對于600 mV 下信號的滯留時間反而增加。 脈沖信號的滯留時間反映了金納米棒在納米孔道內(nèi)的易位速度。 理論上在電壓900 mV下納米孔通道內(nèi)的電場強度要高于600 mV 時的電場強度，更快地驅(qū)動納米顆粒過孔，但實際實驗中金納米棒在孔內(nèi)的過孔速度減慢，從而引起滯留時間增加。同時在圖4(c)中看出，不同電壓下納米孔事件信號的散點圖在不同電壓下，也發(fā)生變化。 在900 mV下，顆粒過孔事件的散點分布具有更寬的滯留時間和幅值范圍，這表明在高壓下隨著納米孔易位事件的增多，金納米棒過孔的動力學(xué)過程具有復(fù)雜性和多樣性。

納米孔傳感信號的主要信息包含在脈沖信號的幅值和滯留時間中，通過幅值的變化，可以更好地反映過孔顆粒的大小形貌等特征，而滯留時間也和顆粒的表面電荷等緊密相關(guān)[1，6，8]。 像λ-DNA 線性結(jié)構(gòu)過孔時，同時伴有折疊和局域折疊等構(gòu)象，每個分子事件具有不一樣的脈沖電流幅值和滯留時間，但是這些事件的電流時間積分(Event Charge Deficit，ECD)，即都符合一個常數(shù)[1，21]，即不管λ-DNA 以何種構(gòu)象通過納米孔，只要單個分子長度是一樣的，其阻塞電流事件阻塞部分的面積應(yīng)該為一個常數(shù)。

圖5(a)中展示了金納米棒在不同電壓下通過納米孔時的ECD 統(tǒng)計分布圖。 在電壓為400 mV、600 mV、900 mV 時，ECD 統(tǒng)計的主峰位都是在250附近，表明大多數(shù)納米棒在電場驅(qū)動下，以相同或相近的形式順利過孔。 但在900 mV 時，ECD 的直方統(tǒng)計圖在主峰位外，在ECD ＝400 處還有一個小的肩峰，因此金納米棒的過孔過程還存在不同相位形式。 通過研究發(fā)現(xiàn)，由于金納米棒表面帶正電，同時具有各向異性結(jié)構(gòu)，進(jìn)入納米孔口時，多數(shù)金納米棒沿電場線方向，以平行于納米孔中心軸的相位快速通過納米孔道，見圖5(b)。 但當(dāng)高壓下，金納米棒在快速進(jìn)入納米孔時，會出現(xiàn)以多種相位形式進(jìn)入納米孔，與納米孔表面發(fā)生吸附碰撞，同時由于金納米棒的相位與電場方向不一致，需要相位調(diào)整，將會明顯比平行相位進(jìn)入納米孔道受到的阻力大的多，易位速度減慢，因此在納米孔道內(nèi)將會有較長的滯留時間，見圖5(c)，這也與金納米棒在高壓下過孔時滯留時間反而延長結(jié)果一致。 因此通過MATLAB程序?qū)π盘栠M(jìn)行多方位分析，可以更好地揭示金納米棒各向異性的易位現(xiàn)象，對納米孔用于各種具有矢量特征的蛋白質(zhì)、病毒顆粒等的檢測提供了理論依據(jù)和技術(shù)支持，具有十分重要的診療意義。

圖5 金納米棒通過納米孔

3 總結(jié)

納米孔分子器件憑借獨特的電導(dǎo)脈沖原理，在DNA 測序以及生物分子傳感領(lǐng)域具有明顯優(yōu)勢，還將為DNA 數(shù)據(jù)存儲和信息讀取等領(lǐng)域帶來新的技術(shù)革命。 不過目前實際應(yīng)用中，納米孔傳感電信號的識別和處理仍然存在限制，如電信號會受到非理想器件噪聲以及易位多樣性引起的時空分辨率不足等挑戰(zhàn)，且很多納米孔測序數(shù)據(jù)的分析開發(fā)仍比較少，缺少高效的計算方法和分析工具。 因此建立準(zhǔn)確科學(xué)的納米孔信號的分析方法和技術(shù)對納米孔傳感器的發(fā)展至關(guān)重要。 在前期研究的基礎(chǔ)上，本研究設(shè)計開發(fā)了納米孔傳感器電流脈沖信號的識別和信息提取程序，多方位實現(xiàn)了對檢測到的納米顆粒易位事件引起的特征信號的信息識別、統(tǒng)計分析等功能，有利于納米孔在基因組學(xué)、病毒等領(lǐng)域的高靈敏檢測，推動精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展。